本发明公开了一种同时检测辣椒三种RNA病毒的多重RT-PCR引物组,引物对TMGMV-F和TMGMV-R为检测烟草轻型绿花叶病毒的引物,引物对CFEV1-F和CFEV1-R为检测小米椒内源RNA病毒1的引物,引物对PCV2-F和PCV2-R为检测辣椒潜隐病毒2的引物;本发明还公开了使用该多重RT-PCR引物组检测辣椒三种RNA病毒的方法,通过一次RT-PCR反应来检测植株是否感染上述三种病毒。本发明用三重RT-PCR检测三种辣椒病毒即烟草轻型绿花叶病毒、小米椒内源RNA病毒1和辣椒潜隐病毒2,与目前单重RT-PCR和双重RT-PCR检测方法相比,用一次RT-PCR反应可检测三种病毒,检测的病毒种类增多,检测效率进一步提高,检测的成本显著降低。