本发明提供了一种基于固相萃取检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法。所述方法包括单克隆抗体注射液的预处理和高效液相色谱检测的步骤;所述预处理的具体步骤如下:将所述单克隆抗体注射液上样至平衡后的固相萃取柱,收集初始流出液,再使用淋洗液进行淋洗,收集后续流出液,而后将所得初始流出液与后续流出液混合,浓缩干燥后复溶,得到待测样品;其中,所述固相萃取柱的填料为以Protein A为配基的亲和层析介质。该方法通过以ProteinA为介质的固相萃取技术,消除了单克隆抗体对吐温80检测结果的干扰,同时固相萃取与流动注射HPLC相结合,使得操作方法更加便捷,检测周期短,数据重现性好。