一种评估四川牦牛肉牛肉品质性状中背膘厚和剪切力的方法
技术领域
本发明涉及家畜的分子育种
技术领域
，具体地，涉及一种评估四川牦牛肉牛肉品质性状中背膘厚和剪切力的方法。背景技术
随着我国畜牧业不断稳定、持续地高速增长，目前我国的奶牛业经过发展已经有一定的规模和基础，而肉牛业仍处于起步阶段。但随着国家经济的发展，国民的经济消费能力的不断提升以及国民对健康饮食的不断追求，肉牛业得到了迅速的发展，是畜牧业中增长速度最快的产业之一。
我国牦牛资源丰富，占世界总数的95％以上，主要分布在四川、西藏、青海等地。牦牛虽然在肉牛中所占的比例不大，但它却是适应青藏高原特殊生态环境下的优势畜种，为当地牧民提供着奶、肉、毛、绒、皮革、役力、燃料等生产生活必需品，与藏文化息息相关，是当地牧民赖以生存和发展的物质基础，也是当地畜牧业经济中不可缺少的重要畜种。牦牛体质粗壮结实，体躯高大，心肺发达，肌肉紧凑，身长腿短，筋骨结实，抗寒力强，还能为人们提供成本低且具有独特风味的牦牛肉，牦牛肉的蛋白质含量比普通黄牛肉高9.4％，脂肪含量比普通黄牛肉低3.5％，且肉色鲜红，人体必需氨基酸含量丰富，种类齐全，接近联合国粮农组织(FAO)提出的理想蛋白是一种优质蛋白来源。
牦牛肉具有绿色安全无公害，营养价值丰富的特点，富含人体所必需的氨基酸和多不饱和脂肪酸(PUFA)，且n-6PUFA和n-3PUFA组成比例合理，形成了独特的风味。牦牛肉的脂肪含量较同龄的其他品种牛偏低，但其多不饱和脂肪酸含量显著高于普通黄牛，含有黄牛肉中未检出的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。除此之外，其微量元素含量丰富，不仅含有人体所必需的钙、镁、磷、钠、钾等常量元素，还含有锌、锰、铜、铁等微量元素，其中铁元素含量更是显著高于西门塔尔牛等黄牛品种，是一种绿色健康的天然食品，有着良好的营养价值及经济价值。
生活在无污染环境中，以天然牧草为食的四川牦牛肉被视为天然绿色食品，符合人们对健康生活的向往，符合人们对绿色健康食品的追求，从而逐渐受到人们的关注。四川牦牛是高山地区特有牛种，适应严寒、缺氧等恶劣环境，有一定的产乳量和产肉量，但就其肉品质而言，仍有巨大的发展潜力。
过氧化物酶增殖激活受体γ辅激活因子-1β(Peroxisome Proliferator-activated Receptor gamma,Coactivator 1beta,PPARGC1B,or PGC-1β)属于类固醇、甲状腺、维甲酸受体超家族，是调节靶基因表达的核内受体的转录因子，在被配体激活时具有转录活性，进而可在转录水平上调控多种信号通路基因的表达。
根据其分子结构的不同，PPARGC1B目前可分为三个亚型，分别为PPARα、β(或δ)和γ。其中PPAR-γ家族的一员PPARGC1B作为能量代谢及平衡的关键调节因子，广泛分布于心脏、骨骼肌和棕色脂肪细胞等高氧化代谢组织，与过氧化物酶增殖激活受体γ(PPARG)、核呼吸因子-1(nuclear respiratory factor-1,NRF-1)等转录因子结合，在机体内发挥调节作用。除此之外，PPARGC1B基因还可以通过转录后的激活修饰作用参与调节，也可以通过激活核受体以及转录因子的下游基因的转录从而起到调节作用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种评估四川牦牛肉牛肉品质性状中背膘厚和剪切力的方法。
本发明的第一个目的是提供PPARGC1B基因第9外显子的分子标记E9-387 G>A和分子标记E9-554 T>C的分子标记组合的检测试剂在评估四川牦牛肉牛肉品质性状的中的应用。
本发明的第二个目的是提供一对PPARGC1B基因第9外显子的分子标记E9-387 G>A和分子标记E9-554 T>C的分子标记组合的检测引物在评估四川牦牛肉牛肉品质性状或制备评估四川牦牛肉牛肉品质性状的试剂盒中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种评估四川牦牛肉牛肉品质性状的方法。
本发明的第四个目的是提供PPARGC1B基因第9外显子的分子标记E9-387 G>A的检测试剂在评估四川牦牛肉牛肉剪切力性状的中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种评估四川牦牛肉牛肉剪切力性状的方法。
本发明的第六个目的是提供PPARGC1B基因第9外显子的分子标记E9-554 T>C的检测试剂在评估四川牦牛肉牛肉背膘厚性状的中的应用。
本发明的第七个目的是提供一种评估四川牦牛肉牛肉背膘厚性状的方法。
PPARGC1B基因在四川牦牛中存在的4个SNP位点单核苷酸多态性位点(分别为E9-189 A>C、E9-542 C>T、E9-387 G>A、E9-554 T>C)影响四川牦牛肉品质性状。其中E9-387 G>A(位于NC_037334.1：61175922，即ARS-UCD1.2版牛基因组的7号染色体的第61175922核苷酸，NC_037334.1：61175922)、E9-554 T>C(位于NC_037334.1：61176089，即ARS-UCD1.2版牛基因组的7号染色体的第61176089核苷酸，NC_037334.1：61176089)位点与牦牛肉品质性状关联紧密。E9-387 G>A优势基因型为GG，其个体剪切力指标显著高于GA基因型；E9-554 T>C优势基因型为TT，其优势基因型TT背膘厚显著低于其他基因型。
因此本发明要求保护PPARGC1B基因第9外显子的分子标记E9-387 G>A和分子标记E9-554 T>C的分子标记组合的检测试剂在评估四川牦牛肉牛肉品质性状的中的应用，
其中，分子标记E9-387 G>A位于NC_037334.1：61175922(即ARS-UCD1.2版牛基因组的7号染色体的第61175922核苷酸，NC_037334.1：61175922)，分子标记E9-554 T>C位于NC_037334.1：61176089(即ARS-UCD1.2版牛基因组的7号染色体的第61176089核苷酸，NC_037334.1：61176089)；
分子标记E9-387 G>A基因型为GG个体牛肉剪切力显著大于基因型为GA个体，
分子标记E9-554 T>C基因型为TT个体牛肉背膘厚显著小于基因型为TC个体。
以及，一对PPARGC1B基因第9外显子的分子标记E9-387 G>A和分子标记E9-554T>C的分子标记组合的引物在评估四川牦牛肉牛肉品质性状或制备检测四川牦牛肉牛肉品质性状的试剂盒中的应用，
所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示；
其中，分子标记E9-387 G>A位于NC_037334.1：61175922，分子标记E9-554 T>C位于NC_037334.1：61176089；
分子标记E9-387 G>A基因型为GG个体牛肉剪切力显著大于基因型为GA个体，
分子标记E9-554 T>C基因型为TT个体牛肉背膘厚显著小于基因型为TC个体。
其中，上游序列：5'-CACCACGCCTCCATACA-3'(SEQ ID NO:1)
下游序列：5'-TCAGGACTTGCCCATAACT-3'(SEQ ID NO:2)。
以及，一种评估四川牦牛肉牛肉品质性状的方法，检测PPARGC1B基因第9外显子的分子标记E9-387 G>A和分子标记E9-554 T>C的分子标记组合的基因型，
其中，分子标记E9-387 G>A位于NC_037334.1：61175922，分子标记E9-554 T>C位于NC_037334.1：61176089；
分子标记E9-387 G>A基因型为GG个体牛肉剪切力显著大于基因型为GA个体，
分子标记E9-554 T>C基因型为TT个体牛肉背膘厚显著小于基因型为TC个体。
优选地，使用所述的引物检测样本的所述的分子标记组合的基因型。
所述的方法在四川牦牛牛肉品质性状辅助育种中的应用，所述牛肉品质性状为背膘厚和/或剪切力，也属于本发明的保护范围。
本发明还要求保护PPARGC1B基因第9外显子的分子标记E9-387 G>A的检测试剂在评估四川牦牛肉牛肉剪切力性状的中的应用，
其中，分子标记E9-387 G>A位于NC_037334.1：61175922；
分子标记E9-387 G>A分子标记基因型为GG个体牛肉剪切力显著大于基因型为GA个体。
以及，一种评估四川牦牛肉牛肉剪切力性状的方法，检测PPARGC1B基因第9外显子的分子标记E9-387 G>A的基因型，
其中，分子标记E9-387 G>A位于NC_037334.1：61175922；
分子标记E9-387 G>A基因型为GG个体牛肉剪切力显著大于基因型为GA个体，
类似地，本发明还要求保护PPARGC1B基因第9外显子的分子标记E9-554 T>C的检测试剂在评估四川牦牛肉牛肉背膘厚性状的中的应用，
其中，分子标记E9-554 T>C位于NC_037334.1：61176089；
分子标记E9-554 T>C基因型为TT个体牛肉背膘厚显著小于基因型为TC个体。
以及一种评估四川牦牛肉牛肉背膘厚性状的方法，检测PPARGC1B基因第9外显子的分子标记E9-554 T>C的基因型，
其中，分子标记E9-554 T>C位于NC_037334.1：61176089；
分子标记E9-554 T>C基因型为TT个体牛肉背膘厚显著小于基因型为TC个体。
一种评估四川牦牛肉品质性状的试剂盒，含有所述试剂。
优选地，含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示引物。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以四川牦牛为对象，获得影响四川牦牛肉品质性状的分子标记。PCR扩增PPARGC1B基因的目的片段，通过直接测序的方法检测目的基因片段的单核苷酸多态性，分析其与四川牦牛肉品质性状的相关关系。为进一步构建优良高品质肉质性状的核心牛群奠定基础。
附图说明
图1为四川牦牛PPARGC1B基因混池扩增产物电泳图。
图2为四川牦牛PPARGC1B基因混池扩增产物测序结果。
图3为四川牦牛PPARGC1B基因个体PCR扩增产物电泳图。
图4为四川牦牛PPARGC1B基因SNPs位点(本实施例中未检测出E9-189 AA基因型和E9-554 CC基因型)。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 PPARGC1B基因序列扩增引物的设计及PPARGC1B基因序列的扩增
一、实验方法
1、样本的获得
本实施例选用的85头四川牦牛24～36月龄，来自四川省阿坝州，采集血液样品于-80℃冰箱储存，并提取各血液样本DNA。
2、引物设计与合成
根据Ensembl网站查询牛PPARGC1B基因序列(ENSBTAT00000068740.1)，使用Primer Premier 5.0软件设计引物，将所设计的引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物位置在目的基因的第9外显子上，引物序列如下。
上游序列：5'-CACCACGCCTCCATACA-3'(SEQ ID NO:1)
下游序列：5'-TCAGGACTTGCCCATAACT-3'(SEQ ID NO:2)。
3、混池PCR扩增及测序
85头四川牦牛各血液样本DNA混合，作为DNA混池，以DNA混池为模板扩增目的片段。PCR扩增反应体系为20μL，包括混池DNA模板1μL，上下游引物各0.4μL，Green Taq Mix10μL，去离子水8.2μL。PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，进行35个循环；72℃延伸5min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测确定条带长度正确后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
4、单个样品DNA扩增及测序
以单个样品DNA为模板扩增目的片段，总扩增85个样本。PCR扩增反应程序同混池PCR扩增程序一致。PCR扩增产物使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，确认条带清晰，无非特异性条带且长度正确后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
5、统计数据分析
采用SeqMan软件观察重叠峰；
二、实验结果
电泳结果显示DNA混池的PCR扩增产物条带清晰明亮，无抹带、引物二聚体以及非特异性扩增条带，引物扩增的PCR产物长度约为944bp，扩增产物长度与预期相符，如图1。可用于后续试验。
在混池PCR扩增测序结果中发现了2个重叠峰，测序结果如图2。2个SNP位点均位于该基因第9外显子上，分别为E9-189 A>C；E9-542 C>T。
而以四川牦牛单个血液DNA样品为模板进行PCR扩增，目的片段长度为944bp，测序结果如图3。得到的PCR扩增产物进行DNA电泳检测，通过凝胶电泳成像仪观察确认电泳条带均一、清晰，无抹带以及二聚体等异常条带出现。再进行下一步试验。
以85头四川牦牛的DNA个体样本为模板分别进行PCR扩增，电泳结果无异常后送公司进行测序。测序结果使用SeqMan软件逐一对重叠峰的SNP位点进行确定，最终在85个测序样品中确定了4个SNP位点(E9-189 A>C、E9-387 G>A、E9-542 C>T、和E9-554 T>C)，SNPs位点不同基因型如图4。
其中，分子标记E9-387 G>A位于NC_037334.1：61175922(即ARS-UCD1.2版牛基因组的7号染色体的第61175922核苷酸，NC_037334.1：61175922)，分子标记E9-554 T>C位于NC_037334.1：61176089(即ARS-UCD1.2版牛基因组的7号染色体的第61176089核苷酸，NC_037334.1：61176089)。
实施例2 PPARGC1B基因SNPs位点的群体遗传特性
一、实验方法
使用Popgene32软件计算等位基因的基因频率、基因型频率、遗传杂合度(H)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)；计算χ2值；利用SPSS 23.0软件的单因素方差中的多重比较分析对四川牦牛肉质性状和基因型间的关系进行差异显著性检验，当P<0.05时表示差异显著，P<0.01时表示差异极显著。试验数据用“平均值±标准误”表示。
二、实验结果
四川牦牛PPARGC1B基因4个SNP位点的基因型频率和基因频率分布情况如表1所示，其中E9-189 A>C位点的等位基因A和C的基因频率分别为0.0235、0.9765，等位基因C的基因频率明显高于等位基因A，在群体中属于优势基因，CC基因型的频率为0.9529，AC基因型的频率为0.0471；E9-387 G>A位点等位基因G和A的基因频率分别为0.9176、0.0824，等位基因G的基因频率明显高于等位基因A，在群体中属于优势基因，GG基因型的频率为0.8471，GA基因型的频率为0.1412，AA基因型的频率为0.0118；E9-542 C>T位点，等位基因C和T的基因频率分别为0.0294、0.9706，等位基因T的基因频率明显高于等位基因C，在群体中属于优势基因，TT基因型的频率为0.9529，CT基因型的频率为0.0353，TT基因型的频率为0.0118；E9-554 T>C位点等位基因T和C的基因频率分别为0.9647、0.0353，等位基因T的基因频率明显高于等位基因C，在群体中属于优势基因，TT基因型的频率为0.9294，TC基因型的频率为0.0706。4个SNPs的基因杂合度(H)和多态信息含量(PIC)均低于0.25，这表明该群体多态性在PPARGC1B基因中属于低度多态性；χ2检验说明，除E9-542 G>A位点外其余三个位点在四川牦牛群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)
表1 PPARGC1B基因4个SNPs的群体遗传特征分析结果
注：χ2值表示未达到显著水平(P>0.05)，χ2 0.05(df＝2)＝5.99，χ2 0.01(df＝2)＝9.21。
实施例3 PPARGC1B基因SNPs位点与四川牦牛肉品质性状的相关分析
一、实验方法
1、实施例1的85头四川牦牛来自于四川省阿坝州某牛场，采集了同一环境、相同饲养条件、同一时期的健康牦牛血液样品于-20℃保存，用于提取血液基因组DNA，收集相关肉品质性状数据并进行分析。
2、SPSS 23.0单因素方差分析四川牦牛肉品质性状与基因型的关联性。
二、实验结果
经SPSS 23.0单因素方差分析四川牦牛肉品质性状与基因型的关联性，结果见表2所示。与四川牦牛的肉品质性状相关性分析的结果表明：E9-387 G>A位点不同基因型与四川牦牛的剪切力性状存在显著相关，其优势基因型GG剪切力指标极显著高于其他基因型(P＜0.01)，但其组间指标如背膘厚、蒸煮损失、肉色(L*亮度、a*红度、b*黄度)、宰后45min pH值以及宰后24h pH值不存在显著差异(P＞0.05)；E9-554 T>C位点，携带野生纯合型(TT)个体背膘厚显著低于突变杂合基因型(TC)(P＜0.05)，但其组间指标如剪切力、蒸煮损失、肉色(L*亮度、a*红度、b*黄度)以及宰后45min pH值、宰后24h pH值不存在显著差异(P＞0.05)。
分析结果表明：E9-387 G>A、E9-554 T>C位点的不同基因型与四川牦牛肉品质性状中的剪切力、背膘厚具有显著相关性。E9-387 G>A优势基因型为GG，其个体剪切力指标显著高于GA基因型；E9-554 T>C优势基因型为TT，其优势基因型TT背膘厚显著低于其他基因型。
表2四川牦牛肉品质性状与基因型的关联性
注：同列同一指标中标有字母完全不同者表示差异显著(P<0.05或P<0.01)；标有相同字母或者不标字母者表示差异不显著(P>0.05)。
在E9-387 G>A位点，野生纯合基因型(GG)个体较于突变杂合基因型(GA)个体，其嫩度指标中的剪切力差异极显著，说明PPARGC1B基因对四川牦牛肉品质性状中的嫩度性状中的剪切力起一定的调节作用。
背膘厚是牛的重要胴体性状之一，其结果主要反映脂肪沉积量的多少，直接影响到嫩度、系水力、肉色等肉品质指标。本试验中E9-554 T>C位点突变杂合型(TC)个体的背膘厚为0.51±0.09cm，显著高于野生纯合型(TT)。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 广东海洋大学
<120> 一种评估四川牦牛肉牛肉品质性状中背膘厚和剪切力的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caccacgcct ccataca 17
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcaggacttg cccataact 19
