一种用于鸽性别鉴定的pcr引物、试剂盒及其方法
本申请为申请日为2021年01月28日，申请号为202110120742.8，发明名称为一种用于家禽性别鉴定的PCR引物、试剂盒及其方法的中国发明专利的分案申请。
技术领域
本发明属于生物
技术领域
，具体涉及一种用于鸽性别鉴定的PCR引物、试剂盒及其方法。背景技术
商业化家禽品种大都是以配套系模式生产的，父系一般生长速度较快，母系一般繁殖效率较高，因此都需要早期进行性别鉴定，父系要提前淘汰母雏，母系要提前淘汰公雏。肉用型家禽的公禽一般生长速度较快，公母分群饲养，养殖效益会更好。蛋用型家禽出雏时只保留母雏，公雏直接淘汰。因此家禽早期性别鉴定在生产中具有重要的意义。
目前家禽早期的性别鉴定除了伴性遗传(金银色羽、横斑羽、快慢羽)等方法外，主要通过翻肛观察生殖突起进行鉴别。但翻肛鉴别须在雏禽出生24小时内进行，超过这个时间段，雏禽肛门难以翻开，生殖突起萎缩甚至陷入泄殖腔深处，不便观察翻肛鉴别劳动强度大、工作环境差、专业性高，误鉴率也较高。
因此，需要开发一种简单方便，能够快速、准确鉴别家禽性别的方法。
发明内容
本发明目的在于解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种设计合理，可用于家禽早期性别快速鉴定的PCR引物。
本发明通过以下技术方案实现本发明的目的：
本发明目的之一在于提供一种性别鉴定用PCR引物，所述引物序列如SEQ IDNO.1/SEQ ID NO.2所示。即所述引物的核苷酸序列为：
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3'；
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
本发明目的之二在于提供包含本发明所述的性别鉴定用PCR引物的试剂盒。
在本发明的一种实施例中，本发明所述的试剂盒包含本发明所述的PCR引物、PCR反应液，在一些实施例中，还可以包含DNA提取液。
本发明目的之三在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在养殖业中的应用。
本发明目的之四在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在鸭性别鉴定中的应用。
本发明所述的在鸭性别鉴定中的应用，通过本发明所述的引物进行PCR扩增，电泳结果呈现1147bp一条带的为公鸭，呈现1147bp和851bp的两条带时为母鸭。
本发明目的之五在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在鸡性别鉴定中的应用。
本发明所述的在鸡性别鉴定中的应用，通过本发明所述的引物进行PCR扩增，电泳结果呈现983bp一条带的为公鸡，呈现983bp和798bp的两条带时为母鸡。
本发明目的之六在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在鸽性别鉴定中的应用。
本发明所述的在鸽性别鉴定中的应用，通过本发明所述的引物进行PCR扩增，电泳结果呈现937bp一条带的为公鸽，呈现937bp和1153bp的两条带时为母鸽。
本发明目的之七在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在番鸭性别鉴定中的应用。
本发明所述的在番鸭性别鉴定中的应用，通过本发明所述的引物进行PCR扩增，电泳结果呈现1153bp一条带的为公番鸭，呈现1153bp和832bp的两条带时为母番鸭。
本发明目的之八在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在鹅性别鉴定中的应用。
本发明所述的在鹅性别鉴定中的应用，，电泳结果呈现1145bp一条带的为公鹅，呈现1145bp和833bp的两条带时为母鹅。
本发明目的之九在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在鹌鹑性别鉴定中的应用。
本发明所述的在鹌鹑性别鉴定中的应用，电泳结果呈现1068bp一条带的为公鹌鹑，呈现1068bp和791bp的两条带时为母鹌鹑。
本发明还提供一种鸭、鸡、鸽、番鸭、鹅或鹌鹑性别快速鉴定方法，包括以下步骤：
1)提取待测家禽的基因组DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用本发明所述引物对，进行PCR扩增反应；
3)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，
当待测家禽为鸭时，电泳结果呈现1147bp一条带的为公鸭公鸡，呈现1147bp和851bp的两条带时为母鸭；
当待测家禽为鸡时，电泳结果呈现983bp一条带的为公鸡，呈现983bp和798bp的两条带时为母鸡；
当待测家禽为鸽时，电泳结果呈现937bp一条带的为公鸽，呈现937bp和1153bp的两条带时为母鸽；
当待测家禽为番鸭时，电泳结果PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果呈现1153bp一条带的为公番鸭，呈现1153bp和832bp的两条带时为母番鸭；
当待测家禽为鹅时，电泳结果呈现1145bp一条带的为公鹅，呈现1145bp和833bp的两条带时为母鹅；
当待测家禽为鹌鹑时，电泳结果呈现1068bp一条带的为公鹌鹑，呈现1068bp和791bp的两条带时为母鹌鹑。
本发明所述的方法，步骤1)提取待测家禽的基因组DNA可以按照本领域常规方法提取，例如可以选用包括但不限于羽毛、血液、组织、器官等进行待测家禽的基因组DNA的提取。
本发明所述的方法，步骤2)中PCR反应体系可以为本领域的常规体系，在本发明的一种具体的实施方式中，为：2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正向和反向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
本发明所述的方法，步骤2)中PCR反应程序可以为本领域的常规体系，在本发明的一种具体的实施方式中，为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明通过设计的PCR引物，进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，利用电泳结果的条带数来确定家禽的性别，具有操作简单方便，鉴别结果快速准确，便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景，此外，基于本发明方法开发的检测试剂盒，可产生可观的经济效益和良好的社会价值。
本发明的引物对家禽品种限制性小，因此对于所述的本发明所述的鸭、鸡、鸽、番鸭、鹅或鹌鹑没有具体品种的限制，其中，本发明中所述的“鸭”是指鸭科鸭属绿头鸭种，所述的“番鸭”又称洋鸭，是鸭科、栖鸭属疣鼻栖鸭。
附图说明
图1为本发明实施例1鸭的PCR扩增产物的电泳图谱。
图2为本发明实施例2鸭的PCR扩增产物的电泳图谱。
图3为本发明实施例3鸡的PCR扩增产物的电泳图谱。
图4为本发明实施例4鸡的PCR扩增产物的电泳图谱。
图5为本发明实施例6鸽子的PCR扩增产物的电泳图谱。
图6为本发明实施例7鸽子的PCR扩增产物的电泳图谱。
图7为本发明实施例8番鸭的PCR扩增产物的电泳图谱。
图8为本发明实施例9番鸭的PCR扩增产物的电泳图谱。
图9为本发明实施例10鹅的PCR扩增产物的电泳图谱。
图10为本发明实施例11鹅的PCR扩增产物的电泳图谱。
图11为本发明实施例12鹌鹑的PCR扩增产物的电泳图谱。
图12为本发明实施例13鹌鹑的PCR扩增产物的电泳图谱。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1
1已知性别鸭鉴定
1.1样品采集
采集10只已知性别的成年北京鸭，编号1-5为公鸭，6-10为母鸭，使用本发明设计引物扩增鸭基因组。
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3'；
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
1.2 PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
1.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸭电泳检测只有一条1147bp的条带，母鸭电泳检测时有1147bp和851bp的两条带，见结果如图1(其中1～5为公鸭，6～10为母鸭)。
以上结果表明本发明能够快速准确对鸭进行性别鉴定，并且简单易于操作。
实施例2
2未知性别鸭鉴定
2.1样品采集
采集16只未知性别的绍兴鸭雏鸭，使用本发明设计引物(SEQ ID NO.1)和(SEQ IDNO.2)扩增鸭基因组。
2.2 PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
2.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸭电泳检测只有一条1147bp的条带，母鸭电泳检测时有1147bp和851bp的两条带，见结果如图2(其中3、4、6、7、11、12、15、16为公鸭，1、2、5、8、9、10、13、14为母鸭)。
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
实施例3
1已知性别鸡鉴定
1.1样品采集
采集8只已知性别的成年崇仁麻鸡，编号1-4为公鸡，5-8为母鸡，使用本发明设计引物扩增鸡基因组。
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3'；
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
1.2 PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
1.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸡电泳检测只有一条983bp的条带，母鸡电泳检测时有983bp和798bp的两条带，见结果如图3(其中1～4为公鸡，5～8为母鸡)。
以上结果表明本发明能够快速准确对鸡进行性别鉴定，并且简单易于操作。
实施例4
2未知性别鸡鉴定
2.1样品采集
采集24只未知性别的隐性白鸡的雏鸡，使用本发明设计引物(SEQ ID NO.1)和(SEQ ID NO.2)扩增鸡基因组。
2.2 PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
2.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸡电泳检测只有一条983bp的条带，母鸡电泳检测时有983bp和798bp的两条带，见结果如图4(其中1、4、5、7、8、9、12、14、17、20、21、22为公鸡，2、3、6、10、11、13、15、16、18、19、23、24为母鸡)。
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
实施例5
3资源保护应用
3.1将本单位地方鸡血液样本基因库中的大骨鸡、白耳黄鸡、河南斗鸡、北京油鸡、仙居鸡、茶花鸡、丝羽乌骨鸡、狼山鸡、藏鸡、清远麻鸡、瓦灰鸡、金湖乌凤鸡、茶花鸡、寿光鸡、鹿苑鸡、东乡黑鸡、边鸡、文昌鸡、固始鸡等19个品种使用本发明设计引物(SEQ IDNO.1)和(SEQ ID NO.2)扩增鸡基因组。
3.2 PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
3.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸡电泳检测只有一条983bp的条带，母鸡电泳检测时有983bp和798bp的两条带，鉴定结果与个体性别记录的结果一致，见表1。
表1 19个不同鸡地方品种检测结果
实施例6
1已知性别白羽王鸽鉴定
1.1样品采集
采集8只已知性别的成年白羽王鸽，编号1-4为公鸽，5-8为母鸽，使用本发明设计引物扩增鸽基因组。
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3'；
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
1.2 PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
1.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸽电泳检测只有一条937bp的条带，母鸽电泳检测时有937bp和1153bp的两条带，见结果如图5(其中1～4为公鸽，5～8为母鸽)。
以上结果表明本发明能够快速准确对鸽进行性别鉴定，并且简单易于操作。
实施例7
2未知性别欧洲肉鸽鉴定
2.1样品采集
采集17只未知性别的欧洲肉鸽的雏鸽，使用本发明设计引物(SEQ ID NO.1)和(SEQ ID NO.2)扩增鸽基因组。
2.2 PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
2.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸽电泳检测只有一条937bp的条带，母鸽电泳检测时有937bp和1153bp的两条带，见结果如图6(其中1、2、4、7、8、12、14、15为公鸽，3、5、6、9、10、11、13、16、17为母鸽)。
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
实施例8
1已知性别白羽番鸭鉴定
1.1样品采集
采集10只已知性别的成年白羽番鸭，编号1-5为公番鸭，6-10为母番鸭，使用本发明设计引物扩增番鸭基因组。
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3'；
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
1.2 PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
1.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公番鸭电泳检测只有一条1153bp的条带，母番鸭电泳检测时有1153bp和832bp的两条带，见结果如图7(其中1～5为公番鸭，6～10为母番鸭)。
以上结果表明本发明能够快速准确对番鸭进行性别鉴定，并且简单易于操作。
实施例9
2未知性别黑羽番鸭鉴定
2.1样品采集
采集17只未知性别的黑羽番鸭雏番鸭，使用本发明设计引物(SEQ ID NO.1)和(SEQ ID NO.2)扩增番鸭基因组。
2.2 PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
2.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公番鸭电泳检测只有一条1153bp的条带，母番鸭电泳检测时有1153bp和832bp的两条带，见结果如图8(其中2、3、5、7、10、11、13、14、17为公番鸭，1、4、6、8、9、12、15、16为母番鸭)。
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
实施例10
1已知性别扬州鹅鉴定
1.1样品采集
采集10只已知性别的成年扬州鹅，编号1-5为公鹅，6-10为母鹅，使用本发明设计引物扩增鹅基因组。
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3'；
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
1.2 PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
1.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鹅电泳检测只有一条1145bp的条带，母鹅电泳检测时有1145bp和833bp的两条带，见结果如图9(其中1～5为公鹅，6～10为母鹅)。
以上结果表明本发明能够快速准确对鹅进行性别鉴定，并且简单易于操作。
实施例11
2未知性别莱茵鹅鉴定
2.1样品采集
采集17只未知性别的莱茵鹅雏鹅，使用本发明设计引物(SEQ ID NO.1)和(SEQ IDNO.2)扩增鹅基因组。
2.2 PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
2.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鹅电泳检测只有一条1145bp的条带，母鹅电泳检测时有1145bp和833bp的两条带，见结果如图10(其中1、4、7、8、11、13、15、16为公鹅，2、3、5、6、9、10、12、14、17为母鹅)。
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
实施例12
1已知性别日本鹌鹑鉴定
1.1样品采集
采集8只已知性别的成年日本鹌鹑，编号1-4为公鹌鹑，5-8为母鹌鹑，使用本发明设计引物扩增鹌鹑基因组。
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3'；
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
1.2 PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
1.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鹌鹑电泳检测只有一条1068bp的条带，母鹌鹑电泳检测时有1068bp和791bp的两条带，见结果如图11(其中1～4为公鹌鹑，5～8为母鹌鹑)。
以上结果表明本发明能够快速准确对鹌鹑进行性别鉴定，并且简单易于操作。
实施例13
2未知性别中国白羽鹌鹑鉴定
2.1样品采集
采集17只未知性别的中国白羽鹌鹑雏鹌鹑，使用本发明设计引物(SEQ ID NO.1)和(SEQ ID NO.2)扩增鹌鹑基因组。
2.2 PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
2.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鹌鹑电泳检测只有一条1068bp的条带，母鹌鹑电泳检测时有1068bp和791bp的两条带，见结果如图12(其中3、5、6、9、10、11、13、16为公鹌鹑，1、2、4、7、8、12、14、15、17为母鹌鹑)。
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
序列表
<110> 江苏省家禽科学研究所
<120> 一种用于鸽性别鉴定的PCR引物、试剂盒及其方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaagagt ttcagcactt ga 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttcataatag gagctcgagc ca 22
