蒙古羊繁殖力相关基因bmp15的分子标记的特异性引物及应用
技术领域
本发明属于分子生物学
技术领域
，具体涉及蒙古羊繁殖力相关基因BMP15的分子标记的特异性引物及应用。背景技术
蒙古羊(Ovis aries)是我国三大粗毛羊品种之一，主要分布在内蒙古、东北、华北和西北等地，蒙古羊是包括苏尼特羊、乌珠穆沁羊、呼伦贝尔羊、滩羊、巴音布鲁克羊、小尾寒羊、多浪羊和湖羊等中国短尾、肥尾羊品种的共同祖先。其中乌珠穆沁羊产于内蒙古自治区锡林郭勒盟东北部乌珠穆沁草原，具有增膘快、蓄积脂肪能力强、产肉率高、性成熟早等特性，经过长期选育而逐渐形成蒙古羊系统中最主要的良种肉羊。苏尼特羊产于内蒙古自治区锡林郭勒盟苏尼特左旗和苏尼特右旗，有戈壁羊之称，具有很强的适应能力，在终年放牧不补任何伺料的条件下都能很快抓膘，而且肌肉丰满，体格壮大，肉质细嫩，无膻味，口感好，有较高的繁殖力，因而名扬全国。
多胎性状是蒙古羊重要的经济性状，对于蒙古羊养殖产业的发展具有极其重要的意义，因此提高多肽性状是提升蒙古羊养殖业经济效益的重要方向。
BMP15(bone morphogenetic protein15)即骨形态发生蛋白15，又称骨形成蛋白15，是具有高度保守性的功能蛋白，属于TGF-β家族。BMP15蛋白作为一种卵母细胞分泌因子,主要在雌性动物卵母细胞中表达并被分泌到胞外,通过结合到卵母细胞周围颗粒细胞/鞘细胞膜上的特异性受体行使生物学功能。绵羊BMP15基因位于X染色体的Xp24位置上，全长为6490bp，两个外显子中间被一个内含子隔开，共编码393个氨基酸残基的前蛋白，其成熟活性肽为125个氨基酸。有研究发现BMP15能激活卵母细胞周围颗粒细胞中c-Kit配体Kit-L(Kit ligand)326的表达，Kit-L也能通过旁分泌作用于卵母细胞上的cKit受体，反向抑制BMP15的表达，这样在卵母细胞的BMP15和周围颗粒细胞的Kit-L之间形成一个负反馈调节环路，两者最终达到一个动态平衡状态。卵泡发育过程中，BMP15作为卵母细胞分泌因子参与调节卵泡内细胞间的信号串联与对话,促进卵母细胞自身发育,以及颗粒细胞的生长与分化,进而促进卵泡的发育。还有研究采集了79个接受卵胞浆内单精子显微注射助孕女性的卵子和卵泡液，通过Western-blot或放射免疫的方法检测了卵泡液中BMP15、FSH、雌二醇(estradiol,E2)和孕酮(progesterone,P4)的水平,结果表明,卵泡液中BMP15的蛋白水平与E2的水平呈正相关，此外卵子的体外受精率卵裂率和形成移植的胚胎质量也与卵泡液中BMP15的水平呈正相关，这表明卵泡液中BMP15的含量可以作为预测卵子质量和胚胎发育成功率的一种潜在因子。还有研究通过向体外培养的大鼠原代GCs和人GC细胞系COV434中添加信号通路抑制剂，证明了BMP15参与激活ERK1/2信号通路调控大鼠颗粒细胞有丝分裂；BMP15和GDF9可增强卵丘细胞类EGF受体的表达，从而促进卵丘细胞扩散并参与了一个SMAD2/3依赖的途径；BMP15通过FSH介导调控卵巢固醇类激素(E2和P4)合成和LHR(luteinizing hormone receptor)表达,说明BMP15是cAMP-PKA激素合成信号通路的上游调调控因子，同时会对LHR介导的促进卵泡生长，排卵调控。所以认为BMP15基因是影响哺乳动物排卵率和产仔数的重要基因。
单核苷酸多态性标记(Single nucleotide polymorphism,SNP)是指单个核苷酸发生改变而引起的DNA序列多态性，具有数量多、密度大、遗传稳定性高等优点而被广泛应用。将这些遗传标记与生长性状相关联，从而实现在DNA水平上进行选择育种，有效的避免人为影响并提高选择育种的准确性，并且可实现在早期鉴定出具有优良性状的个体，筛选出优良的后备亲本，缩短育种周期，大大加快选育进程。
1991年BMP15基因的突变体在Inverdale基因中被发现，同年Davis等人采用经典分离法将FceX基因定位在了Romney羊X染色体上,因其携带者杂合型能增加母羊多肽性状，所以这个基因突变体被命名为Inverdale多胎位点(FecXI)。1995年，Davis等在Romney羊多胎品系中证明了FecXI位点的存在从而开始了对这一基因及其这一位点广泛而系统的研究。将FceX基因定位于X染色体中间一个10cM的位置上，该区域相当于人类X染色体Xp112-114。绵羊BMP15基因被定位在X染色体10cM区域，与FecXI(多产X基因)为同一区域，后来证实其为BMP15基因突变体。Galloway等研究发现X染色体上BMP15基因的突变与Inverdale和Hanna绵羊品种杂合子携带母羊的高排卵数和纯合子携带母羊的不育相关联，纯合子FecXGr/FecXGr-Grivette和纯合子FecXO/FecXO-Olkuska母羊具有高增殖性而非不育。还研究发现，B1突变没有改变Belclare和Cambridge绵羊BMP15的功能，但可以提高蒙古羊的平均多肽性状，而且B2和B4突变将会导致Belclare和Cambridge绵羊纯合型个体不育，而杂合型个体则排卵较多。绵羊Tunisian Barbarian BMP15 cDNA中3bp缺失(c.302_304delCTA)和c插入(c.310insC)导致蛋白质位置101的帧移位,增加了绵羊Tunisian Barbarian的排卵率和多肽性状。因此，不同的绵羊品种中BMP15的功能不尽相同。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蒙古羊繁殖力相关基因BMP15的分子标记的特异性引物。
本发明的再一目的在于提供上述特异性引物的应用。
本发明采用DNA测序技术检测待测蒙古羊基因组中的BMP15基因2号外显子区是否存在g.50980656T>C突变位点，以确定蒙古羊个体在上述位点的基因型，以比较BMP15基因g.50980656T>C在蒙古羊品种中的多态性。所述的BMP15基因的核苷酸序列NCBI ReferenceSequence为NC_019484.2的羊X染色体，第50979729bp到50989218bp区域。
BMP15基因突变位点的命名是使用HGVS(Human Genome Variation Society)命名法命名为：NC_019484.2：g.50980656T>C。
根据本发明
具体实施方式
的蒙古羊繁殖力相关基因BMP15的分子标记的特异性引物，所述引物序列如下：
SEQ ID NO.1：5′-ATTTTGTGGCATCTCCAACC-3′；
SEQ ID NO.2：5′-ACCCCAAACCGTCTAGATCC-3′。
本发明提供基因BMP15的分子标记的特异性引物的应用，例如，基因BMP15的分子标记的特异性引物在辅助蒙古羊育种中的应用，或者基因BMP15的分子标记的特异性引物在筛选多胎性状的蒙古羊种羊方面的应用，或者基因BMP15的分子标记的特异性引物在筛选多胎性状的蒙古羊种羊的试剂盒方面的应用。
根据本发明具体实施方式的提高蒙古羊繁殖力的方法，所述方法包括利用上述的特异性引物扩增蒙古羊基因组DNA的步骤。
根据本发明具体实施方式的提高蒙古羊产羔数的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待测蒙古羊的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的蒙古羊的基因组DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
(3)判断扩增产物中蒙古羊基因组BMP15基因所在X染色体的第50980656个碱基的基因型，选择BMP15基因第50980656个碱基为TC基因型的蒙古羊，作为育种的亲本。
当筛选具有多胎性状的蒙古羊种羊时，按照上述方法的步骤，即
(1)提取待测蒙古羊的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的蒙古羊的基因组DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
(3)判断扩增产物中蒙古羊基因组BMP15基因第50980656个碱基的基因型，选择BMP15基因第50980656个碱基为TC基因型的蒙古羊，筛选得到具有多胎性状的蒙古羊种羊。
所述蒙古羊基因组中的BMP15基因g.50980656T>C突变位点的检测方法为，利用PCR方法扩增蒙古羊X染色体基因组GenBank Accession Number为NC_019484.2的50979978到50981664位核苷酸片段，并将扩增产物进行DNA测序，若在BMP15基因第50980656个碱基的位置出现单峰且基因型为T，那么此基因型为TT，如果在BMP15基因第50980656个碱基的位置出现套峰，那么此基因型为TC，若在BMP15基因第50980656个碱基的位置出现单峰且基因型为C，那么此基因型为CC。
g.50980656T>C的TC基因型蒙古羊的平均多胎性状高于TT基因型。
本发明中，所述多胎性状为每胎的产羔数；蒙古羊的繁殖力具体体现为每胎生产的羊羔数。
根据本发明具体实施方式的提高蒙古羊繁殖力的方法，步骤(2)PCR扩增时，扩增体系的总体积50μL，其中，上下游引物各1μL，模版2μL，预混液25μL，去离子水21μL。
根据本发明具体实施方式的提高蒙古羊繁殖力的方法，步骤(2)的PCR扩增程序为，94℃预变性5min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环，72℃延伸10min。
本发明的有益效果：
本发明发现BMP15基因(其核苷酸序列NCBI Reference Sequence为NC_019484.2的羊X染色体，第50979729bp到50989218bp区域)2号外显子区存在g.50980656T>C突变位点，该位点是与蒙古羊多胎性状相关的分子标记。
本发明设计特异性引物，采用DNA测序技术检测蒙古羊基因组中的BMP15基因2号外显子区是否存在g.50980656T>C突变，通过确定蒙古羊个体在该位点的基因型，实现对BMP15基因g.50980656T>C的单核苷酸多态性检测，以比较BMP15基因g.50980656T>C位点在蒙古羊品种中的多态性。
数据统计结果表明，本发明的特异性引物能够检测该分子标记，从而可以用于辅助蒙古羊育种，提高蒙古羊的产羔数，本发明的方法可作为辅助提高蒙古羊多胎性状的有效方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是BMP15的NC_019484.2：g.50980656T>C位点的测序结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1确定蒙古羊双羔率的分子标记
1)模板材料准备
采集蒙古羊的血样并记录胎次，所采集的250只蒙古羊样本选自内蒙古自治区苏尼特左旗和东乌珠穆沁旗，将血样保存在抗凝管中，待用。
2)PCR产物测序
对所采集的250只蒙古羊进行PCR产物测序，找到了位于BMP15 X染色体SNP位点，即NC_019484.2：g.50980656T>C位点。
3)引物设计
根据GeneBank报道的绵羊基因序列(GeneBank收录号：NC_019484.2)，本发明自行优化上下游引物M-F和M-R，序列如下：
M-F：5′-ATTTTGTGGCATCTCCAACC-3′；
M-R：5′-ACCCCAAACCGTCTAGATCC-3′。
以蒙古羊实验材料提取的基因组为模板，分别用上述引物进行扩增。扩增体系如下引物和引物的扩增体系相同。扩增体系的总体积50μL，其中，上下游引物各1μL，模版2μL，预混液25μL，去离子水21μL。
扩增含有g.50980656T>C突变位点的核苷酸片段流程：94℃预变性5min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存，进行测序。
PCR产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
ATTTTGTGGCATCTCCAACCCAGATTTGAAGCAATAGCAGACCATACCCCCCAATATTGGACTGTCACCCTAAAGCTGCCACTATATAGTGATATAGCATGAGGATTTATTATTAATTCGTATGTTTCAATGATCCTCTTAATTGGTCACCTTTTTAATAGTCAGCTAAATAATACAATATATACAGACAGTTCTGTATTTGAGGTGTTTTTCTCCGTCTAGGGGTATGAGTGATCTAAAAATGAGCCACAATTTGTCATCTTAAGGGAAAAAGACTTGGACTCAAATCTTTATTCTAACAAACACTGGCTTGTGTGTCCTCTGGCATAGCTTCTCTGAGCTTCAGTTTCCTCGTCTGCAAAATGGGAATAGCAACTATCTCATAAGGCTATTGTGGATTCAAGAGCAAATGCATGTAAAGCATCTAATACATTATATAAGTGCTCAATAGATCGCTATTATGATCTTAAATTCATCTCAAGGCTGCTTGTCAGTTTGTACTGAGCAGGTCTGTTAGAGAGACTAAGGCTAGGATATAAGAAGCTAACGCTTTGCTCTTGTTCCCTCTTACTAATGCAGGCTCCTGGCACATACAGACCCTGGACTTTCCTCTGAGACCAAACCGGGTAGCATACCAACTAGTCAGAGCCACTGTGGTTTACCGCCATCAGCTTCACCTAACTCATTCCCACCTCTCCTGCCATGTGGAGCCCTGGGTCCAGAAAAGCCCAACCAATCACTTTCCTTCTTCAGGAAGAGGCTCCTCAAAGCCTTCCCTGTTGCCCAAAACTTGGACAGAGATGGATATCATGGAACATGTTGGGCAAAAGCTCTGGAATCACAAGGGGCGCAGGGTTCTACGACTCCGCTTCGTGTGTCAGCAGCCAAGAGGTAGTGAGGTTCTTGAGTTCTGGTGGCATGGCACTTCATCATTGGACACTGTCTTCTTGTTACTGTATTTCAATGACACTCAGAGTGTTCAGAAGACCAAACCTCTCCCTAAAGGCCTGAAAGAGTTTACAGAAAAAGACCCTTCTCTTCTCTTGAGGAGGGCTCGTCAAGCAGGCAGTATTGCATCGGAAGTTCCTGGCCCCTCCAGGGAGCATGATGGGCCTGAAAGTAACCAGTGTTCCCTCCACCCTTTTCAAGTCAGCTTCCAGCAGCTGGGCTGGGATCACTGGATCATTGCTCCCCATCTCTATACCCCAAACTACTGTAAGGGAGTATGTCCTCGGGTACTACACTATGGTCTCAATTCTCCCAATCATGCCATCATCCAGAACCTTGTCAGTGAGCTGGTGGATCAGAATGTCCCTCAGCCTTCCTGTGTCCCTTATAAGTATGTTCCCATTAGCATCCTTCTGATTGAGGCAAATGGGAGTATCTTGTACAAGGAGTATGAGGGTATGATTGCCCAGTCCTGCACATGCAGGTGACGGCAAAGGTGCAGCTAGCTCAGGTTTGCCCAAGAAATTCGAAAAGGATTTATAATAAATACTGTTAAATCTGAGAGTGCTCAACCCAAGTGCTCTACCCAATCTGTAGATTCTATTCCTTGCCTTCAGCATTGTACTTTAAGTCTTCTTCCCCTATTTATGAGTGCCTCACTTTATAAACAGTTCTGATGCCAAATATCAGTATGTTTTGACCACTAGTCAATCTTCTGAGGATCTAGACGGTTTGGGGT
测序结果如图1所示，若在BMP15基因第50980656个碱基的位置出现单峰且基因型为T，那么此基因型为TT，如果在BMP15基因第50980656个碱基的位置出现套峰，那么此基因型为TC，若在BMP15基因第50980656个碱基的位置出现单峰且基因型为C，那么此基因型为CC。
实施例2分析BMP15基因型与蒙古羊的多胎性状关系
2.1BMP15基因型检测
按照实施例1设计的引物对蒙古羊进行基因检测，并计算了蒙古羊的基因型频率和等位基因频率，统计结果如表1。
表1蒙古羊g.50980656T>C位点基因型频率和等位基因频率的分布
注：括号内是样本数。
表1结果表明，g.50980656T>C突变位点在蒙古羊群体中体现出多态性。
2.2关联性分析
(1)对所选试验样本群体中的该位点进行个体基因型分析，计算等位基因频率和基因型频率，进行χ2检验。
(2)根据试验结果计算上述位点的基因频率与基因型频率，并对这个位点基因型的分布进行Hardy-Weinberg平衡的卡方适合性检验。使用SPSS 19.0的单因素方差分析对蒙古羊群体多胎性状与BMP15基因型的关联性分析。
表2不同基因型与蒙古羊多胎性状的估计值及标准误差
注：数值以平均值±标准误差表示；同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
由表2可知，g.50980656T>C的TC基因型蒙古羊的平均每胎产羔数显著高于TT基因型(P<0.05)。该结果表明，可利用这个位点的基因型筛选高多胎性状的蒙古羊种羊。
实施例3筛选多胎性状蒙古羊的方法
本实施例的提高蒙古羊繁殖力的方法，法包括以下步骤：
(1)提取待测蒙古羊的基因组DNA；
(2)用特异性引物进行PCR扩增；
从蒙古羊实验材料提取的基因组为模板，用实施例1所述引物进行扩增，扩增体系的总体积50μL，其中，上下游引物各1μL，模版2μL，预混液25μL，去离子水21μL。
扩增含有g.50980656T>C突变位点的核苷酸片段流程：94℃预变性5min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环，72℃延伸10min。
4℃保存扩增产物，进行测序。
判断扩增产物中蒙古羊基因组中BMP15基因第50980656个碱基的基因型，选择BMP15基因第50980656个碱基为TC基因型蒙古羊，作为育种的亲本。
同时，选择BMP15基因第50980656个碱基为TC基因型蒙古羊，可以筛选得到具有多胎性状的蒙古羊。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 内蒙古大学
锡林郭勒盟蒙之原牧业有限公司
锡林浩特市种畜繁育中心
<120> 蒙古羊繁殖力相关基因BMP15的分子标记的特异性引物及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attttgtggc atctccaacc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accccaaacc gtctagatcc 20
<210> 3
<211> 1687
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attttgtggc atctccaacc cagatttgaa gcaatagcag accatacccc ccaatattgg 60
actgtcaccc taaagctgcc actatatagt gatatagcat gaggatttat tattaattcg 120
tatgtttcaa tgatcctctt aattggtcac ctttttaata gtcagctaaa taatacaata 180
tatacagaca gttctgtatt tgaggtgttt ttctccgtct aggggtatga gtgatctaaa 240
aatgagccac aatttgtcat cttaagggaa aaagacttgg actcaaatct ttattctaac 300
aaacactggc ttgtgtgtcc tctggcatag cttctctgag cttcagtttc ctcgtctgca 360
aaatgggaat agcaactatc tcataaggct attgtggatt caagagcaaa tgcatgtaaa 420
gcatctaata cattatataa gtgctcaata gatcgctatt atgatcttaa attcatctca 480
aggctgcttg tcagtttgta ctgagcaggt ctgttagaga gactaaggct aggatataag 540
aagctaacgc tttgctcttg ttccctctta ctaatgcagg ctcctggcac atacagaccc 600
tggactttcc tctgagacca aaccgggtag cataccaact agtcagagcc actgtggttt 660
accgccatca gcttcaccta actcattccc acctctcctg ccatgtggag ccctgggtcc 720
agaaaagccc aaccaatcac tttccttctt caggaagagg ctcctcaaag ccttccctgt 780
tgcccaaaac ttggacagag atggatatca tggaacatgt tgggcaaaag ctctggaatc 840
acaaggggcg cagggttcta cgactccgct tcgtgtgtca gcagccaaga ggtagtgagg 900
ttcttgagtt ctggtggcat ggcacttcat cattggacac tgtcttcttg ttactgtatt 960
tcaatgacac tcagagtgtt cagaagacca aacctctccc taaaggcctg aaagagttta 1020
cagaaaaaga cccttctctt ctcttgagga gggctcgtca agcaggcagt attgcatcgg 1080
aagttcctgg cccctccagg gagcatgatg ggcctgaaag taaccagtgt tccctccacc 1140
cttttcaagt cagcttccag cagctgggct gggatcactg gatcattgct ccccatctct 1200
ataccccaaa ctactgtaag ggagtatgtc ctcgggtact acactatggt ctcaattctc 1260
ccaatcatgc catcatccag aaccttgtca gtgagctggt ggatcagaat gtccctcagc 1320
cttcctgtgt cccttataag tatgttccca ttagcatcct tctgattgag gcaaatggga 1380
gtatcttgta caaggagtat gagggtatga ttgcccagtc ctgcacatgc aggtgacggc 1440
aaaggtgcag ctagctcagg tttgcccaag aaattcgaaa aggatttata ataaatactg 1500
ttaaatctga gagtgctcaa cccaagtgct ctacccaatc tgtagattct attccttgcc 1560
ttcagcattg tactttaagt cttcttcccc tatttatgag tgcctcactt tataaacagt 1620
tctgatgcca aatatcagta tgttttgacc actagtcaat cttctgagga tctagacggt 1680
ttggggt 1687
