一种基于maldi-tof/tof和irms技术相结合进行大豆原产地溯源识别方法
技术领域
本发明属于农作物产地溯源
技术领域
，具体涉及一种基于MALDI-TOF/TOF和IRMS技术相结合进行大豆原产地溯源识别方法。背景技术
食品质量安全检测领域涉及两大质量安全问题——有毒有害物质的风险性问题和产品的真实性问题。关于食品有害物质的检测问题，国内外有大量文献报道的标准与检测方法检测食品中有毒有害物质，关于食品的品质的真实性问题，近十年来才引起国内外消费者的关注与重视，逐渐成为食品质量检测领域一大热点与难题。目前关于食品的真实性检测技术主要有紫外光谱、红外光谱等指纹图谱技术，原子吸收、发射、荧光等原子光谱技术，同位素质谱技术，高分辨质谱技术，核磁共振技术，拉曼光谱技术，以及20世纪九十年代兴起的组学技术，组学技术中的食品组学包括基于组学及表观基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学以及脂质组学等组学技术，在食品检验领域中蛋白质组学、代谢组学及脂质组学是常用的组学技术，可以通过这些组学技术判断食品的功效成分真假，食品营养成分含量问题，以及食品产地追踪溯源问题。在食品的产地溯源真实性鉴定领域之中，同位素质谱技术和组学技术是两类比较可靠的鉴别技术，但是运用组学技术对大豆进行产地溯源的方法和专利较少。
公开号为CN111272861A的专利申公开了一种食品中多肽的MALDI-TOF检测方法。该方法包括将多肽从食品基质中提取出来，排除干扰物质，利用MALDITOF MS检测获得到食品中多肽的分布情况，质谱工作条件为正离子模式下检测，337nmN2激光照射，能量设定50％-70％。本方法与传统多肽检测方法相比较，样品的前处理方法简单，对样品杂质具有较高容耐性，灵敏度好，精密度高，检测范围广，检测用时极短，信息量较大且分析方法简单。此外本方法可一次性检测多个样品，具有高通量特性。本发明提供的方法有利地为食品的营养评判、产地溯源鉴定、成分掺假及质量过程控制的快速检测提供保障。该方法用于鉴定食品中多肽以鉴别视频的产地，但是受限于部分食品中的多肽检测难度，同种产品不同产地的多肽检测难度较大，难于应用到大豆产地的溯源鉴定中。
公开号为CN111474275A的专利申请公开了一种基于矿物元素和稳定同位素的马铃薯产地溯源的方法，该方法为：分别采集内蒙古、黑龙江、新疆和四川四个省区马铃薯生产基地的马铃薯样品，并制备分析样品；测定得到的分析样品中铝、锰、铜、锌的含量，碳稳定同位素比值δ13C及氮稳定同位素比值δ15N；将测定结果带入判别模型，判断马铃薯样品的产地。本发明的马铃薯产地溯源的方法基于不同产地矿物元素和稳定同位素含量，可以利用客观的检测技术手段，说明不同马铃薯产品的来源，准确率不低于95.3％，填补了马铃薯溯源技术缺乏的空白，能为保护具有产地优势的马铃薯区域品牌提供数据支撑，避免以次充好的现象发生，具有广泛的应用前景。该方法无法对建立基于脂质组学的大豆产地溯源模型。
公开号为CN106560698A的专利申请公开了一种基于多种检测技术的植物产地鉴别方法，该发明联合近红外光谱、稳定同位素和微量元素数据鉴别武夷岩茶产地的方法，属于地理标志产品真实性识别
技术领域
，其目的在于解决单种检测数据无法代表产地溯源全部关键信息和不同类型检测数据在计量学方法中联合使用的数据匹配等问题。本发明基于最小二乘支持向量机(LS-SVM)模型，将近红外、稳定同位素和微量元素融合在一起建模分析，识别率最高，达100.0％，远高于单种数据所建立的LS-SVM判别结果，且对盲样的识别率达100％，具有较好应用前景。本发明亦适合对香榧、藕粉等其它植物样品产地进行鉴别，本发明对除茶叶外的植物，但是对于富含油脂的植物，近红外法并不适用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于MALDI-TOF/TOF和IRMS技术相结合进行大豆原产地溯源识别方法，通过MALDI-TOF/TOF这一新型的软电离生物质谱技术，并结合稳定同位素比值分析技术，建立基于MALDI-TOF/TOF和稳定同位素含量分析相融合的大豆原产地溯源识别方法，通过参考待检测大豆油样品的甘油三酯化合物高分辨质谱数据和大豆粉样品中水溶性蛋白质的稳定同位素比值，将两种数据融合后导入所述大豆产地溯源鉴定模型中，进行待检测大豆的产地溯源预测，提高大豆产地溯源的准确度。
为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案如下：
一种基于MALDI-TOF/TOF和IRMS(稳定同位素)技术相结合的大豆原产地溯源识别方法，包括如下步骤：
S1.标准样品制备：选取具有明确地区的不同产地的大豆样品，每个产地的所述大豆样品分别经压榨后得到标准大豆油样品和经研磨后得到标准大豆粉样品，并提取所述标准大豆粉样品的水溶性蛋白质作为靶向目标物，所述大豆样品来源于至少两个不同产地；
S2.标准样品的质谱数据和稳定同位素比值数据采集：用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪分别采集不同产地的所述标准大豆油样品的质谱数据信息，获得所述标准大豆油样品的高分辨质谱数据；以及用同位素质谱仪采集不同产地的所述标准大豆粉样品的水溶性蛋白质的质谱数据信息，获得所述水溶性蛋白质的稳定同位素比值数据；
S3.标准大豆油样品靶向化合物的确定：将步骤S2获得的高分辨质谱数据中的甘油三酯化合物质谱数据与脂类化合物数据库中的标准甘油三酯化合物数据进行匹配，确定所述标准样品的甘油三酯靶向化合物；
S4.大豆产地溯源鉴定模型建立：确定标准大豆油样品中甘油三酯靶向化合物后，将甘油三酯靶向化合物对应的甘油三酯化合物高分辨质谱数据通过分析软件进行归一化和平均处理，将同一产地大豆的标准大豆油样品归一化和平均处理后的数据和标准大豆粉样品的水溶性蛋白质的稳定同位素比值数据同时导入建模软件进行主成分分析法、偏最小二乘法- 判别分析法和正交偏最小二乘法回归分析法中的一种或多种方式处理，然后依次将不同产地大豆的标准大豆油样品归一化和平均处理后的数据和标准大豆粉样品的水溶性蛋白质的稳定同位素比值数据均导入建模软件中，以获得不同产地标准大豆油样品中大豆油脂特征分布规律以及标准大豆粉样品的水溶性蛋白质的稳定同位素分布规律，构建基于 MALDI-TOF/TOF和稳定同位素比值分析相结合的大豆产地溯源鉴定模型；
S5.结果预测：将待检测大豆样品分别经过压榨得到待检测大豆油样品和经研磨、提取后得到待检测大豆水溶性蛋白质，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集待检测大豆油样品的甘油三酯化合物高分辨质谱数据，以及用同位素质谱仪采集待检测大豆水溶性蛋白质的稳定同位素比值数据；将待检测大豆样品的甘油三酯化合物高分辨质谱数据和稳定同位素比值数据同时导入步骤S4的所述大豆产地溯源鉴定模型中，进行待检测大豆的产地溯源预测。
优选的，所述步骤S2中，所述标准大豆油样品的高分辨质谱数据采集方法为：使用棉签蘸取标准大豆油样品印在含有基质的靶板上，所述基质为2，5-二羟基苯甲酸、芥子酸和 2-氰基-4-羟基肉桂酸中的一种或多种，每6个标准大豆油样品使用聚乙二醇(PEG)校准一次，每个标准大豆油样品平行测定三次，将靶板置于所述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪中用正离子模式进行质谱数据采集。
更优选的，所述基质为2，5-二羟基苯甲酸。
优选的，步骤S1中标准大豆粉样品的水溶性蛋白质提取过程如下：将大豆样品研磨粉碎制备30g标准大豆粉样品，称取1g标准大豆粉样品，加入10mL超纯水，经过超声波超声30min，10000转的转动条件下离心5min，提取1mL上清蛋白质提取液加入3K超滤离心管，离心分别获得分子量3k Da以上的蛋白质，将离心后的蛋白质转移至进样瓶中，冷冻干燥8h以上至全部干燥，获得水溶性蛋白质的固态蛋白质粉末。
优选的，所述同位素质谱仪为在线气体分析-稳定同位素质谱仪GasBench-IRMS、元素分析-同位素质谱仪EA-IRMS、气相色谱-同位素质谱仪GC-IRMS、液相色谱-同位素质谱仪 LC-IRMS中的一种。
优选的，所述步骤S2中标准大豆粉样品的水溶性蛋白质的稳定同位素比值数据采集方法为：
a1.选取元素分析-同位素质谱仪EA-IRMS，在锡杯和银杯中均放置水溶性蛋白质的固态蛋白质粉末，分别检测水溶性蛋白质中稳定碳和氮的同位素比值，以及稳定氢和氧的同位素比值；
a2.调谐校正元素分析-同位素质谱仪EA-IRMS；
a3.将锡杯包裹的水溶性蛋白质引入980℃高温燃烧炉，获得CO2和N2气体，将CO2和N2导入同位素质谱仪主机中进行水溶性蛋白质中的δ15N和δ13C检测；将银杯包裹的水溶性蛋白质引入1380℃高温裂解炉中，获得CO和H2气体，将CO和H2导入同位素质谱仪主机中进行水溶性蛋白质的δ2H和δ18O检测。
优选的，所述步骤a2中，调谐校正元素分析-同位素质谱仪EA-IRMS的方法如下：在所述元素分析-同位素质谱仪EA-IRMS中通入高纯度CO、H2、N2和CO2作为参考气体，然后用已知δ2H、δ18O、δ15N和δ13C值的标准物质标定所述参考气体的稳定同位素δ值，再以参考气体标定后的稳定同位素δ值作为检测标准，用于校正步骤a3中检测得到的标准大豆粉样品的水溶性蛋白质中的稳定同位素δ值。
优选的，校正过程中的数据的处理以及分析均通过美国Thermo Scientific公司的 Isodat3.0软件实现。
优选的，所述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪在Flex Control软件上采集所述标准样品的高分辨质谱数据，所述甘油三酯化合物高分辨质谱数据在Flex Analysis软件上定性定量进行归一化和平均处理分析。
优选的，所述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的工作条件为：质谱仪采用正离子模式采集数据，离子源电压20kV，激光频率1000Hz，激光能量50％，在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集的每张高分辨质谱图上采集1500个激光点，校准相对误差小于5ppm，扫描范围500-2000Da。
优选的，电感耦合等离子体发射光谱法ICP-AES的工作条件为：检测波长为396.152nm；功率为1500W；等离子体气流量：10.0L/min；辅助气流量为0.55L/min；雾化气流量：0.55 L/min；蠕动泵转速为50r/min，观测方式：轴向；载气：99.996％高纯氩气；
电感耦合等离子体质谱法ICP-MS的工作条件为：采用模式:标准(STD)；气体:氩气(≥99.998％,高纯)；扫描/读数:20；读数/重复次数:1；重复次数:3；雾化气流速:0.84L/min；辅助气流量:1.2L/min；等离子气流量:1500L/min；ICP射频功率:1500W；蠕动泵:20rpm。采样锥及截取锥：铂锥。
优选的，所述步骤S4还包括盲样验证步骤，所述盲样验证步骤包括：选取同一地区的多个大豆验证样品，将具有明确地区的大豆验证样品分别经过压榨得到待验证大豆油样品和经研磨、提取后得到待验证大豆粉样品的水溶性蛋白，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集待验证大豆油样品的甘油三酯化合物高分辨质谱数据，以及用同位素质谱仪采集待所述待验证大豆粉样品的水溶性蛋白稳定同位素比值数据；将大豆验证样品的甘油三酯化合物高分辨质谱数据和水溶性蛋白稳定同位素比值数据同时导入步骤S4的所述大豆产地溯源鉴定模型中，验证所述大豆验证样品的产地溯源准确度。
进一步优选的，步骤S3中，脂类化合物数据库为美国公布的脂类化合物数据库LIPID MAPS Lipidomics Gateway，标准甘油三酯化合物数据为脂类化合物数据库LIPIDMAPS Lipidomics Gateway中Triradylglycerols的6899个甘油三酯化合物，通过FlexAnalysis软件定性分析确定大豆油样品常见的64个甘油三酯化合物为所述标准样品的甘油三酯靶向化合物。
优选的，所述步骤S3的确定靶向化合物的方法包括：根据所述高分辨质谱数据中的目标物分子量范围，将大豆油样品中的高分辨质谱数据分为2个区域：分子量在800-1000的第一区域，分子量在700-800的第二区域，所述第一区域与第二区域是大豆油油脂代谢特征区域，将脂类化合物数据库中的分子量范围在700-950之间的动植物来源甘油三酯化合物与第一区域和第二区域中的大豆油甘油三酯化合物进行匹配筛选，确定分子量范围在850-930 Da之间的64个大豆油中的甘油三酯化合物为甘油三酯靶向化合物。
优选的，所述步骤S4中，将同一产地大豆的标准大豆油样品归一化和平均处理后的数据和标准大豆粉样品的水溶性蛋白稳定同位素比值数据同时导入建模软件进行正交偏最小二乘法回归分析法处理，构建基于MALDI-TOF/TOF和稳定同位素比值分析相结合的OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型。
优选的，所述步骤S4中还包括对大豆产地溯源鉴定模型的优化步骤，所述优化步骤包括：通过大豆产地溯源鉴定模型的VIP值确定所述甘油三酯靶向化合物中贡献度大的部分甘油三酯化合物，选取38个甘油三酯化合物作为优选后的甘油三酯靶向化合物。在分子量范围为850-930Da之间的64个甘油三脂化合物中选取38个VIP值贡献度大的甘油三脂化合物作为优选后的甘油三酯靶向化合物，VIP值为变量投影重要性分析值，包括分子量如下的甘油三酯化合物：853.7、854.7、875.7、876.7、877.7、878.7、879.7、880.7、881.7、882.8、 883.7、893.7、894.7、895.7、896.7、897.7、898.7、899.7、900.7、901.7、902.7、903.7、 904.7、905.7、906.7、907.7、909.7、915.7、916.7、917.7、918.7、919.7、920.7、921.7、 922.7、923.7、908.7。
优选的，甘油三酯靶向化合物的选择过程中，还需要根据hotelling’s和DModx指标，删除超出99％置信区间的异常值样品，以及删除在鉴定模型中出现数目比较少的所在地区的全部大豆油样品，以优化大豆产地溯源鉴定模型。
优选的，所述步骤S1中标准样品制备的过程中，设所述大豆样品来源于n个不同的地区，将所述大豆样品分成n×(n-1)/2组，每组大豆样品中均由两个不同产地的大豆样品组成，将每组大豆样品均按照步骤S2、S3、S4建立两国大豆产地溯源鉴定模型，用于鉴定两国大豆产地溯源鉴定模型中所对应的大豆国家或地区。
优选的，所述步骤S1中标准样品制备的过程中，大豆样品来源于至少三个不同国家或地区，以使所述步骤S4建立多国大豆产地溯源鉴定模型。
更优选的，所述所述步骤S1中标准样品制备的过程中，大豆样品来源于巴西、俄罗斯、美国、加拿大、乌拉圭、中国和阿根廷五个国家。
优选的，所述步骤S1中标准样品制备的过程中，设所述大豆样品来源于美国、巴西、阿根廷、加拿大、乌拉圭、俄罗斯、中国，按照步骤S2、S3、S4依次建立美国-巴西、美国-阿根廷、美国-加拿大、美国-乌拉圭、美国-俄罗斯、美国-中国大豆产地溯源鉴定模型，用于鉴定美国与其余国家的大豆产地来源。
有益效果：
本发明的基于MALDI-TOF/TOF和IRMS稳定同位素比值分析相融合的大豆原产地溯源识别方法，通过参考待检测大豆油样品的甘油三酯化合物高分辨质谱数据和大豆粉样品中水溶性蛋白质的稳定同位素比值，将两种数据融合后导入所述大豆产地溯源鉴定模型中，进行待检测大豆的产地溯源预测，提高大豆产地溯源的准确度；且采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪分别采集不同产地的所述标准样品的质谱数据信息，无需对标准样品进行稀释就可以进行质谱数据采集，从而获得所述标准样品的高分辨质谱数据，MALDI-TOF/TOF作为新型的软电离生物质谱技术，在生物物种鉴别、食品新鲜度判断、食品种类鉴别上具有十分明显的先进性和优势，MALDI-TOF/TOF技术能够准确获取大豆和大豆油样品中的甘油三酯靶向化合物的高分辨质谱数据，且利用较少的甘油三酯靶向化合物的高分辨质谱数据即可建立多元统计分析判别预测模型，并结合多国以及两国大豆产地溯源鉴定模型进一步完善大豆产地溯源鉴定的准确性，本发明还能够通过单独建立两国大豆产地溯源鉴定模型来提高鉴定特定两个国家的大豆产地溯源准确度。本发明比单独使用稳定同位素比值溯源方法鉴定美国大豆的准确度高，且提高了10％以上，相较于单独使用 MALDI-TOF/TOF的溯源法鉴定的准确性也有所提高，因此本发明能够有效识别美国和其他大豆主生产国之间的产地源，避免多国大豆混合后进入中国。
附图说明
图1所示为本发明测得的大豆粉样品水溶性蛋白质δ15N值的同位素质谱图；
图2所示为本发明测得的大豆粉样品水溶性蛋白质δ13C值的同位素质谱图；
图3所示为本发明测得的大豆粉样品水溶性蛋白质δ2H值的同位素质谱图；
图4所示为本发明测得的大豆粉样品水溶性蛋白质δ18O值的同位素质谱图；
图5所示为大豆粉样品的水溶性蛋白质作为靶向目标物建立的基于同位素比值的多国 OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型；
图6所示为本发明测得的大豆油样品的质谱图；
图7所示为基于MALDI-TOF/TOF的多国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型；
图8所示为基于MALDI-TOF/TOF和稳定同位素比值分析的巴西-美国两国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型
图9所示为基于MALDI-TOF/TOF和稳定同位素比值分析的阿根廷-美国两国OPLS-DA 大豆产地溯源鉴定模型；
图10所示为基于MALDI-TOF/TOF和稳定同位素比值分析的加拿大-美国两国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型；
图11所示为基于MALDI-TOF/TOF和稳定同位素比值分析的乌拉圭-美国两国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型；
图12所示为基于MALDI-TOF/TOF和稳定同位素比值分析的俄罗斯-美国两国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型；
图13所示为基于MALDI-TOF/TOF和稳定同位素比值分析的中国-美国两国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型；
图14所示为大豆粉样品作为靶向目标物建立的基于稳定同位素比值的多国OPLS-DA 大豆产地溯源鉴定模型；
图15所示为大豆油样品作为靶向目标物建立的基于稳定同位素比值的多国OPLS-DA 大豆产地溯源鉴定模型。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对照附图说明本发明的具体实施方式。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，并获得其他的实施方式。
下面以具体实施例详细介绍本发明的技术方案。
大豆油样品数据采集过程中的实验器材包括：选择德国布鲁克公司的ultraflextreme MALDI-TOF/TOF质谱仪；日本岛津公司的HPLC 20AD高效液相色谱仪；美国Waters公司的Xbridge BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,3μm)；以及榨油机；
试剂选择：乙腈、丙酮(色谱纯，赛默飞世尔公司，美国)；PEG校准液；2，5-二羟基苯甲酸基质(CNW公司，安谱，中国)；
大豆水溶性蛋白质的数据采集中使用的仪器：Flash EA 2000元素分析仪，DELTAV Advantage同位素质谱仪和ConFlo IV接口(美国Thermo Scientific公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)；SW 30H型超声仪(瑞士SONO SWISS公司)；SIGMA 3-30KS 高速冷冻离心机(德国Sigma离心机公司)；Sartorius BT 223S千分之一天平(德国赛多利斯公司)；榨油机；真空冷冻干燥机(德国Christ公司，Alpha 1-2LD PLUS)；粉碎机(上海嘉定粮油有限公司，JL064)；银杯(德国IVA Analysentechnik公司)；锡杯(美国赛默飞公司)；作为载气的He气(纯度大于99％)、CO2标准参考气(纯度大于99.9995％)、 CO标准参考气(纯度大于99.9995％)、H2标准参考气(纯度大于99.9995％)；N2标准参考气(纯度大于99.9995％)；超滤离心管(美国密理博公司，Centrifugal Filter Units，3K/10K)。
EA-IRMS用碳、氮同位素标准物质：IAEA-600咖啡因：δ13C＝-27.771‰，δ15N＝+1.00‰， V-PDB为基准，购于国际原子能机构；EA-IRMS用氢氧同位素标准物质：EMA-P1聚酰胺：δ2H＝-25.3‰，δ18O＝20.99‰，以V-SMOW为基准，购于英国Elemental Microanalysis公司；实验用水为超纯水，阻抗值为18.2MΩ·cm。
大豆及大豆油样品来源：大豆标准样品来源于全国有关直属海关及国外购买共收集大豆样品807个，其中各个产地的大豆样品数量如下：其中美国样品152个，巴西样品423个，加拿大样品96个，阿根廷样品68个，乌拉圭样品14个，俄罗斯样品25个，中国样品29个；大豆油样品334个：其中美国样品36个，巴西样品226个，乌克兰样品7个，阿根廷样品46个，墨西哥样品1个，俄罗斯样品16个。
基于MALDI-TOF/TOF和IRMS技术相结合进行大豆原产地溯源识别方法，包括如下步骤：
S1.标准样品制备：选取具有明确地区的不同产地的大豆样品，每个产地的所述大豆样品分别经压榨后得到标准大豆油样品和经研磨后得到标准大豆粉样品，并提取所述标准大豆粉样品的水溶性蛋白质作为靶向目标物，所述大豆样品来源于至少两个不同产地；
S2.标准样品的质谱数据和稳定同位素比值数据采集：用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪分别采集不同产地的所述标准大豆油样品的质谱数据信息，获得所述标准大豆油样品的高分辨质谱数据；以及用同位素质谱仪采集不同产地的所述标准大豆粉样品的水溶性蛋白质的质谱数据信息，获得所述水溶性蛋白质的稳定同位素比值数据，IRMS技术为稳定同位素技术；
S3.标准大豆油样品靶向化合物的确定：将步骤S2获得的高分辨质谱数据中的甘油三酯化合物质谱数据与脂类化合物数据库中的标准甘油三酯化合物数据进行匹配，确定所述标准样品的甘油三酯靶向化合物；
S4.大豆产地溯源鉴定模型建立：确定标准大豆油样品中甘油三酯靶向化合物后，将甘油三酯靶向化合物对应的甘油三酯化合物高分辨质谱数据通过分析软件进行归一化和平均处理，将同一产地大豆的标准大豆油样品归一化和平均处理后的数据和标准大豆粉样品的水溶性蛋白质的稳定同位素比值数据同时导入建模软件进行主成分分析法、偏最小二乘法- 判别分析法和正交偏最小二乘法回归分析法中的一种或多种方式处理，然后依次将不同产地大豆的标准大豆油样品归一化和平均处理后的数据和标准大豆粉样品的水溶性蛋白质的稳定同位素比值数据均导入建模软件中，以获得不同产地标准大豆油样品中大豆油脂特征分布规律以及标准大豆粉样品的水溶性蛋白质的稳定同位素分布规律，构建基于 MALDI-TOF/TOF和稳定同位素比值分析相结合的大豆产地溯源鉴定模型；
S5.结果预测：将待检测大豆样品分别经过压榨得到待检测大豆油样品和经研磨、提取后得到待检测大豆水溶性蛋白质，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集待检测大豆油样品的甘油三酯化合物高分辨质谱数据，以及用同位素质谱仪采集待检测大豆水溶性蛋白质的稳定同位素比值数据；将待检测大豆样品的甘油三酯化合物高分辨质谱数据和稳定同位素比值数据同时导入步骤S4的所述大豆产地溯源鉴定模型中，进行待检测大豆的产地溯源预测。
所述步骤S4还包括盲样验证步骤，所述盲样验证步骤包括：选取同一地区的多个大豆验证样品，将具有明确地区的大豆验证样品分别经过压榨得到待验证大豆油样品和经研磨、提取后得到待验证大豆粉样品的水溶性蛋白，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集待验证大豆油样品的甘油三酯化合物高分辨质谱数据，以及用同位素质谱仪采集待所述待验证大豆粉样品的水溶性蛋白稳定同位素比值数据；将大豆验证样品的甘油三酯化合物高分辨质谱数据和水溶性蛋白稳定同位素比值数据同时导入步骤S4的所述大豆产地溯源鉴定模型中，验证所述大豆验证样品的产地溯源准确度。
多国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型实施例1
选取具有明确地区的不同产地的大豆样品，每个产地的所述大豆样品分别经物理压榨后得到标准大豆油样品和经研磨后得到标准大豆粉样品，并提取所述标准大豆粉样品的水溶性蛋白质作为靶向目标物。
采集标准大豆油样品质谱数据过程如下：将具有明确地区的不同产地的标准大豆油样品，以2，5-二羟基苯甲酸为基质，使用棉签蘸取标准大豆油样品印在含有基质的靶板上，每6个标准大豆油样品使用PEG校准一次，每个标准大豆油样品平行测定三次。将靶板置于所述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪中，所述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的工作条件为：质谱仪采用正离子模式采集数据，离子源电压20kV，激光频率1000Hz，激光能量50％，大豆油样品的高分辨质谱图如图6所示，在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集的每张高分辨质谱图上采集1500个激光点，校准相对误差小于5ppm，扫描范围500-2000Da。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪分别采集不同产地的所述标准大豆油样品的质谱数据信息，获得所述标准大豆油样品的高分辨质谱数据；所述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪在Flex Control软件上采集所述标准大豆油样品的高分辨质谱数据，所述甘油三酯化合物高分辨质谱数据在Flex Analysis软件上定性定量进行归一化和平均处理分析。
将获得的高分辨质谱数据中的甘油三酯化合物质谱数据与脂类化合物数据库中的标准甘油三酯化合物数据进行匹配，脂类化合物数据库为美国公布的脂类化合物数据库LIPID MAPS Lipidomics Gateway，标准甘油三酯化合物数据为脂类化合物数据库LIPIDMAPS Lipidomics Gateway中Triradylglycerols的6899个甘油三酯化合物，通过FlexAnalysis软件定性分析确定所述高分辨质谱数据中的目标物分子量范围，将大豆油样品中的高分辨质谱数据分为2个区域：分子量在800-1000的第一区域，分子量在700-800的第二区域，所述第一区域与第二区域是大豆油油脂代谢特征区域，将脂类化合物数据库中的分子量范围在 700-950之间的动植物来源甘油三酯化合物与第一区域和第二区域中的大豆油甘油三酯化合物进行匹配筛选，确定分子量范围在850-930Da之间的64个大豆油中的甘油三酯化合物为甘油三酯靶向化合物。确定甘油三酯靶向化合物后，将甘油三酯靶向化合物对应的甘油三酯化合物高分辨质谱数据通过分析软件进行归一化和平均处理之后，将处理后的数据进行正交偏最小二乘法回归分析法处理，以获得标准大豆油样品中不同产地大豆油脂特征分布规律，构建基于脂质组学的大豆产地溯源鉴定模型。
标准大豆粉样品的水溶性蛋白质提取过程如下：将大豆样品研磨粉碎制备30g标准大豆粉样品，称取1g标准大豆粉样品，加入10mL超纯水，经过超声波超声30min，10000 转的转动条件下离心5min，提取1mL上清蛋白质提取液加入3K超滤离心管，离心分别获得分子量3k Da以上的蛋白质，将离心后的蛋白质转移至进样瓶中，冷冻干燥8h以上至全部干燥，获得水溶性蛋白质的固态蛋白质粉末。
所述同位素质谱仪为在线气体分析-稳定同位素质谱仪GasBench-IRMS、元素分析-同位素质谱仪EA-IRMS、气相色谱-同位素质谱仪GC-IRMS、液相色谱-同位素质谱仪LC-IRMS 中的一种。本实施例选取元素分析-同位素质谱仪EA-IRMS来分析大豆水溶性蛋白质的稳定同位素比值。大豆水溶性蛋白质的稳定同位素比值分析通过元素分析仪串联同位素质谱仪实现。EA-IRMS可以高精度测定有机或无机样品中氢、碳、氧、氮和硫等的稳定同位素的平均组成。EA-IRMS方法是将样品包裹于锡纸中，称量后直接放入EA自动进样器，此后样品在燃烧管中经过高温燃烧转变为NOx，CO2，SO2或H2O等气体。根据检测需求，混合气体经气相色谱柱等分离后除去干扰气体，目标气体最终进入同位素质谱仪进行检测。在碳同位素质谱测定中，样品燃烧生成的混合气体随着氦气流进入还原管，在还原管中，NOx转变为N2，过量的O2被除去，随后混合气体经干燥管除去H2O，再经气相色谱柱实现CO2和N2的分离获得单一的CO2气体。
标准大豆粉样品的水溶性蛋白质的稳定同位素比值数据采集方法为：
a1.选取元素分析-同位素质谱仪EA-IRMS，在锡杯和银杯中均放置称量后的水溶性蛋白质的固态蛋白质粉末，分别检测水溶性蛋白质中稳定碳和氮的同位素比值，以及稳定氢和氧的同位素比值；
a2.调谐校正元素分析-同位素质谱仪EA-IRMS；
a3.将锡杯包裹的水溶性蛋白质放入EA自动进样器中，然后引入980℃高温燃烧炉，获得CO2和N2气体，将CO2和N2混合氦气导入同位素质谱仪主机中进行水溶性蛋白质中的δ15N和δ13C检测；将银杯包裹的水溶性蛋白质引入1380℃高温裂解炉中，获得CO和H2气体，将CO和H2混合氦气导入同位素质谱仪主机中进行水溶性蛋白质的δ2H和δ18O检测。
所述步骤a2中，调谐校正元素分析-同位素质谱仪EA-IRMS的方法如下：在所述元素分析-同位素质谱仪EA-IRMS中通入高纯度CO、H2、N2和CO2作为参考气体，并通入高纯度He气作为引流气体，然后用已知δ2H、δ18O、δ15N和δ13C值的标准物质标定所述参考气体的稳定同位素δ值，再以参考气体标定后的稳定同位素δ值作为检测标准，用于校正步骤a3中检测得到的标准大豆粉样品的水溶性蛋白质中的稳定同位素δ值。校正过程中的数据的处理以及分析均通过美国Thermo Scientific公司的Isodat3.0软件实现。已知δ2H、δ18O、δ15N和δ13C值的标准物质为：碳、氮同位素标准物质IAEA-600咖啡因：δ13C＝-27.771‰，δ15N＝+1.00‰，V-PDB为基准，购于国际原子能机构；氢氧同位素标准物质EMA-P1聚酰胺：δ2H＝-25.3‰，δ18O＝20.99‰，以V-SMOW为基准。
元素分析-同位素质谱仪EA-IRMS同位素质谱不同于常规测定样品中目标物分子量的有机质谱，而通过CO2、H2、CO、N2小分子化合物的间接检测，确定碳、氢、氧、氮的同位素丰度比。通过CO2目标气体检测标准大豆粉样品的水溶性蛋白质的δ13C值，H2目标气体检测标准大豆粉样品的水溶性蛋白质的δ2H，CO目标气体检测标准大豆粉样品的水溶性蛋白质的δ18O，N2目标气体测定标准大豆粉样品的水溶性蛋白质的δ15N。样品同位素色谱如图1-4所示。
将元素分析-同位素质谱仪EA-IRMS采集标准大豆粉样品的水溶性蛋白质的δ2H、δ18O、δ15N和δ13C值，通过描述统计分析方法，归纳整理excel列表，导入SIMCA 14.1软件中，进行正交偏最小二乘法回归分析法的方式处理，获得不同产地大豆同位素分布规律，从而构建大豆产地溯源的同位素鉴别模型。如图5所示，选择标准大豆粉样品的水溶性蛋白质的δ2H、δ18O、δ15N和δ13C构建的OPLS-DA多国鉴定模型，结果显示巴西、美国、阿根廷、乌拉圭及加拿大等国家大豆样品产地区分度相对较好。通过对大豆中水溶性蛋白质的4个变量δ2H、δ18O、δ15N和δ13C对产地区分的贡献度进行分析，δ15N对产地溯源的贡献最大，其次是δ2H和δ18O，δ13C的贡献最低。
本实施例选取具有明确地区的巴西大豆样品、美国大豆样品、中国大豆样品、阿根廷大豆样品、加拿大大豆样品、乌拉圭大豆样品、俄罗斯大豆样品来制作标准大豆油样品和标准大豆粉样品，并将该标准大豆油样品中不同地区的大豆分别通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集高分辨质谱数据，甘油三酯化合物高分辨质谱数据经过FlexControl 软件，Flex Analysis软件归一化和平均处理分析，以及用元素分析-同位素质谱仪EA-IRMS 采集标准大豆粉样品的水溶性蛋白质的δ2H、δ18O、δ15N和δ13C值，将处理后的甘油三酯化合物高分辨质谱数据和水溶性蛋白质的稳定同位素比值数据归纳整理excel列表，导入 SIMCA 14.1软件进行正交偏最小二乘法回归分析法处理，从而构建基于MALDI-TOF/TOF 和稳定同位素比值分析的多国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型。
为了避免部分国家或地区的样品在鉴定模型中交叉分布在一起，影响模型的预测鉴定准确度，因此需要对大豆产地溯源鉴定模型进行进一步优化，所述优化步骤包括：通过大豆产地溯源鉴定模型的VIP值确定所述靶向化合物中贡献值度大的部分甘油三酯化合物，并根据hotelling’s和DModx指标，删除超出99％置信区间的异常值样品，以及删除在鉴定模型中出现数目比较少的所在地区的全部大豆油样品，以优化大豆产地溯源鉴定模型。因此在分子量范围为850-930Da之间的64个甘油三脂化合物中选取38个VIP值贡献度大的甘油三脂化合物作为优选后的甘油三酯靶向化合物，包括分子量如下的甘油三酯化合物：853.7、854.7、875.7、876.7、877.7、878.7、879.7、880.7、881.7、882.8、883.7、893.7、894.7、895.7、896.7、897.7、898.7、899.7、900.7、901.7、902.7、903.7、904.7、905.7、906.7、907.7、909.7、915.7、916.7、917.7、918.7、919.7、920.7、921.7、922.7、923.7、908.7。如图7所示，经优化后的基于MALDI-TOF/TOF的多国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型中能够对不同国家的样品较为显著的区分，尤其是显著区分巴西和非巴西大豆样品；以及巴西、俄罗斯、美国等产地样品，但是多国鉴定模型中美国和加拿大产地的样品交叉分布在一起，影响模型对美国和加拿大的大豆产地溯源预测鉴定准确度。
因此，最终的基于MALDI-TOF/TOF和稳定同位素比值分析相结合的大豆产地溯源鉴定模型是由优选后的甘油三酯靶向化合物和特征贡献度元素数据δ15N、δ2H、δ18O和δ13C构建而成的，是融合大豆产地溯源的同位素鉴别模型和基于脂质组学的大豆产地溯源鉴定模型后形成的。其能够明显区分巴西、俄罗斯、美国、阿根廷和加拿大产地的大豆样品。
多国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型建立好之后，需要对该模型进行盲样验证，所述盲样验证步骤包括：选取同一地区的多个大豆验证样品，将具有明确地区的大豆验证样品分别经过压榨得到待验证大豆油样品和经研磨、提取后得到待验证大豆粉样品的水溶性蛋白，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集待验证大豆油样品的甘油三酯化合物高分辨质谱数据，以及用同位素质谱仪采集待所述待验证大豆粉样品的水溶性蛋白稳定同位素比值数据；将大豆验证样品的甘油三酯化合物高分辨质谱数据和水溶性蛋白稳定同位素比值数据同时导入基于MALDI-TOF/TOF和稳定同位素比值分析的多国OPLS-DA所述大豆产地溯源鉴定模型中，验证所述大豆验证样品的产地溯源准确度。
盲样验证完成后，将待检测大豆样品分别经过压榨得到待检测大豆油样品和经研磨、提取后得到待检测大豆水溶性蛋白质，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集待检测大豆油样品的甘油三酯化合物高分辨质谱数据，以及用同位素质谱仪采集待检测大豆水溶性蛋白质的稳定同位素比值数据；将待检测大豆样品的甘油三酯化合物高分辨质谱数据和稳定同位素比值数据同时导入基于MALDI-TOF/TOF和稳定同位素比值分析的多国OPLS-DA所述大豆产地溯源鉴定模型中，进行待检测大豆的产地溯源预测。
两国大豆产地溯源鉴定模型实施例1
该实施例仅描述与上述实施例的不同之处，在本实施例中，所述步骤S1中标准样品制备的过程中，设所述大豆样品来源于n个不同的地区，将所述大豆样品分成n×(n-1)/2组，每组大豆样品中均由两个不同产地的大豆样品组成，将每组大豆样品均按照步骤S2、S3、 S4建立两国大豆产地溯源鉴定模型，用于鉴定两国大豆产地溯源鉴定模型中所对应的大豆国家或地区。
该实施例中，选取具有明确地区的巴西大豆样品美国大豆样品来制作标准大豆油样品和标准大豆粉样品的水溶性蛋白质，并将这两个不同地区的大豆油样品分别通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集甘油三酯化合物高分辨质谱数据，Flex Control软件，Flex Analysis软件归一化和平均处理分析，以及将这两个不同地区的大豆粉样品的水溶性蛋白质分别通过EA-IRMS采集稳定同位素比值数据，将处理后的高分辨质谱数据和稳定同位素比值数据导入SIMCA 14.1软件中进行正交偏最小二乘法回归分析法处理，从而建立基于 MALDI-TOF/TOF和稳定同位素比值分析的巴西-美国两国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型。从图8中可以看出巴西-美国两国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型中可显著区分美国和巴西大豆样品，为了进一步验证两国压榨大豆油产地溯源鉴定模型的判定准确度，选择美国大豆样品和巴西大豆样品分别进行压榨和磨粉提取水溶性蛋白质后进行模型盲样验证，验证结果表明，巴西来源的大豆油样品判定准确度为100％，美国来源的样品判定准确度为 90.0％。
两国大豆产地溯源鉴定模型实施例2
该实施例中，选取具有明确地区的阿根廷大豆样品美国大豆样品来制作标准大豆油样品和标准大豆粉样品的水溶性蛋白质，并将这两个不同地区的大豆油样品分别通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集甘油三酯化合物高分辨质谱数据，Flex Control软件， Flex Analysis软件归一化和平均处理分析，以及将这两个不同地区的大豆粉样品的水溶性蛋白质分别通过EA-IRMS采集稳定同位素比值数据，将处理后的高分辨质谱数据和稳定同位素比值数据导入SIMCA 14.1软件中进行正交偏最小二乘法回归分析法处理，从而建立基于 MALDI-TOF/TOF和稳定同位素比值分析的阿根廷-美国两国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型。从图9中可以看出阿根廷-美国两国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型中可显著区分美国和巴西大豆样品，为了进一步验证两国压榨大豆油产地溯源鉴定模型的判定准确度，选择美国大豆样品和阿根廷大豆样品分别进行压榨和磨粉提取水溶性蛋白质后进行模型盲样验证，验证结果表明，阿根廷来源的大豆油样品判定准确度为85％，美国来源的样品判定准确度为90.0％。
两国大豆产地溯源鉴定模型实施例3
该实施例中，选取具有明确地区的加拿大大豆样品美国大豆样品来制作标准大豆油样品和标准大豆粉样品的水溶性蛋白质，并将这两个不同地区的大豆油样品分别通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集甘油三酯化合物高分辨质谱数据，Flex Control软件， Flex Analysis软件归一化和平均处理分析，以及将这两个不同地区的大豆粉样品的水溶性蛋白质分别通过EA-IRMS采集稳定同位素比值数据，将处理后的高分辨质谱数据和稳定同位素比值数据导入SIMCA 14.1软件中进行正交偏最小二乘法回归分析法处理，从而建立基于 MALDI-TOF/TOF和稳定同位素比值分析的加拿大-美国两国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型。从图10中可以看出加拿大-美国两国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型中可显著区分美国和巴西大豆样品，为了进一步验证两国压榨大豆油产地溯源鉴定模型的判定准确度，选择美国大豆样品和加拿大大豆样品分别进行压榨和磨粉提取水溶性蛋白质后进行模型盲样验证，验证结果表明，加拿大来源的大豆油样品判定准确度为85％，美国来源的样品判定准确度为80.0％。
两国大豆产地溯源鉴定模型实施例4
该实施例仅描述与上述实施例的不同之处，在本实施例中，选取具有明确地区的俄罗斯、中国、乌拉圭大豆样品以及美国大豆样品来制作标准大豆油样品和标准大豆粉样品的水溶性蛋白质，并将这两个不同地区的大豆油样品分别通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集甘油三酯化合物高分辨质谱数据，Flex Control软件，Flex Analysis软件归一化和平均处理分析，以及将这两个不同地区的大豆粉样品的水溶性蛋白质分别通过EA-IRMS采集稳定同位素比值数据，将处理后的高分辨质谱数据和稳定同位素比值数据导入SIMCA 14.1软件中进行正交偏最小二乘法回归分析法处理，从而依次建立基于 MALDI-TOF/TOF和稳定同位素比值分析的乌拉圭-美国、俄罗斯-美国、中国-美国这三种两国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型。从图11、12、13中可以看出三个两国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型中可显著区分美国和其余三个国家的大豆样品，为了进一步验证两国压榨大豆产地溯源鉴定模型的判定准确度，选择美国大豆样品和俄罗斯、中国、乌拉圭大豆样品压榨和磨粉后分别进行压榨和磨粉提取水溶性蛋白质后进行模型盲样验证，验证结果表明，俄罗斯、中国、乌拉圭来源的大豆油样品判定准确度为100％，美国来源的样品判定准确度为95.0％以上。
由上述四个两国大豆产地溯源鉴定模型实施例和多国鉴定模型可以看出，两国大豆产地溯源鉴定模型的溯源准确度更高。
对比实施例1
该对比实施例中，为验证大豆不同类型的靶向目标物对建立基于稳定同位素比值分析的OPLS-DA鉴定模型的影响，本对比实施例选取具有明确产地的大豆样品分别经过研磨后得到大豆粉样品作为靶向目标物，用EA-IRMSS采集大豆粉样品中δ2H、δ18O、δ15N和δ13C数据，利用正交偏最小二乘法回归分析法建立多国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型，建立的模型如图14所示。
对比实施例2
该对比实施例中，为验证大豆不同类型的靶向目标物对建立基于稳定同位素比值分析的OPLS-DA鉴定模型的影响，本对比实施例选取具有明确产地的大豆样品分别经过压榨后得到大豆油样品作为靶向目标物，用EA-IRMSS采集大豆油样品中δ2H、δ18O、δ15N和δ13C数据，利用正交偏最小二乘法回归分析法建立多国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型，建立的模型如图15所示。
如图5、14、15所示，对比分析多国OPLS-DA大豆产地溯源鉴定模型实施例1中基于标准大豆粉样品的水溶性蛋白质的δ2H、δ18O、δ15N和δ13C构建的OPLS-DA多国鉴定模型，和对比实施例1和对比实施例2的对比，来区分不同靶向目标物对稳定同位素溯源鉴定模型的影响。对比结果显示，相同样品，大豆粉样品、大豆油样品及水溶性蛋白质的同位素鉴定模型可以基本区分美国和巴西两地大豆及大豆油样品，但是对其它国家样品与美国样品的区分上，选取大豆水溶性蛋白作为靶向目标物明显优于大豆粉样品和大豆油样品。为此，单独选择大豆粉样品的水溶性蛋白质的δ2H、δ18O、δ15N和δ13C来建立基于MALDI-TOF/TOF和IRMS技术相结合的大豆产地溯源，能够对巴西、美国、阿根廷、乌拉圭及加拿大等国家大豆样品产地明显区分开。
以上对本发明所提供的一种基于MALDI-TOF/TOF和IRMS技术相结合进行大豆原产地溯源识别方法的实施例进行了详细阐述。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的原理的前提下，还可以本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
