一种鸡感染空肠弯曲杆菌的分子标记及检测方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学
技术领域
，涉及一种鸡感染空肠弯曲杆菌的分子标记及检测方法和应用。背景技术
空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)为革兰氏阴性菌，微需氧(5％氧气、10％二氧化碳、85％氮气)，是弯曲杆菌属的一个种，鸡是空肠弯曲杆菌的主要宿主，不仅能引起畜禽发病，造成畜牧业严重的经济损失，而且也是人类食源性疾病的主要病原菌之一，是一种人畜共患病原菌。
microRNA(miRNA)是一类短小、单链、非编码RNA，长度大约20～24nt，广泛存在于动物、植物、病毒体内。同一个miRNA前体可能由于Drosha或Dicer的剪切位点改变，外切核酸酶介导的miRNA端缩短，miRNA编辑等多种原因，而形成多种长度或序列不同的miRNAs异构体—isomiR。能够在转录后水平对基因表达进行更精细的调控。由于isomiR与其注释体通常只有少数碱基的差异，目前常规检测miRNA的加尾法和茎环法都不能很好地分辨这种差异，为isomiR的检测和在抗病育种中的应用造成很大困难。
前期研究发现，鸡感染空肠弯曲杆菌后，gga-miR-24-3p的其中一个异构体isomiR-1显著上调，且基础表达量高于其他异构体，适合作为一种内源生物标志物。通过检测鸡盲肠组织gga-miR-24-3p异构体isomiR-1的表达水平，以确定其是否已感染空肠弯曲杆菌，是一种新型的分子标记方法，能够克服传统微生物检测方法灵敏度低、难以确定是否内源污染的缺点，实现快速、高效地对空肠弯曲杆菌感染状况进行监控，适用于家禽遗传育种研究，在抗病育种领域具有潜在应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测鸡感染空肠弯曲杆菌的分子标记，通过检测鸡盲肠组织内特异性gga-miR-24-3p异构体isomiR-1的表达水平以确定鸡是否感染空肠弯曲杆菌，在家禽抗病育种领域具有潜在应用价值。
为了实现上述技术目的，本发明具体采用以下技术方案：
一种鸡感染空肠弯曲杆菌的分子标记，该分子标记为鸡盲肠组织gga-miR-24-3p的异构体isomiR-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述gga-miR-24-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的另一方面，提供了一种检测鸡感染空肠弯曲杆菌的方法，包括以下步骤：
1)提取鸡盲肠组织总RNA，进行反转录；
2)以反转录的DNA为模板，分别利用检测引物和内参引物进行PCR扩增；
3)经内参校正后用方法计算待检鸡和阴性鸡isomiR-1的差异倍数，待检鸡isomiR-1的表达量超过阴性鸡6倍以上判定为空肠弯曲杆菌阳性鸡。
进一步的，所述反转录引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步的，所述检测引物如SEQ ID NO.4～5所示，所述内参引物如SEQ ID NO.6～7所示。
进一步的，所述PCR体系为：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0μl，上下游引物各0.4μl，Template DNA 2.0μl，ddH2O 7.2μl。
进一步的，所述PCR程序为：95℃预变性30sec；95℃10sec，60℃30sec，40个循环；95℃10sec，65℃60sec，97℃1sec。
在本发明的另一方面，上述检测引物也在本发明的保护范围之内，该引物可检测鸡盲肠组织gga-miR-24-3p异构体isomiR-1。
在本发明的另一方面，还提供了所述分子标记或检测引物在检测鸡感染空肠弯曲杆菌中的应用。通过实时荧光定量PCR，待检鸡isomiR-1的表达量超过阴性鸡6倍以上判定为空肠弯曲杆菌阳性鸡。
本发明的有益效果为：
本发明筛选出的gga-miR-24-3p异构体isomiR-1表达水平与鸡感染空肠弯曲杆菌密切相关，是一种新的内源生物标志物。通过检测鸡盲肠组织gga-miR-24-3p异构体isomiR-1的表达水平，以确定其是否已感染空肠弯曲杆菌，是一种新型的分子标记方法。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种通过检测鸡盲肠组织内特异性gga-miR-24-3p异构体isomiR-1的表达水平以确定鸡是否感染空肠弯曲杆菌的分子标记方法，在家禽抗病育种方面具有潜在应用价值。具体内容如下：
1)RNA提取及反转录
采用Trizol法提取鸡盲肠组织总RNA，利用表1的茎环引物及表2、表3的试剂配制方法和反应条件进行反转录。该茎环引物能特异性识别isomiR-1的3’末端6个碱基(内参选用细胞内稳定表达的U6)。经验证，采用所述引物，isomiR-1和U6能够分别特异性扩增出目的PCR产物，可进行后续定量工作。
表1检测gga-miR-24-3p异构体isomiR-1的相关引物
表2反转录反应混合液
表3反转录反应条件
2)定量PCR
将上述反转录后的DNA作为模板，采用表1中的上下游引物进行定量PCR，反应混合液及反应条件分别见表4、表5，定量PCR仪为Roche96。
表4 qPCR反应混合液
表5 qPCR反应条件
3)isomiR-1表达量的计算及空肠弯曲杆菌阳性鸡的判定
根据qPCR检测到的待检鸡和空肠弯曲杆菌阴性鸡isomiR-1的Ct值，用内参校正后用方法计算两者isomiR-1的差异倍数，待检鸡isomiR-1的表达量超过阴性鸡6倍以上判定为空肠弯曲杆菌阳性鸡。
实施例2
本实施例通过测序方法对上述gga-miR-24-3p异构体isomiR-1的检测方法进行验证，包括以下步骤：
1)将30只空肠弯曲杆菌阴性鸡随机平分为试验组和对照组，试验组每只鸡灌服0.5ml空肠弯曲杆菌菌液(1×108cfu/ml)，对照组灌服等体积PBS，随后将两组鸡饲养在独立的隔离器中，自由采食和饮水，避免发生交叉感染。
2)接种后8h，从试验组和对照组各随机取10只鸡，安乐致死后取盲肠组织和盲肠内容物。将盲肠组织置液氮保存，盲肠内容物置0～4℃低温保存。
3)通过测定盲肠内容物样本中空肠弯曲杆菌的含量，确认人工感染模型构建成功；然后从对照组和试验组分别选取一定数量盲肠组织样本送测序公司进行转录组测序。
4)获得测序数据后，经质控、拼接、比对，筛选出gga-miR-24-3p的异构体isomiR-1，空肠弯曲杆菌阳性鸡与阴性鸡的比值为5.75，表明gga-miR-24-3p的异构体isomir-1与空肠弯曲杆菌感染密切相关。
5)采用本发明内容所述的检测方法，经RT-qPCR获得荧光定量结果，空肠弯曲杆菌阳性鸡与阴性鸡的比值为6.34，与测序结果5.75非常接近，表明本发明的检测方法可以准确检测并定量gga-miR-24-3p的异构体isomiR-1，在家禽抗病育种中具有潜在应用价值。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 山东农业大学
<120> 一种鸡感染空肠弯曲杆菌的分子标记及检测方法和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> RNA
<213> 异构体(isomiR-1)
<400> 1
uggcucaguu cagcaggaac acuu 24
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 鸡盲肠组织(gga-miR-24-3p)
<400> 2
uggcucaguu cagcaggaac ag 22
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactgttcc 50
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgtggctca gttcagca 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agtgcagggt ccgaggtatt 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cacgccactt ccaagttcga g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaatctgctg caaacacgca t 21
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