一种反转录多重套式pcr检测引物
技术领域
本发明属于基因型检测
技术领域
，涉及一种反转录多重套式PCR检测引物。背景技术
对虾是世界公认的高品质水产品，为我国创造了可观的经济效益，同时也是国民优质的食物蛋白源。对虾黄头病是由黄头病毒(Yellow head virus,YHV)引起的传染性疾病，一般影响养殖50天～70天的对虾，感染后3～5天发病率高达100％，死亡率达80％～90％。感染的病虾有一个食量大增然后突然停止的过程，一般在2天～4天出现停食、头胸部发黄和全身发白，肝胰腺变软并由褐色变成黄色。许多濒死虾聚集在池塘角落水面，在短期内大量死亡。
黄头病毒属于套式病毒目、杆套病毒科、头甲病毒属，目前已知有10个基因型，其中YHV-1和YHV-8是经证实导致对虾发病的致病基因型，另外8个基因型(2型～7型、9型、10型)，极少或从不引起疾病，且尚未有在我国养殖对虾中流行的报道。因此，在对虾养殖业实际的疫病监测和流行病学调查中，灵敏地检测和鉴定黄头病毒致病基因型YHV-1和YHV-8对于疫病防控以及病原学研究具有重要的意义。
目前，已报道YHV的PCR检测方法：针对YHV-1的反转录PCR方法(Wongteerasupayaet al.1997)，针对YHV-1和YHV-2的反转录多重套式PCR方法(Cowley et al.2004)，针对IHHNV、WSSV、YHV和TSV的反转录多重PCR方法(乌日琴等，2011)以及一种同时检测对虾IMNV、YHV和TSV的多重PCR检测引物及试剂盒(CN105567875A)。上述4种方法主要针对黄头病毒的致病基因型YHV-1，在YHV-8基因组上无与上述4种PCR引物完全结合的靶序列，因此对YHV-8基因型的检测灵敏度不够，检出率偏低。同时，因为引物设计的局限，上述方法都无法实现对YHV-1和YHV-8的鉴别。同样，已有的基于等温扩增和基因芯片技术的YHV检测方法也存在上述问题，即对YHV-8的检出率偏低，无法对两个基因型进行鉴别。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)现有的检测方法建立时间较早，引物是针对早期发现的黄头病毒致病基因型YHV-1，不能满足对新的致病基因型YHV-8的高灵敏度检测。
(2)现有的检测方法无法实现对黄头病毒致病基因型YHV-1和YHV-8的鉴别。
解决以上问题及缺陷的难度为：需根据目前已知的黄头病毒基因型YHV-1和YHV-8的基因序列，重新设计特殊的引物组合，并对反应的体系以及反应的程序进行优化，满足对两种致病基因型高灵敏度的一步反转录多重套式PCR检测，同时通过扩增产生的产物分子量大小来实现对两种基因型的快速鉴别。
解决以上问题及缺陷的意义为：用一种反转录多重套式PCR引物，同时实现对已知黄头病毒致病基因型YHV-1和YHV-8的高灵敏度检测，通过反应的产物分子量大小快速鉴别样品感染的基因型，为养殖业中疫病的防控和病原学研究提供了技术保障。该鉴定方法不仅准确，而且降低了反应的成本和反应时间。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种反转录多重套式PCR检测引物。该引物可灵敏的检测黄头病毒的致病基因型YHV-1和YHV-8，并可以通过产物大小快速鉴别两种基因型，为该病毒的临床检测和流行病学研究提供了简便、可靠的技术支持。该方法不仅结果准确，而且节省了时间和反应成本。
为解决上述技术问题，本发明公开了一种鉴别对虾黄头病毒基因型的反转录多重套式PCR检测引物，所述鉴别对虾黄头病毒基因型的反转录多重套式PCR检测引物包括两条外引物(736F、736R)和三条内引物(307F、194F、307/194R)，其中外引物可以扩增YHV-1和YHV-8，均产生763bp的目的条带；三条内引物搭配分别特异性的扩增YHV-1和YHV-8，分别产生307bp和194bp的目的条带，YHV-1和YHV-8的靶序列如图2所示。
外引物736F的序列为：SEQ ID NO：1；外引物736R的序列为：SEQ ID NO：2；
内引物307F的序列为：SEQ ID NO：3；内引物194F的序列为：SEQ ID NO：4；内引物307/194R的序列为：SEQ ID NO：5。
进一步，可高灵敏的检测黄头病毒的致病基因型YHV-1和YHV-8。
进一步，YHV-8包括其新的种名Okavirus 1及其缩写OKV1所指代的病毒。
进一步，引物是包含该套引物的1条或多条及其所覆盖的序列，用于YHV-1和YHV-8的鉴别、检测、监测的反转录多重套式PCR试剂及试剂盒。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：YHV已报道有10个基因型，只有YHV-1和YHV-8两个基因型可以引起对虾发病，且其余8个基因型未在我国报道流行。为同时检测YHV-1和YHV-8两种致病型黄头病毒，同时通过反应产物大小快速鉴别样品中所感染的病毒基因型，本发明建立了一种反转录多重套式PCR检测引物。通过对YHV-1和YHV-8的基因组序列进行比对，共设计了两条外引物和三条内引物。其中外引物可以扩增YHV-1和YHV-8的目的基因，均产生763bp的目的条带。三条内引物搭配可分别特异性的扩增YHV-1和YHV-8，产生307bp和194bp的目的条带。通过对反应程序的优化，确定了两步PCR反应的最适退火温度。特异性测试表明，此方法可准确检测YHV-1和YHV-8的RNA，产生目的条带，不与白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)、致急性肝胰腺坏死的弧菌(VAHPND)、桃拉综合征病毒(TSV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)、传染性肌坏死病毒(IMNV)、健康对虾的RNA模板发生非特异反应。灵敏度测试结果显示，此方法对YHV-1和YHV-8RNA的检测下限均达到了1.2×101拷贝。以上结果表明，本发明建立的多重套式PCR检测引物可检测黄头病毒的致病基因型YHV-1和YHV-8，并可以通过产物大小快速鉴别两种基因型，为该病毒的临床检测和流行病学研究提供了简便、可靠的技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的多重套式PCR检测方法流程图。
图2是本发明实施例提供的YHV-1和YHV-8靶序列比对及引物设计示意图。
图3是本发明实施例提供的多重套式PCR的退火温度优化示意图；A.第一轮PCR产物电泳结果；B.第二轮PCR产物电泳结果；M：Marker；图A：1～8泳道分别为退火温度49、51、53、55、57、59、61和63℃时的反应产物，9泳道为空白对照；图B：1～8泳道分别为退火温度49、51、53、55、57、59、62和65℃时的反应产物，9泳道为空白对照。
图4是本发明实施例提供的灵敏度测试结果示意图；A.第一轮PCR产物电泳结果；B.第二轮PCR产物电泳结果；M：Marker；1～8泳道分别为以1.2×101～1.2×108拷贝/μLYHV-1和YHV-8的RNA标准品为模板的反应产物；9泳道为空白对照。
图5是本发明实施例提供的特异性测试结果示意图；A.以YHV-1的RNA标准品为模板的产物电泳图；B.以YHV-8的RNA标准品为模板的产物电泳图；M：Marker；1～10泳道分别为以YHV-8、YHV-1、阴性对照、WSSV、IHHNV、VAHPND、TSV、MrNV、IMNV的RNA为模板的反应产物。
图6是本发明实施例提供的单一来源的发病样品检测结果示意图：本图展示了第一轮和第二轮PCR的电泳结果；M(第一轮)：2000bp DNA Marker，由DNA片段2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp组成；M(第二轮)：50bp DNA Ladder，由DNA片段500bp、400bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp和50bp组成；1-30：对虾样品；+：阳性对照；-：阴性对照。
图7是本发明实施例提供的混合来源样品基因型鉴定结果示意图；本图仅展示了第二轮PCR的电泳结果；M：50bp DNA Ladder，由DNA片段500bp、400bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp和50bp组成；每个Marker泳道两边分别有各8个泳道的样品反应产物；反应产物条带下方标注数字1和8分别表示为YHV-1和YHV-8阳性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种反转录多重套式PCR检测引物，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明提供的多重套式PCR检测方法包括以下步骤：
S101：样品采集和RNA提取，在实验室对样品进行解剖后，保存于-80℃超低温冰箱；每尾对虾切取约30mg的鳃丝组织，使用动物组织/细胞总RNA提取试剂盒提取样品组织的总RNA；
S102：引物设计，两条外引物和三条内引物；其中外引物可同时扩增YHV-1和YHV-8的目的基因，产生763bp的目的条带。三条内引物搭配可分别特异性的扩增YHV-1和YHV-8，产生307bp和194bp的目的条带；
S103：合成两种黄头病毒基因型目的片段RNA标准品；
S104：采用一轮25μL的反转录PCR和一轮25μL的PCR反应体系。
本发明提供的反转录多重套式PCR检测方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的多重套式PCR检测方法仅仅是一个具体实施例而已。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
实施例1快速鉴别对虾黄头病毒致病基因型的反转录多重套式PCR检测方法的建立：
1材料与方法：
1.1样品采集和RNA提取
发病的中国对虾样品采集自山东省一家对虾养殖场，在实验室对样品进行解剖后，保存于-80℃超低温冰箱。YHV-1感染的虾组织由亚太水产养殖中心网(NACA)提供，保存于乙醇中。
每尾中国对虾切取约30mg的鳃丝组织，使用动物组织/细胞总RNA提取试剂盒(擎科，北京)提取样品组织的总RNA，按照试剂盒说明书步骤进行操作。
1.2引物设计
从美国国家生物信息中心(NCBI)数据库中下载黄头病毒基因型YHV-1和YHV-8的基因组序列(序列号：FJ848673、KX947267)，使用软件Geneious Prime(版本2019.2.1)进行序列比对，并使用软件Oligo(版本7.60)进行引物设计。引物序列、目标株型及产物大小见表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.3两种黄头病毒基因型目的片段RNA标准品的合成
为了获得YHV-1和YHV-8目的片段的RNA标准品，以763F和763R为引物，分别以实验室保存的YHV-1和YHV-8的RNA为模板进行反转录和PCR扩增，得到两种763bp大小的扩增产物。分别将两种763bp的产物连接含有T7启动子序列的pGEM-T载体(Promega)并转化入感受态细胞进行培养。纯化后的质粒使用限制性核酸内切酶Pst I(TaKaRa)酶切成为链状DNA。然后使用T7转录试剂盒(全式金)进行体外转录和DNA降解，再经过RNA纯化试剂盒(全式金)处理后获得纯化的YHV-1和YHV-8目的RNA片段。目的RNA片段使用NanoDrop 2000(Thermo)进行质控和浓度测定，通过10倍梯度稀释分别获得1.2×108～1.2×101拷贝/μLYHV-1和YHV-8的RNA标准品。
1.4多重套式PCR方法反应程序的优化
第一轮PCR为25μL反应体系，包含：1μL YHV-1和YHV-8混合RNA模板，12.5μL 2×1Step Buffer，400nM引物763F和763R，1μL PrimeScript 1Step Enzyme Mix(TaKaRa)，添加RNase Free水至25μL。扩增程序为50℃反转录30min，94℃预变性3min，94℃变性30s，退火温度设置梯度分别为49、51、53、55、57、59、61和63℃各30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸5min。将扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检验结果，选取最适退火温度。
第二轮PCR为25μL反应体系，包含：1μL一轮PCR反应产物模板，2.5μL10×Ex TaqBuffer，2μL dNTP(0.25mmol/L)，2μL Mg2+(2.5mmol/L)，400nM引物307/194R，各200nM引物307F和引物194F，0.625U Ex Taq Enzyme(TaKaRa)，添加PCR级别水至25μL。扩增程序为95℃预变性2min，95℃变性30s，退火温度设置梯度分别为49、51、53、55、57、59、62和65℃各30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸2min。将扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检验结果，选取最适退火温度。
1.5灵敏度测试
使用优化后的反应条件，分别以1.2×101～1.2×108拷贝/μL YHV-1和YHV-8的RNA标准品为模板，RNase-Free水为空白对照，进行多重套式PCR扩增，测试方法的灵敏度。
1.6特异性测试
以YHV-8、YHV-1、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)、致急性肝胰腺坏死的弧菌(VAHPND)、桃拉综合征病毒(TSV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)、传染性肌坏死病毒(IMNV)的RNA为模板、健康对虾的RNA为阴性对照。使用优化好的多重套式PCR方法进行特异性测试。
2结果：
2.1引物设计
通过YHV-1和YHV-8基因组的比对和引物设计，最终获得引物5条，包括2条外引物763F和763R，以及3条内引物307F、194F和307/194R(图2)。其中763F、763R和307/194R三条引物可100％匹配YHV-1和YHV-8，均可扩增出763bp的目的条带。而引物307F和引物194F分别为YHV-1和YHV-8的特异性内引物，分别产生307bp和194bp的目的条带，可通过产物大小来区分样品中感染YHV的株型。
2.2反应程序的优化
经过对两轮PCR反应退火温度的优化，当第一步PCR反应的退火温度为51℃时(图3的A)，电泳显示的产物条带最清晰明亮，因此51℃为最适退火温度；第二轮PCR反应，虽然退火温度为57℃时条带最亮，但考虑第二轮PCR为多重PCR，为保证引物反应的特异性，选择65℃为第二轮PCR反应的退火温度(图3的B)。
2.3灵敏度的测定
多重套式PCR第一轮反应中，当YHV-1和YHV-8的RNA标准品浓度最低为1.2×104拷贝/μL时，仍有肉眼可见条带(图4)；而第二轮反应中，当YHV-1和YHV-8的RNA标准品浓度最低为1.2×101拷贝/μL时，仍有明显条带(图4)。因此，本方法第一轮PCR反应的检测灵敏度为1.2×104拷贝，第二轮PCR反应的检测灵敏度为1.2×101拷贝。
2.4特异性的测定
经过特异性的测试，两轮PCR均只有YHV-1和YHV-8的RNA模板可以扩增出目的条带，其余RNA样品均不能扩增出目的条带(图5)。因此可以证明此多重套式PCR方法具有高度的特异性。
实施例2检测结果例：
使用本发明开发的反转录多重套式PCR方法检测30份从山东日照一家养殖场采集的单一来源的发病中国对虾样品组织。本发明的检测结果如图6所示，从图中可得出，24个样品第一轮PCR扩增后产生大于750bp的目的条带，27个样品第二轮PCR扩增后产生小于200bp的目的条带，3个检测样品经过反转录多重套式PCR检测后无条带，因此本批30个样品有27个为YHV-8阳性，3个为黄头病毒致病基因型阴性。
实施例3鉴定结果例：
使用本发明开发的反转录多重套式PCR方法检测96份实验室保存的感染状态未知的混合来源对虾样品组织。本发明的鉴定结果如图7所示，从图中可得出，67个样品经反转录多重套式PCR扩增后无目的条带，为YHV-1和YHV-8阴性；16个样品扩增后产生大于300bp的目的条带，为YHV-1阳性；13个样品扩增后产生小于200bp的目的条带，为YHV-8阳性。根据反应第二轮条带的大小，快速鉴定了未知感染状态的对虾样品所感染的致病黄头病毒基因型。
表1多重套式PCR引物信息
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120> 一套反转录多重套式PCR检测引物
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taccgataca aggttccccg 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggtaatatt tcttggccca gat 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggtctgcta ccagattcag aca 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaccatgagc tagcgaaaga act 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agtaaactca acccagccat cac 23
