一种检测猪圆环病毒不同型别的三重荧光定量pcr引物组、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物检测
技术领域
，具体涉及一种检测猪圆环病毒不同型别的三重荧光定量PCR引物组、试剂盒及应用。背景技术
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是为环状单链DNA病毒，能在哺乳动物细胞中自主复制。PCV目前已发现4种型别，分别为猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)和猪圆环病毒4型(PCV4)。PCV1是PK15细胞培养过程中发现的病毒，研究认为对猪无致病性；PCV2具有致病性，主要感染家猪和野猪，大多数在4～11周龄时感；2016年首次报道PCV3与心肌炎和肾小球肾炎有关；湖南大学生物学院兽禽病毒学研究组发现一种新型猪圆环病毒(暂定名PCV4)，该病毒发现于具有严重临床症状的猪只中。
目前，对于猪圆环病毒的检测，主要有病毒分离鉴定、琼脂扩散试验、微量血清中和试验、ELISA和PCR方法。而且常规的病原学分离和血清学检测方法，又存在操作繁杂、费时费力、敏感性低等不足，且一次只能检出一种型别，尤其是PCV4属于新发现病毒，对于包括PCV4在内的多种型别的猪圆环病毒检测，并没有相关研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测猪圆环病毒不同型别三重荧光定量PCR引物组、试剂盒及应用，建立了猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪圆环病毒4型三重荧光定量PCR检测体系，具有敏感性好、特异强的优点，可同时对具有致病性或疑似致病性不同型别的猪圆环病毒进行鉴别和检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种检测猪圆环病毒不同型别的三重荧光定量PCR引物组，所述引物组包括分别针对猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪圆环病毒4型的特异性引物对和探针；
针对猪圆环病毒2型的特异性引物对包括PCV2-2020F2和PCV2-2020R1，所述PCV2-2020F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述PCV2-2020R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，对应的探针PCV2-2020probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
针对猪圆环病毒3型的特异性引物对包括PCV3-real-F2和PCV3-real-R2，所述PCV3-real-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述PCV3-real-R2的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，对应的探针PCV3 probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
针对猪圆环病毒4型的特异性引物对包括PCV4-r21-R3和PCV4-r21-F3，所述PCV4-r21-R3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述PCV4-r21-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，对应的探针PCV4 probe3的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
优选的，在所述探针的3’端还修饰有淬灭基团，在所述探针的5’端还修饰有荧光基团。
优选的，所述淬灭基团包括BHQ1；所述荧光基团包括FAM、HEX或Cy5。
优选的，每个所述探针的5’端修饰的荧光基团各不相同。
本发明还提供了一种包含上述引物组的检测猪圆环病毒不同型别的试剂盒。
优选的，针对猪圆环病毒2型的特异性引物对的工作浓度为0.4μM，针对猪圆环病毒3型的特异性引物对的工作浓度为0.4μM，针对猪圆环病毒4型的特异性引物对的工作浓度为0.6μM；
探针PCV2-2020 probe的工作浓度为0.25μM，探针PCV3 probe的工作浓度为0.25μM，探针PCV4 probe3的工作浓度为0.4μM。
本发明还提供了上述引物组或上述试剂盒在猪疫病检测中的应用。
优选的，所述猪疫病检测时，利用上述引物组或上述试剂盒构建反应体系，所述反应体系以20μl计，包括：4×Multiplex PCR Master Mix 5μl，PCV2-2020F2(20μmol/L)0.4μl，PCV2-2020R1(20μmol/L)0.4μl，PCV3-real-F2(20μmol/L)0.4μl，PCV3-real-R2(20μmol/L)0.4μl，PCV4-r21-F3(20μmol/L)0.6μl，PCV4-r21-R3(20μmol/L)0.6μl，PCV2-2020 probe(10μmol/L)0.5μl，PCV3 probe(10μmol/L)0.5μl，PCV4 probe3(10μmol/L)0.8μl，核酸模板4μl和无RNA酶水6.4μl。
优选的，所述猪疫病检测时，基于所述反应体系进行荧光定量PCR，所述荧光定量PCR的反应程序包括：95℃2min；95℃5s，60℃30s，45个循环。
本发明提供了一种检测猪圆环病毒不同型别的三重荧光定量PCR引物组，根据Genbank中猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪圆环病毒4型的保守序列合成引物和探针，同时还构建了试剂盒，并用于猪圆环病毒检测。本发明实施例中，利用建立的荧光定量PCR体系对来自浙江省内83份猪组织样品进行检测，结果显示本发明所述的引物组特异性良好，重复性和稳定性俱佳，与普通单重PCR方法相比，阳性符合率分别为100％、95.82％和94.51％，具有较高的一致性，准确率较高。在本发明中，PCV2、PCV3最低检测值均为10拷贝/μl，而PCV4最低检测值为1拷贝/μl，克服了当前猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪圆环病毒4三重PCR检测方法敏感性低，易污染实验室等缺点。
附图说明
图1为三重荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型特异性试验曲线，图中：1表示PCV2；2～12依次表示PPV、CSFV、PRRSV、PCV1、PRV、FMDV、PEDV、TGEV、PCV3、PCV4和阴性对照；
图2为三重荧光定量PCR检测猪圆环病毒3型特异性试验曲线，图中：10表示PCV3；1～9依次表示PCV2、PPV、CSFV、PRRSV、PCV1、PRV、FMDV、PEDV、TGEV；11～12分别表示PCV4和阴性对照；
图3为三重荧光定量PCR检测猪圆环病毒4型特异性试验曲线，图中：11表示PCV4；1～10依次表示PCV2、PPV、CSFV、PRRSV、PCV1、PRV、FMDV、PEDV、TGEV、PCV3；12表示阴性对照；
图4为三重荧光定量PCR检测PCV2扩增曲线，图中：1～8表示重组质粒终浓度为106～10-1copies/μl，9表示阴性对照；
图5为三重荧光定量PCR检测PCV3扩增曲线，图中：1～8表示重组质粒终浓度为106～10-1copies/μl，9表示阴性对照；
图6为三重荧光定量PCR检测PCV4扩增曲线，图中：1～8表示重组质粒终浓度为106～10-1copies/μl，9表示阴性对照；
图7为猪圆环病毒2型扩增标准曲线；
图8为猪圆环病毒3型扩增标准曲线；
图9为猪圆环病毒4型扩增标准曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种检测猪圆环病毒不同型别的三重荧光定量PCR引物组，所述引物组包括分别针对猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪圆环病毒4型的特异性引物对和探针；
针对猪圆环病毒2型的特异性引物对包括PCV2-2020F2和PCV2-2020R1，所述PCV2-2020F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述PCV2-2020R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，对应的探针PCV2-2020probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
针对猪圆环病毒3型的特异性引物对包括PCV3-real-F2和PCV3-real-R2，所述PCV3-real-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述PCV3-real-R2的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，对应的探针PCV3 probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
针对猪圆环病毒4型的特异性引物对包括PCV4-r21-R3和PCV4-r21-F3，所述PCV4-r21-R3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述PCV4-r21-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，对应的探针PCV4 probe3的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明在所述探针的3’端优选还修饰有淬灭基团，在所述探针的5’端优选还修饰有荧光基团。本发明所述淬灭基团优选包括BHQ1；所述荧光基团优选包括FAM、HEX或Cy5，且每条探针上修饰的荧光基团各不相同。
在本发明实施例中，三重荧光定量PCR所用的引物对和探针序列如表1所示：
表1三重荧光定量PCR所用的引物对和探针序列
在本发明中，优选根据Genbank中猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪圆环病毒4型的保守序列合成上述引物和探针，并委托生工生物(上海)工程有限公司合成并标记。
本发明还提供了一种包含上述引物组的检测猪圆环病毒不同型别的试剂盒。本发明所述试剂盒中优选还包括进行荧光定量PCR的试剂，如QuantiNova Multiplex PCR Kit。
本发明所述试剂盒中，针对猪圆环病毒2型的特异性引物对的工作浓度(即反应体系中浓度)优选为0.4μM，针对猪圆环病毒3型的特异性引物对的工作浓度优选为0.4μM，针对猪圆环病毒4型的特异性引物对的工作浓度优选为0.6μM；探针PCV2-2020 probe的工作浓度优选为0.25μM，探针PCV3 probe的工作浓度优选为0.25μM，探针PCV4 probe3的工作浓度优选为0.4μM。
本发明还提供了上述引物组或上述试剂盒在猪疫病检测中的应用。
本发明在利用上述引物组或试剂盒进行猪疫病检测时，优选利用上述引物组或上述试剂盒构建反应体系，所述反应体系以20μl计，包括：4×Multiplex PCR Master Mix 5μl，PCV2-2020F2(20μmol/L)0.4μl，PCV2-2020R1(20μmol/L)0.4μl，PCV3-real-F2(20μmol/L)0.4μl，PCV3-real-R2(20μmol/L)0.4μl，PCV4-r21-F3(20μmol/L)0.6μl，PCV4-r21-R3(20μmol/L)0.6μl，PCV2-2020 probe(10μmol/L)0.5μl，PCV3 probe(10μmol/L)0.5μl，PCV4probe3(10μmol/L)0.8μl，核酸模板4μl，无RNA酶水6.4μl。
本发明在进行所述猪疫病检测中，优选基于所述反应体系进行荧光定量PCR，所述荧光定量PCR的反应程序优选包括：95℃ 2min；95℃ 5s，60℃ 30s，45个循环。
本发明还提供了一种利用上述引物组或试剂盒检测猪圆环病毒不同型别的方法，优选包括构建上述反应体系，并进行荧光定量PCR。本发明所述反应体系和荧光定量PCR的程序优选与上述相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种检测猪圆环病毒不同型别的三重荧光定量PCR引物组、试剂盒及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规购买得到。
1.病料样品和病毒株
猪口蹄疫病毒灭活疫苗、猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)活疫苗、猪细小病毒((porcine parvovirus，PPV)灭活疫苗(WH－1株)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)疫苗(JXA1－R株)产自中牧实业股份有限公司；猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)灭活疫苗产自浙江诗华诺倍威生物技术有限公司，以上病毒疫苗经检测均含有相应病毒且浓度较高的核酸。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV，GenBank号MZ403746)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroent eritis virus，TGEV，GenBank号MZ403747)、猪伪犬病病毒(pseudorabies virus，PRV，GenBank号MZ403748)、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3，PCV3，GenBank号MZ403745)、猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4，PCV4)和猪圆环病毒1型(Porcine circovirus type 1，PCV1，GenBank号MZ463060)病毒核酸含量高的阳性样品经鉴定后由本实验室保存。
2.主要试剂和仪器
pGEM-T Easy Vector Systems购自promega公司，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自生工生物工程(上海)股份有限公司，质粒抽提试剂盒Mini BEST PlasmidPurification Kit，DNA凝胶回收试剂盒MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit，ExTaq酶，DL2000 DNA Marker，DH5α感觉态细胞和X-gal均为大连宝生物工程有限公司产品，QuantiNova Multiplex PCR Kit为Qiagen公司。病毒核酸提取试剂盒MagNApure 96 DNAand viral NA Small Voume Kit为Roche公司产品。荧光定量PCR仪(型号Lightcycler480)由罗氏公司生产，PCR仪(型号TProfessional)由德国Biometra公司生产，冷冻高速离心机(型号5430R)由eppendorf公司生产，超微量紫外分光光度计NanoDrop2000由Thermo公司生产。
实施例1
1、委托生工生物(上海)工程有限公司合成并标记表1所示的引物和探针。
2、利用用病毒核酸提取试剂盒MagNA pure 96 DNA and viral NA Small VoumeKit，按照操作说明书提取病毒核酸，将获得的病毒核酸保存于-80℃冰箱中备用。
3、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪圆环病毒4型重组质粒标准品的制备
根据猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪圆环病毒4型三重荧光定量检测方法中检测的目标基因片段，设计引物(表2)以分别扩增含猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪圆环病毒4型检测基因的核酸片段，具体操作如下：分别以上述病毒核酸为模板进行PCR反应，反应体系(50μl)如下：10X Ex Taq Buffer 5μl，dNTP 4μl，Ex Taq(5U/μl)0.25μl，上游引物(20μmol/L)1μl，下游引物(20μmol/L)1μl，模板5μl，无RNA酶水33.75μl。反应条件如下：95℃，2min；98℃ 10s，52℃ 30s，72℃，2min，35个循环；72℃ 10min。
将扩增目标片段回收后克隆于pGEM-T Easy载体中构建含目标基因的重组质粒，构建重组质粒分别命名为T-PCV2、T-PCV3和T-PCV4，并送上海生工生物工程技术有限公司进行测序鉴定。利用紫外分光光度计测定重组质粒浓度，并计算拷贝数。
表2扩增猪圆环病毒不同型别的检测基因片段的引物
4、反应体系优化以重组质粒为检测模板，利用矩阵法对探针和引物的浓度进行优化。
采用矩阵法对引物和探针浓度进行优化，优化后的引物和探针终浓度分别为：猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪圆环病毒4型引物在反应体系中的最佳终浓度分别为0.4μM、0.4μM和0.6μM，猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪圆环病毒4型探针在反应体系中的最佳终浓度分别为0.25μM、0.25μM和0.4μM。反应条件为：95℃ 2min；95℃ 5s，60℃ 30s，45个循环。60℃收集荧光。
5、特异性试验
利用所建立的荧光定量PCR方法对PCV1、PCV2、PCV3、PCV4、CSFV、PEDV、TGEV、FMDV、PPV、PRRSV和PRV核酸进行检测，同时设阴性对照，评价方法的特异性。
结果如图1～3所示，PCV2、PCV3和PCV4分别在波长618～660，533～580和455～510区间出现了扩增曲线。而其他病毒核酸和阴性对照在这些波长区间均无扩增曲线出现，表明建立的猪圆环病毒荧光定量PCR检测方法，与PCV1、CSFV、PEDV、TGEV、FMDV、PPV、PRRSV和PRV无交叉反应发生，且PCV2、PCV3和PCV4之间无交叉反应发生。具有良好的特异性。
6、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪圆环病毒4型三重荧光定量PCR检测方法敏感性评价和标准曲线的建立
将制备的T-PCV2、T-PCV3和T-PCV4重组质粒作10倍倍比稀释，采用已建立的荧光定量PCR进行检测，确定荧光定量PCR反应体系中各个模板最低检出浓度。并根据检测结果，分别以反应体系中重组质粒终浓度的对数和Ct值分别为X轴和Y轴绘制标准曲线。
以不同稀释度的重组质粒(T-PCV2、T-PCV3和T-PCV4)为模板进行荧光定量PCR扩增，得出扩增曲线(见图4～6)，并建立荧光定量PCR标准曲线(见图7～9)，结果显示，PCV2、PCV3和PCV4荧光定量PCR标准曲线相关系数R2分别为0.9959、0.9928和0.9958，均具有良好的线性关系。结果表明，PCV2、PCV3最低检测值均为10拷贝/μl，而PCV4最低检测值为1拷贝/μl。
7、重复性试验
分别以反应体系中终浓度为106、105、104、103拷贝/μl的重组质粒(T-PCV2、T-PCV3和T-PCV4)为模板，利用所建立的荧光定量PCR方法进行检测，每个稀释度的同一模板均进行4次批内和批间重复实验，并计算批内及批间的平均值、标准差及变异系数。
分别以反应体系中终浓度为106、105、104、103、102拷贝/μl的重组质粒(T-PCV2、T-PCV3和T-PCV4)为模板，对每个稀释度的模板分别进行4次批内和批间重复检测，结果如表3～表5所示，同一模板不同浓度的批内和批间变异系数均在3％以内，表明所建的荧光定量PCR方法具有良好的重复性和稳定性。
表3荧光定量PCR方法猪圆环病毒2型重复性试验
表4荧光定量PCR方法猪圆环病毒3型重复性试验
表5荧光定量PCR方法猪圆环病毒4型重复性试验
8、临床样品检测
猪组织样品用PBS稀释研磨，离心后取上清，利用病毒核酸提取试剂盒提取病毒核酸，利用所建立的荧光定量PCR和普通单重PCR方法(扩增引物见表6)对来自浙江省内83份猪组织样品进行检测。
表6猪圆环病毒不同型别普通单重PCR检测引物
检测结果如表7～表9所示，建立的猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪圆环病毒4型的三重荧光定量PCR检测方法与单重猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪圆环病毒4型单重PCR检测方法阳性符合率分别为100％、95.82％和94.51％，具有较高的一致性，准确率较高。
表7三重荧光定量PCR方法和PCV2 PCR方法的检测结果
表8三重荧光定量PCR方法和PCV3 PCR方法的检测结果
表9三重荧光定量PCR方法和PCV4 PCR方法的检测结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江省动物疫病预防控制中心
<120> 一种检测猪圆环病毒不同型别的三重荧光定量PCR引物组、试剂盒及应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
aatgggctgc taattttgca gac 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
atggtaacca tcccaccact tg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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gcagtttccc attcgtttag gc 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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