一种x染色体str基因座的复合扩增体系及试剂盒
技术领域
本发明涉及分析遗传学
技术领域
，特别涉及一种X染色体STR基因座的复合扩增体系及试剂盒。背景技术
短串联重复序列(Short Tandem Repeat，STR)是存在于人基因组中的一类具有长度多态性的DNA序列，其核心序列一般由2～6个碱基构成，因该核心序列在不同个体间呈不同数目的串联重复而呈现出长度多态性。人基因组DNA中平均每6-10kb就有一个STR基因座，这些广泛分布于人基因组中高度多态重复序列成为个体识别和亲权鉴定的有效遗传标记。STR片段小易扩增，适宜于检验微量和降解生物检材，各基因座的扩增条件相似而能够实现复合扩增和自动化检测，因而具有灵敏、准确、快速、信息量大等优点，非常适用于建立DNA数据库。目前在法医工作中应用较多的方法包括常染色体检测和/或Y染色体检测。但在日常检案过程中，遇到母子、父女关系鉴定以及在双亲缺失的姐妹关系认定、同父异母的姐妹关系认定、祖母-孙女的关系认定时，则仅依靠现有的检测技术难以低成本、快速完成鉴定。
发明内容
本发明目的一方面在于提供一种X染色体STR基因座的复合扩增体系及试剂盒，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
一种X染色体STR基因座的复合扩增体系，包括反应混合液、热启动Taq酶、引物的混合物、sdH2O，以及提取的待测DNA。其中所述引物对包括特异性复合扩增32个X染色体STR基因座和1个Amelogenin性别识别基因座的33对引物对，所述X染色体STR基因座选自DXS8378、DXS7423、DXS10148、DXS10159、DXS10134、DXS7424、DXS9902、DXS10162、DXS7132、DXS10079、DXS6789、GATA165B12、DXS101、DXS10075、DXS10103、DXS10101、HPRTB、DXS6809、GATA31E08、DATA172D05、DXS6803、DXS10074、DXS10135、DXS6810、Amelogenin、DXS6795、DXS6800、DXS7133、DXS10164、DXS6807、DXS9895、DXS8377及DXS981。
在进行二联体的检测时，在母子、父女关系鉴定中，X-STR比常染色体STR更加直观有效。尤其是父亲女儿的遗传关系鉴定中，可以很好的应用X染色体STR遗传标记。男性含有一条X染色体，X-STR以单倍型形式存在，其完全来源母亲且完全遗传给女儿。在母女遗传关系中，X染色体与常染色相同，不会发挥更多的作用。但在特殊案例中，比如，两人并非母女但常染色体并不能排除的情况下，加X染色体遗传标记有很好的排除作用。同样根据X染色体独特的遗传方式，X染色体STR在双亲缺失的姐妹关系认定，同父异母的姐妹关系认定，祖母-孙女的关系认定中起重要作用。X染色体STR由于其单个位点的位点平均排除率优于常染色体，在腐败降解检材检测中有一定作用，前面小片段的基因座能提供一定的信息。
所述X染色体STR基因座的复合扩增体系能够实现单管同时扩增检测33个基因座，因而能够用于X染色体基因座信息实现个体识别及嫌疑人的快速排查，又能用于产前诊断、和/或亲权鉴定，对于法医DNA的快速检验和现场检验能提供有效的技术保障。具体地，所选基因座的信息如表1所示：
表1、各基因座信息
在一些实施例中，所述特异性扩增引物的终浓度为0.025μm~0.51μm。具体的引物序列及浓度如表2所示：
表2、引物序列及对应浓度
在一些实施例中，每个所述基因座对应的引物对中至少有一个引物的5'端具有荧光染料标记。进一步将所述32个X染色体STR基因座和1个Amelogenin性别识别基因座分组，每组具有相同的荧光染料标记，各组的荧光染料标记互不相同，则可提高检出效率。
在一些实施例中，为避免不同基因座之间产物出峰位置的重叠，保证复扩体系中32个基因座的分型结果互不影响，因此根据基因座扩增片段的长度大小进行合理地排布与分组；将特异性复合扩增DXS8378、DXS7423、DXS10148、DXS10159和DXS10134基因座的引物对为第一组，特异性复合扩增DXS7424、DXS9902、DXS10162、DXS7132、DXS10079和DXS6789基因座的引物对为第二组，特异性复合扩增GATA165B12、DXS101、DXS10075、DXS10103、DXS10101、HPRTB和DXS6809基因座的引物对为第三组，特异性复合扩增GATA31E08、DATA172D05、DXS6803、DXS10074、DXS10135和DXS6810基因座的引物对为第四组，特异性复合扩增Amelogenin、DXS6795、DXS6800、DXS7133、DXS10164、DXS6807、DXS9895、DXS8377和DXS981基因座的引物对为第五组。
可选用的荧光染料标记包括6-FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIC、PET、NED、TAZ、SIZ。在一些实施例中，所述第一组的荧光染料标记为6-FAM，所述第二组的荧光染料标记为HEX，所述第三组的荧光染料标记为SUM，所述第四组的荧光染料标记为LYN，所述第五组的荧光染料标记为PUR。此外，分子量内标选择橙色荧光SIZ作为荧光染料标记，即第六组荧光染料。
在一些实施例中，X染色体STR基因座的复合扩增体系合计25.0 μL，包括反应混合液10.0 μL，热启动Taq酶1.0 μL，33对所述引物对的混合物5.0 μL，基因组DNA 0.125 -5.0ng，余量以 sdH2O补足。进一步，所述反应混合液包括Tris-HCl、MgCl2、KCl和dNTP、BSA。
具体地，Tris-HCl的反应终浓度为50 mM，MgCl2的反应终浓度为2.0 mM，KCl的反应终浓度为50 mM，dNTP的反应终浓度为0.2 mM，BSA的反应终浓度为0.8 mg/mL，热启动Taq酶的含量为5U/μL。
上述X染色体STR基因座的复合扩增体系的扩增程序为：预变性，95℃ 5 min；30个循环，94℃ 10 s，59℃ 1 min，68℃ 1 min；终延伸，60℃ 20 min；4℃保温维持。所得扩增产物的片段长度约为500bp。
本发明另一方面还提供了一种试剂盒，其包括上述的X染色体STR基因座的复合扩增体系，以及提取人基因组DNA的载体、等位基因分型标准物和荧光分子量内标。所述载体含有包括利用Chelex法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种方法提取的人基因组DNA，和/或通过滤纸、FTA卡、棉签、纱布中任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。
本发明所提供的X染色体STR基因座的复合扩增体系及试剂盒可应用于法医个体识别、嫌疑人家系排查、产前诊断、X染色体数据库、和/或亲权鉴定。可单管同时扩增33个基因座，远超现有其他同类型复合扩增体系或试剂盒的上限。结合AGCU Marker SIZ-500分析，将STR试剂盒检测片段提升至500 bp，且能够适用的DNA样品来源于精斑、唾液斑、组织、毛囊、血痕或血液等，可以满足公安实战对于法医DNA的快速检验和现场检验能力的要求提供有效的技术保障。
附图说明
图1是所述试剂盒遗传标记位点排布示意图；
图2是根据实施例4所示的试剂盒标准DNA 9948的分型图；
图3是根据实施例4所示的试剂盒标准DNA 9947A的分型图；
图4是根据实施例4所示的等位基因Allelic Ladder分型图；
图5是实施例5所述姐姐样本的分型图；
图6是实施例5所述妹妹样本的分型图；
图7是实施例6所述样本1的分型图；
图8是实施例6所述样本2的分型图。
以下便结合实施例，对本发明的
具体实施方式
作进一步的详述，以使技术方案更易于理解、掌握。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1，X染色体STR基因座的筛选
选取X染色体中具有高鉴别力的STR基因座，对DXS10011、DXS10074、DXS10075、DXS10077、DXS10079、DXS101、DXS10101、DXS10103、DXS10134、DXS10135、DXS10146、DXS10148、DXS10159、DXS10161、DXS10162、DXS10163、DXS10164、DXS10165、DXS6789、DXS6795、DXS6799、DXS6800、DXS6801、DXS6804、DXS6807、DXS6809、DXS6810、DXS7132、DXS7133、DXS7423、DXS7424、DXS8377、DXS8378、DXS981、DXS9902、DXS9907、GATA165B12、GATA172D05、GATA31E08、HPRTB 等40个STR基因座在中国人群的遗传多态性开展调查研究，对2500多名个体进行基因型检测，根据各基因座等位基因的分布频率计算个体识别能力（DP）、杂合度（H）、非父排除率（PE）等数据，最终确立了32个X染色体STR基因座的构成：DXS8378、DXS7423、DXS10148、DXS10159、DXS10134、DXS7424、DXS9902、DXS10162、DXS7132、DXS10079、DXS6789、GATA165B12、DXS101、DXS10075、DXS10103、DXS10101、HPRTB、DXS6809、GATA31E08、DATA172D05、DXS6803、DXS10074、DXS10135、DXS6810、DXS6795、DXS6800、DXS7133、DXS10164、DXS6807、DXS9895、DXS8377、DXS981表明这32个X染色体STR基因座在人群中具有高度的遗传多态性和良好的等位基因频率分布（如表1所示）。
实施例2，特异性引物设计及引物浓度的选取
随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同基因座引物之间的相互干扰也越来越严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，因此需要设计大量的引物序列进行复杂的测试及摸索复合扩增系统中引物之间特异的浓度比例，最终保证了不降低试剂盒特异性及灵敏度的情况下复合更多的人X染色体STR基因座。
具体的，包括如下步骤：
（1）特异性扩增引物设计
通过基因座名称或者X染色体位置，利用UCSC或NCBI网站进行基因座序列下载；其次，根据每个基因座重复单元两侧的序列进行引物设计。设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计；在设计引物时，保证引物的长度适中，具有相似的物理特性和反应动力学特点、Tm值和GC含量相近、引物之间不能形成二聚体；同时还要考虑到在复合扩增中引物对不同检材的适用性，保证不同检材扩增均衡性要求。上下游引物的Tm值一致，不超过2℃。避免任意两条引物的3’末端之间有连续超过3个碱基互补配对。避免引物序列与模板序列非特异区域结合。引物序列除了特异性引物结合区外，匹配区域需要减少。
（2）引物验证
首先，进行引物的单扩实验，排除有非特异、扩增效率低的引物；其次，进行单色小复扩实验，即将每一组引物分别单独混合测试，和单扩一样，需要排除产生非特异及扩增效率低的引物；最后，进行大复扩实验，即五组引物全部混合测试。在单色小复扩实验中会出现单扩实验效果良好的引物无法适配同组的其他引物的情况。该情况下是无法预判应当调整单个效果不好的引物序列还是调整同组其余引物的序列。同理，在大复扩实验中也会出现单扩实验效果良好的引物组与其他引物组相互影响的情况。另外，还可以通过调整引物浓度的方式改变其检测效率。发明人意外发现可通过同一组上下游引物分别使用不同浓度的方式解决上述问题，最终得到如表2所示的33对引物序列及对应浓度。最终试剂盒遗传标记位点排布示如图1所示。
实施例3，扩增体系的确定
除了上述基因座的特异性扩增引物，本试剂盒反应体系还包括反应混合液、热启动Taq酶和sdH2O，所述反应混合液包含Tris-HCl、MgCl2、KCl和dNTP、BSA，各组分的浓度可以根据需要进行调整。
具体的，可以在PCR扩增体系中，对Mg2+浓度、dNTPs浓度两个因素设计正交实验进行优化，制备成PCR反应混合液，加入到PCR体系中。最终PCR体系各组成见表3。
表3 PCR反应扩增体系
其中，反应混合液中各组分反应终浓度为50mM Tris-HCl、50mM KCl、2.0mMMgCl2、0.2mM dNTPs、0.8mg/mL BSA；33个基因座对应的引物及其引物浓度如表3所示。再者，33个基因座是按如下分组并进行荧光标记的：DXS8378、DXS7423、DXS10148、DXS10159和DXS10134为第一组，荧光染料标记为6-FAM；DXS7424、DXS9902、DXS10162、DXS7132、DXS10079和DXS6789为第二组，荧光染料标记为HEX；GATA165B12、DXS101、DXS10075、DXS10103、DXS10101、HPRTB和DXS6809为第三组，荧光染料标记为SUM；GATA31E08、DATA172D05、DXS6803、DXS10074、DXS10135和DXS6810为第四组，荧光染料标记为LYN；Amelogenin、DXS6795、DXS6800、DXS7133、DXS10164、DXS6807、DXS9895、DXS8377和DXS981为第五组，荧光染料标记为PUR。
实施例4，本申请的试剂盒的使用方法
本申请的试剂盒的使用方法可以包括PCR扩增反应步骤，其中PCR扩增反应可以包括扩增反应程序。在一些实施例中，扩增反应程序的不同，其扩增产物也不同。具体的，本发明33对引物在单管PCR体系里扩增时，可能因为扩增片段大小不等、扩增标记引物不同，容易导致扩增效率差异比较大，进而在检测时，扩增峰高差异比较显著，因此为改善扩增峰高之间的差异、提高不同基因座之间扩增均衡性问题、满足不同检材的适应性、不同退火温度的耐受性，需要测试不同的扩增程序，以保证不同检材在较宽的温度范围内均能得到正确的DNA分型。
下面仅便于说明的目的，并不限制本申请的所要保护的范围。首先，循环数测试：分别测试了28个循环，29个循环，30个循环，31个循环，实验证明最佳循环为30个；其次退火温度测试：分别测试了57℃，58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，实验证明最佳温度为59℃；再次，需要测试循环内延伸时间及延伸温度，已达到大小片段扩增效率差异较大问题，更好的提高试剂盒的扩增性能，最终扩增程序如下表4：
表4 扩增程序
基于上述得到的优选地扩增程序，本申请试剂盒的扩增步骤如下：
1）将含有PCR扩增体系的PCR扩增管置于热循环仪上；
2）选择如表4所述的程序进行扩增；
3）扩增后的产物应避光保存；
4）电泳结束后，将PCR扩增产物3000rpm离心5 min，取1 μL离心后的PCR扩增产物或试剂盒等位基因分型标准物与0.5 μL荧光分子量内标AGCU Marker SIZ-500和12 μL去离子甲酰胺混合，避免产生气泡，95℃变性3 min，冰浴3 min，遗传分析仪电泳检测，用片段分析软件GeneMapper分析电泳数据。其中，DNA标准对照品9948、DNA标准对照品9947A和等位基因分型标准物的分型结果分别如图2、图3和图4所示。
实施例5，实例分析1
选取一对姐妹样本，使用本申请的试剂盒分别对其进行全同胞分析，结果如图5、图6及表5所示：
表5 姐妹样本基因分型
根据《生物学全同胞关系鉴定实施规范—SF/Z JD0105002—2014》，X染色体STR基因座的状态一致性评分方法如表6所示：
表6 X染色体STR基因座的状态一致性评分计算表
经过基因分型比对以及X染色体STR基因座的状态一致性评分，根据表5基因分型及表6的计算方法，得出结果为IBS值是55，属于IBS≥32区间，即本实施例所检测的两个样本倾向于被鉴定人为全同胞，与事实相符。
实施例6，实例分析2
取两个无关个体样本，使用本申请的试剂盒分别对其进行全同胞分析，结果如图7、图8及表7所示：
表7 无关个体样本基因分型
经过基因分型比对以及X染色体STR基因座的状态一致性评分，根据表7基因分型及表6的计算方法，得出结果为IBS值是13，属于IBS≤21区间，即本实施例所检测的两个样本倾向于被鉴定人为无关个体，与事实相符。
经上述实施例证实，检测结果与事实相符，证明本技术方案提供的X染色体STR基因座的复合扩增体系及试剂盒能够实战使用。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
序列表
<110> 广东华美众源生物科技有限公司；无锡中德美联生物技术有限公司；广州市刑事科学技术研究所
<120> 一种X染色体STR基因座的复合扩增体系及试剂盒
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aatagaggtt agtattt 17
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
acacctctct ggatagcat 19
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
tatggtccat aaaaatctgt t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcctcggctt ggattacagg ca 22
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<213> 人工序列
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tacgacccta ttccggt 17
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agtctgtata cgtccctac 19
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tgtcttgcta cacacctc 18
