一种马氏珠母贝类胡萝卜素含量相关的Pm-SRB基因SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及海水珍珠贝分子辅助育种
技术领域
，特别是一种马氏珠母贝类胡萝卜素含量相关的Pm-SRB基因SNP分子标记及其应用。背景技术
类胡萝卜素通常是指C40的碳氢化合物和它们的氧化衍生物两大类色素的总称。类胡萝卜素色泽鲜亮、着色力强，已广泛应用于着色剂、饲料添加剂。除了作为功能食品外，还有抗氧化的功能，如清除氧自由基抗氧化延缓衰老等。近年来，人们把对类胡箩卜素的研究从高等植物、藻类与微生物方面逐渐转移到动物体身上并取得了一些进展。类胡萝卜素在动物体内起着重要生理作用的脂溶性有机化合物，有助于增强动物体的免疫力，其在预防癌症、心血管疾病、骨质疏松症及其他慢性疾病方面起着很重要的作用。
随着科学技术的发展，在类胡萝卜素代谢机制方面的研究不断深入。研究初步表明，海洋贝类体内各组织均含有丰富的类胡萝卜素，贝类的抗逆性与体内的类胡萝卜素含量存在明显相关性，如虾夷扇贝新品种“海大金贝”，与普通扇贝相比，该品种因富含类胡萝卜素而具有更良好的抗逆性。我们前期研究发现，马氏珠母贝体内类胡萝卜素含量存在明显差异，而且珍珠收获期类胡萝卜素含量高的个体成活率较高。因此，如何有效筛选与类胡萝卜素显著相关分子标记，获得类胡萝卜素含量高的基因型，为培育马氏珠母贝新品系提供指导。
发明内容
本发明的目的是提供一种马氏珠母贝类胡萝卜素含量相关Pm-SRB基因的SNP标记方法及其应用，通过利用马氏珠母贝Pm-SRB基因的一个与类胡萝卜素含量相关的单倍型SNP标记进行亲本筛选与鉴定。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种马氏珠母贝类胡萝卜素含量相关的SRB基因SNP分子标记，包含：
第1个SNP分子标记，所述第1个SNP标记为碱基A或G，所述SNP标记位于核酸的第1102位，所述核酸具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列；
第2个SNP分子标记，所述第2个SNP标记为碱基A或G，所述SNP标记位于核酸的第1143位，所述核酸具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列；
第3个SNP分子标记，所述第3个SNP标记为碱基T或C，所述SNP标记位于核酸的第1154位，所述核酸具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列；
第4个SNP分子标记，所述第4个SNP标记为碱基G或A，所述SNP标记位于核酸的第1642位，所述核酸具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
一种马氏珠母贝类胡萝卜素含量相关的Pm-SRB基因SNP分子标记在马氏珠母贝选育亲本中应用。
进一步的，所述马氏珠母贝选育亲本是筛选类胡萝卜素含量高的亲本，用于繁育子代群体。
进一步的，一种马氏珠母贝类胡萝卜素含量相关的Pm-SRB基因SNP分子标记的应用，具体包括如下步骤：
(1)从基础群体选取性腺成熟的个体作为候选亲本，取样闭壳肌组织，提取基因组DNA；
(2)将提取得到的基因组DNA作为模板，利用引物进行PCR扩增，进行序列检测分析，确定候选亲本每个SNP位点的基因型；
(3)分析每个候选亲本的单倍型基因组合，筛选单倍型AATT的个体作为育种亲本。
进一步的，所述PCR扩增的引物序列。
进一步的，所述步骤(1)中提取基因组DNA的方法，包括以下步骤：
(1)取0.1g闭壳肌组织，剪碎组织，加入人工配制的海水混匀，离心2min，转速设为4000r/min，弃上清，加入200μl缓冲液，混匀；
(2)向上述200μl样品中加入400μl裂解液和10μl蛋白酶K，混匀，置于55℃恒温水浴4-5h，消化完全后加入600ml氯仿，离心5min，转速为12000r/min，吸取上清400μl于灭菌的1.5ml离心管中，加入500μl沉淀液混匀，静置2min，离心5min，转速设为12000r/min，弃上清，立即加入100μl浓度为1.2mol/L的NaCl溶液，轻轻震荡，使DNA沉淀完全溶解；
(3)加入RNA酶6μl，水浴37℃5-10分钟，提前-20℃预冷后加入300μl冰乙醇，混匀，-20℃放置10min，离心5-8min，转速为10000r/min，倒掉乙醇，用70％冰乙醇300μl洗一次，离心5min，转速为10000r/min，倒掉乙醇，倒置于滤纸上室温干燥30min；
(4)DNA用200μl双蒸水溶解，4℃分装保存。
进一步的，所述步骤(3)中单倍型基因组合分析过程需要关联类胡萝卜素含量进行分析。
进一步的，所述类胡萝卜素含量需测试，测试方法如下：
(1)从基础群体选取性腺成熟的个体作为候选亲本，剪取闭壳肌，真空冷冻干燥机内进行干燥36小时，直至组织重量不再变化；
(2)取0.1g干燥后的组织用研钵研磨成粉状物后置于15mL离心管中，加入分析纯丙酮5mL，室温下暗处，以200r/min转速震荡2小时，然后室温离心10min，取上清液；
(3)重复步骤(2)一次，合并两次提取液，测定吸光值，计算类胡萝卜素含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过对马氏珠母贝的SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的突变位点进行SNP分子标记，将与类胡萝卜素含量显著关联的基因序列的SNP位点进行单倍型分析，发现单倍型AAAT的类胡萝卜素含量显著高于GAAT与AGGC单倍型。本发明的方法提高了马氏珠母贝亲本筛选的准确性，可以获得类胡萝卜素含量高而且遗传稳定马氏珠母贝亲本。
具体实施方式
实施例1
(一)取样及处理
1、基因组DNA提取
从北海涠洲岛地理群体收集个体作为亲本繁育1个基础群体。在贝龄为2龄的选育群体中随机选取220个体，剪取闭壳肌，每个放入2mL的离心管，加75％乙醇固定，放入液氮速冻后，-80℃保存。
取0.1g闭壳肌组织，剪碎组织，加入人工配制的海水混匀，离心2min，转速设为4000r/min，弃上清，加入200μl缓冲液，混匀；向上述200μl样品中加入400μl裂解液和10μl蛋白酶K，混匀，置于55℃恒温水浴4-5h，消化完全后加入600ml氯仿，离心5min，转速为12000r/min，吸取上清400μl于灭菌的1.5ml离心管中，加入500μl沉淀液混匀，静置2min，离心5min，转速设为12000r/min，弃上清，立即加入100μl浓度为1.2mol/L的NaCl溶液，轻轻震荡，使DNA沉淀完全溶解；加入RNA酶6μl，水浴37℃5-10分钟，提前-20℃预冷后加入300μl冰乙醇，混匀，-20℃放置10min，离心5-8min，转速为10000r/min，倒掉乙醇，用70％冰乙醇300μl洗一次，离心5min，转速为10000r/min，倒掉乙醇，倒置于滤纸上室温干燥30min；DNA用200μl双蒸水溶解，4℃分装保存。
2、总类胡萝卜素含量检测
(1)将上述冷冻保存的闭壳肌，在真空冷冻干燥机内进行干燥36小时，直至组织重量不再变化；
(2)取0.1g干燥后的组织用研钵研磨成粉状物后置于15mL离心管中，加入分析纯丙酮5mL，室温下暗处以200r/min震荡萃取两小时，然后室温离心10min，取上清液；
(3)重复(2)中操作一次，合并两次提取液，测定吸光值。
总类胡萝卜素含量的测定参照公式如下：
总类胡萝卜素含量(μg/g)＝A×K×V/E×G，其中A是吸光度值；K是常数(104)；V是提取液丙酮体积(mL)；E是摩尔消光系数(2500)；G是闭壳肌质量(g)。
(二)SNP分子标记的检测
1、引物设计
基于马氏珠母贝全基因组序列，使用Primer 3online设计引物序列，如表1。
表1引物序列
2、PCR扩增与检测
以设计的引物序列对样品的DNA进行扩增，检测扩增得到的基因片段的SNP位点的基因型。具体为：使用NaOH将双链DNA文库变性为单链，合成第一链；以合成的第一链为模板进行35循环PCR扩增，扩增产物测序分析。
上述SNP位点扩增使用的反应体系为：1μL 10×buffer、0.8μL dNTP(2.5mM)、2μLDNA、1μL1μM上下游引物、0.1μL酶(5U/μL)与3.1μL灭菌双蒸水。
扩增条件为：95℃预变性15min；94℃变性30s，退火90s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10mins。
(三)SNP位点基因型与性状关联分析
使用GLM方法构建线性模型进行SNP位点分型数据和类胡萝卜素含量的关联分析，具体模型为Y＝μ+Gi+eij式中，Y为性状观察值，μ为平均数，Gi为SNP效应值，eij为随机误差。
使用Haploview对显著相关的SNP位点进行单倍型分析。
结果显示，在外显子区共4个SNPs与类胡萝卜素性状显著相关(P<0.05)。其SNP位点的基因频率与类胡萝卜素含量的关联分析结果如表2所示。
表2 Pm-SRB外显子区SNP位点与类胡萝卜素含量关联分析
注：同一SNP位点不同上标字母表示不同基因型间差异显著(P<0.05)。“-”表示基因型个体数少于总个体数的5％，不参与多重比较。
由表2可知，SNP位点为AATT基因型的个体的类胡萝卜素含量显著大于其他基因型，可见，该基因核苷酸序列的位点AATT与类胡萝卜素含量显著相关，因此，通过选留基因型组合AATT/AATT的个体为育种亲本，培育富含类胡萝卜素含量的养殖新品系。
上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。
序列表
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