检测四唑虫酰胺及其代谢物残留量的方法及其应用
技术领域
本发明涉及农药残留领域，特别地，涉及一种检测四唑虫酰胺及其代谢物残留量的方法。此外，本发明还涉及一种包括上述检测四唑虫酰胺及其代谢物残留量的方法的应用。
背景技术
近年来，谷物害虫随着谷物种植的规模化而迅速发展，给农业生产带来了巨大损失，另一方面，害虫抗药性不断发展也成为妨碍其防治的一个大问题，使得常规药剂很难防治。
四唑虫酰胺(tetraniliprole，开发代号：BCS-CL73507))，化学名称为：1-(3-氯-2-吡啶基)-4′-氰基-2′-甲基-6′-甲基氨基甲酰基-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰苯胺，CAS登录号：1229654-66-3；分子式：C22H16ClF3N10O2；相对分子质量：544.88，其结构式如下：
四唑虫酰胺是新型邻甲酰胺基苯甲酰胺类广谱杀虫剂。该杀虫剂是氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺等双酰胺类化合物家族中的新成员，均为鱼尼丁受体激动剂；国际杀虫剂抗性行动委员会(IRAC)将其归类为第28组。四唑虫酰胺在低剂量下即可高效防治谷物、果树、蔬菜和其他农作物上的多种鳞翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)害虫，尤其对二化螟、甜菜夜蛾、蓟马等害虫防治效果显著。该药剂使用方式简单，叶面处理、土壤处理、种子处理均可，目前已登记的是在甘蓝上用于防治甜菜夜蛾的200克/升的悬浮剂。
四唑虫酰胺原药对哺乳动物(LD50值>2000mg/kg，褐家鼠)和鸟类(LD50值>2000mg/kg，试验测试了3种鸟类)低毒；对鱼类等水生脊椎动物毒性相对较低(LC50值>10mg/L，试验测试了4种鱼类)；对水生无脊椎动物高毒(最低浓度EC50值0.071mg/L，大型溞)；对底栖动物高毒(最低浓度EC50值0.23mg/L或LC50值0.034mg/kg干沉积，摇蚊属)；对藻类植物中度毒性(最低浓度EC50值1.4mg/L，中肋骨条藻)；对水生植物相对低毒(ErC50值>6.6mg/L，膨胀浮萍)；对土壤生物低毒如蚯蚓(LC50corr值>448mg/kg，干土，赤子爱胜蚯)；对蜜蜂有高的毒性，在急性接触四唑虫酰胺原药后，欧洲蜜蜂比欧洲熊蜂更敏感(LD50值分别为0.41～0.44、22～94μg/蜂)。综上所述，四唑虫酰胺作为杀虫剂对人类和环境可能有一定的影响，其在农产品中的残留可能会带来一定的膳食摄入风险，所以建立农产品中四唑虫酰胺及其代谢物的检测方法具有非常重要的意义。目前，尚无对于农产品中四唑虫酰胺及其代谢物的检测方法。为了了解四唑虫酰胺在农产品中施用后其消解动态用于评估其在农产品中的安全性，因此亟需开发一种能够测定农产品中四唑虫酰胺及其代谢物残留量的方法，这对于提高食品安全质量具有重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种检测四唑虫酰胺及其代谢物残留量的方法及其应用，以解决现有技术中无法对农产品中四唑虫酰胺及其代谢物的残留量进行检测，无法监测四唑虫酰胺在农产品中施用后其消解动态的技术问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种检测四唑虫酰胺及其代谢物残留量的方法，包括以下步骤：
S1、取待测样品加水，以使待测样品含水量大于75％，加入提取剂进行提取，再进行盐析，盐析后固液分离，收集滤液，萃取，浓缩，获得提取液，再利用分散固相萃取剂对提取液中的基质进行净化处理，获得供试溶液；
S2、取不含四唑虫酰胺及其代谢物的同种类基质的空白样品，按照步骤S1进行处理，得到空白样品基质溶液，向空白样品基质溶液中加入四唑虫酰胺及其代谢物标准品以配制得标准溶液，最终配制成含有四唑虫酰胺及其代谢物至少5个梯度浓度的基质标准工作溶液；
S3、定性检测，将步骤S2中的至少5个梯度浓度的基质标准工作溶液和步骤S1的供试溶液进样，用HPLC-MS/MS检测，根据色谱峰保留时间和特异性离子对信息进行定性验证；
S4、定量检测，将步骤S2中的至少5个梯度浓度的基质标准工作溶液进样，用HPLC-MS/MS检测，绘制四唑虫酰胺及其代谢物的基质标准曲线，将步骤S1的供试溶液进样，用HPLC-MS/MS检测，以外标法计算供试溶液中四唑虫酰胺及其代谢物的含量。
进一步地，提取剂包括色谱纯乙腈或含0.1％乙酸的色谱纯乙腈，含0.1％乙酸的色谱纯乙腈为1000mL色谱纯乙腈中含有1mL纯度为99.9％的色谱纯乙酸；盐析采用NaCl和MgSO4进行盐析处理；分散固相萃取剂采用N-丙基乙二胺固相吸附剂。
进一步地，步骤S1的具体步骤包括：取待测样品加水，以使待测样品含水量大于75％，涡旋混匀至少30s，加入提取剂进行提取，涡旋混匀至少2min，再进行盐析，涡旋混匀至少1min，采用离心进行固液分离，离心的转速为4500r/min～5500r/min，时间为3min～7min，收集上清液，萃取提取层，于40℃～50℃水浴旋转蒸发浓缩，获得提取液，利用分散固相萃取剂对提取液中的基质进行净化处理，再进行离心处理，离心处理的转速为11000r/min～13000r/min，时间为3min～5min，获得供试溶液。
进一步地，在获得供试溶液之前，还包括对离心处理后的上清液过0.22μm的有机滤膜。
进一步地，步骤S3中HPLC-MS/MS的高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：ZORBAXRRHD Eclipse Plus C18色谱柱，100mm×3.0mm，1.8μm；柱温箱温度：28℃～42℃；流动相：A相为乙腈，B相为0.1％甲酸水溶液，流动相采用线性梯度洗脱；流速：0.3mL/min～0.5mL/min；进样量：5μL。
进一步地，线性梯度洗脱在0～4min，A相与B相的梯度变化洗脱条件为：0min时A相∶B相的体积比为60∶40，0.5min时A相∶B相的体积比为60∶40，0.6min时A相∶B相的体积比为90∶10，3min时A相∶B相的体积比为90∶10，3.1min时A相∶B相的体积比为60∶40，4min时A相∶B相的体积比为60∶40。
进一步地，线步骤S3中进行定性验证的具体步骤包括：比较供试溶液与基质标准工作溶液保留时间是否一致，以及在扣除背景后的供试溶液质谱图中，观察定量离子和定性离子是否具有明显色谱峰，而且定量离子和定性离子的离子丰度比与相近浓度的基质标准工作溶液的离子丰度比是否一致，一致则判断供试溶液中存在四唑虫酰胺及其代谢物的残留，若两个条件不能同时满足，则判断供试溶液中不存在四唑虫酰胺及其代谢物的残留。
进一步地，步骤S3中HPLC-MS/MS的质谱的检测条件为：离子源类型：ESI+；离子源温度：500℃；气帘气压力：40psi；喷雾气压力：45psi；辅助加热气压力：45psi；离子化电压：5500v检测方式：多重反应监测。
进一步地，多重反应监测参数包括：四唑虫酰胺：保留时间为1.96min，去簇电压为30V，定性离子对(m/z)为545/356和545/376，定量离子对(m/z)为545/356，碰撞电压为19eV和37eV；四唑虫酰胺代谢物：保留时间为2.34min，去簇电压为30V，定性离子对(m/z)为527/389和527/374，定量离子对(m/z)为527/389，碰撞电压为29eV和35eV。
根据本发明的另一方面，还提供了一种上述检测四唑虫酰胺及其代谢物残留量的方法在谷物中的应用。
进一步地，谷物包括玉米或大米。
本发明具有以下有益效果：
本发明检测四唑虫酰胺及其代谢物残留量的方法，利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速并有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将前处理方法结合HPLC-MS/MS用于对谷物中四唑虫酰胺及其代谢物的定性确证和定量检测，可快速的进行四唑虫酰胺及其代谢物残留量的检测，并且检测结果能满足已报道的美国和加拿大部分食品安全检测的20mg/kg的四唑虫酰胺及其代谢物残留限量。上述检测四唑虫酰胺及其代谢物残留量的方法，其回收率较高，重复性好，且平均回收率达到89.8％～96.7％，平均相对标准偏差RSD为1.8％～3.5％，检出限低于0.002mg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。监测四唑虫酰胺在农产品中施用后其消解动态用于评估四唑虫酰胺在农产品中的施用安全性，保障食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明优选实施例1的四唑虫酰胺及其代谢物(0.025μg/mL)鲜玉米供试溶液的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；
图2是不含四唑虫酰胺及其代谢物的鲜玉米空白样品基质溶液的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；
图3是鲜玉米空白样品添加四唑虫酰胺及其代谢物标准品(0.05mg/kg)的HPLCMS/MS选择离子色谱图；
图4是本发明优选实施例1的四唑虫酰胺及其代谢物的基质标准曲线图；
图5是本发明优选实施例2的四唑虫酰胺及其代谢物(0.1μg/mL)大米供试溶液的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；
图6是不含四唑虫酰胺及其代谢物的大米空白样品基质溶液的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；
图7为大米空白样品添加四唑虫酰胺及其代谢物标准品(0.5mg/kg)的HPLCMS/MS选择离子色谱图；
图8是本发明优选实施例2的四唑虫酰胺及其代谢物的基质标准曲线图；
图9是四唑虫酰胺及其代谢物的溶剂标准溶液的HPLC-MS/MS总离子色谱图；以及
图10是对比例1的四唑虫酰胺及其代谢物的溶剂标准曲线图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
图1是本发明优选实施例1的四唑虫酰胺及其代谢物(0.025μg/mL)鲜玉米供试溶液的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；图2是不含四唑虫酰胺及其代谢物的鲜玉米空白样品基质溶液的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；图3是鲜玉米空白样品添加四唑虫酰胺及其代谢物标准品(0.05mg/kg)的HPLCMS/MS选择离子色谱图；图4是本发明优选实施例1的四唑虫酰胺及其代谢物的基质标准曲线图；图5是本发明优选实施例2的四唑虫酰胺及其代谢物(0.1μg/mL)大米供试溶液的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；图6是不含四唑虫酰胺及其代谢物的大米空白样品基质溶液的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；图7为大米空白样品添加四唑虫酰胺及其代谢物标准品(0.5mg/kg)的HPLCMS/MS选择离子色谱图；图8是本发明优选实施例2的四唑虫酰胺及其代谢物的基质标准曲线图；图9是四唑虫酰胺及其代谢物的溶剂标准溶液的HPLC-MS/MS总离子色谱图；图10是对比例1的四唑虫酰胺及其代谢物的溶剂标准曲线图。
本实施例的检测四唑虫酰胺及其代谢物残留量的方法，包括以下步骤：
S1、取待测样品加水，以使待测样品含水量大于75％，加入提取剂进行提取，再进行盐析，盐析后固液分离，收集滤液，萃取，浓缩，获得提取液，再利用分散固相萃取剂对提取液中的基质进行净化处理，获得供试溶液；
S2、取不含四唑虫酰胺及其代谢物的同种类基质的空白样品，按照步骤S1进行处理，得到空白样品基质溶液，向空白样品基质溶液中加入四唑虫酰胺及其代谢物标准品以配制得标准溶液，最终配制成含有四唑虫酰胺及其代谢物至少5个梯度浓度的基质标准工作溶液；
S3、定性检测，将步骤S2中的至少5个梯度浓度的基质标准工作溶液和步骤S1的供试溶液进样，用HPLC-MS/MS检测，根据色谱峰保留时间和特异性离子对信息进行定性验证；
S4、定量检测，将步骤S2中的至少5个梯度浓度的基质标准工作溶液进样，用HPLC-MS/MS检测，绘制四唑虫酰胺及其代谢物的基质标准曲线，将步骤S1的供试溶液进样，用HPLC-MS/MS检测，以外标法计算供试溶液中四唑虫酰胺及其代谢物的含量。
本发明检测四唑虫酰胺及其代谢物残留量的方法，利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速并有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将前处理方法结合HPLC-MS/MS用于对谷物中四唑虫酰胺及其代谢物的定性确证和定量检测，可快速的进行四唑虫酰胺及其代谢物残留量的检测，并且检测结果能满足已报道的美国和加拿大部分食品安全检测的20mg/kg的四唑虫酰胺及其代谢物残留限量。上述检测四唑虫酰胺及其代谢物残留量的方法，其回收率较高，重复性好，且平均回收率达到89.8％～96.7％，平均相对标准偏差RSD为1.8％～3.5％，检出限低于0.002mg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。监测四唑虫酰胺在农产品中施用后其消解动态用于评估四唑虫酰胺在农产品中的施用安全性，保障人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。
待测样品获得采用对农产品进行破碎处理，使四唑虫酰胺及其代谢物游离出来。例如采用多功能食品加工机XBLL-25A对农产品进行破碎处理，使得细胞破壁，实现四唑虫酰胺及其代谢物游离，获得待测样品。上述检测四唑虫酰胺及其代谢物残留量的方法，通过提取农产品中的四唑虫酰胺及其代谢物评估农药残留对人体的安全性。农产品中的四唑虫酰胺及其代谢物是在农作物中施用四唑虫酰胺后，四唑虫酰胺被农作物所吸收，进入农作物的细胞中，部分与细胞中的蛋白或者其他物质有结合，因此，在测定是否有四唑虫酰胺及其代谢物残留时，需要对待测物进行破碎，使四唑虫酰胺及其代谢物游离出来，获得待测样品。然后通过提取剂从固体中萃取出四唑虫酰胺及其代谢物，利用分散固相萃取技术，净化处理，再通过HPLC-MS/MS方法测定四唑虫酰胺及其代谢物的含量，由于农产品中的四唑虫酰胺及其代谢物的HPLC-MS/MS方法会受到农产品自身化学物质的基质干扰，因此，需要通过基质标准曲线进行定量，利用基质标准曲线进行定量测定是为了消除基质效应，降低基质对分析物的分析过程中的干扰，并保证分析结果的准确性。通过定量检测农产品中的四唑虫酰胺及其代谢物，评估农药残留对人体的安全性。
定量检测，将步骤S2中的至少5个梯度浓度的基质标准工作溶液进样，用HPLC-MS/MS检测，以色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，绘制四唑虫酰胺及其代谢物的基质标准曲线，将步骤S1的供试溶液进样，用HPLC-MS/MS检测，在相同条件下测得供试溶液中四唑虫酰胺及其代谢物的色谱峰面积，代入基质标准曲线，计算得到供试溶液中四唑虫酰胺及其代谢物的含量。
本实施例中，提取剂包括色谱纯乙腈或含0.1％乙酸的色谱纯乙腈，含0.1％乙酸的色谱纯乙腈为1000mL色谱纯乙腈中含有1mL纯度为99.9％的色谱纯乙酸；盐析采用NaCl和MgSO4进行盐析处理；分散固相萃取剂采用N-丙基乙二胺固相吸附剂。提取剂采用乙腈或含0.1％乙酸的乙腈，是基于四唑虫酰胺及其代谢物在乙腈中的高溶解度且在复杂基质中用乙腈做提取溶剂可以避免样品中蛋白质和脂肪的干扰，然而，采用酸化乙腈可以获得更好的提取效率，因为酸性条件下目标物比较稳定所得到的回收率会更好。采用石墨化炭黑作为分散固相萃取剂，能去除基质中的色素和甾醇的影响，但是通过前期试验发现，石墨化炭黑对四唑虫酰胺及其代谢物的吸附作用较大，单添加回收率较低(47.5％～58.7％)，不宜采用。因此，采用N-丙基乙二胺(primary secondary amine，PSA)固相吸附剂作为分散固相萃取剂进行净化处理，对多糖、肽类(包括氨基酸)和色素有强吸附作用，而通过比较C18和PSA对鲜玉米的净化效果发现，PSA净化得到的色谱峰基质影响更小，净化效果要优于C18。盐析剂NaCl和MgSO4，10g待测样品，10mL水，加入20mL的提取剂加入5g NaCl和1g MgSO4进行盐析，实际上，可以是1～5g NaCl和0.1～1.0g MgSO4，仅需要满足形成饱NaCl溶液即可，盐析的目的是促进水相和有机相进行分离，因此，加入足量的NaCl后，形成饱和的NaCl溶液，而饱和NaCl溶液与乙腈不能互溶，从而将含有目标化合物的乙腈层和不含目标化合物的样品层进行了分离，便于下一步的分离纯化。
本实施例中，步骤S1的具体步骤包括：取待测样品加水，以使待测样品含水量大于75％，涡旋混匀至少30s，加入提取剂进行提取，涡旋混匀至少2min，再进行盐析，涡旋混匀至少1min，采用离心进行固液分离，离心的转速为4500r/min～5500r/min，时间为3min～7min，收集上清液，萃取提取层，于40℃～50℃水浴旋转蒸发浓缩，获得提取液，利用分散固相萃取剂对提取液中的基质进行净化处理，再进行离心处理，离心处理的转速为11000r/min～13000r/min，时间为3min～5min，获得供试溶液。
上述盐析过程，目的是使待测样品中的水分达到饱和NaCl溶液状态，乙腈与水是互溶，但是乙腈与饱和NaCl溶液不互溶，当待测样品的水分中的NaCl达到饱和溶度后，乙腈层和含样品(不包括四唑虫酰胺及其代谢物)的NaCl溶液出现分层，因为四唑虫酰胺及其代谢物在乙腈中的溶解度大于水，因此，通过乙腈提取的四唑虫酰胺及其代谢物进入乙腈层，实现从待测样品中萃取出四唑虫酰胺及其代谢物的目的。优选地，采用离心进行固液分离，离心的转速为4500r/min～5500r/min，时间为3min～7min，收集上清液，萃取提取层，再对离心后的沉淀物再加入乙腈重复提取1次，离心后合并提取层。
本实施例中，在获得供试溶液之前，还包括对离心处理后的上清液过0.22μm的有机滤膜。0.22μm的有机滤膜能够去除上清液中较大的杂质，防止杂质污染仪器。
本实施例中，线步骤S3中进行定性验证的具体步骤包括：比较供试溶液与基质标准工作溶液保留时间是否一致，以及在扣除背景后的供试溶液质谱图中，观察定量离子和定性离子是否具有明显色谱峰，而且定量离子和定性离子的离子丰度比与相近浓度的基质标准工作溶液的离子丰度比是否一致，一致则判断供试溶液中存在四唑虫酰胺及其代谢物的残留，若两个条件不能同时满足，则判断供试溶液中不存在四唑虫酰胺及其代谢物的残留。定性检测步骤中，定量离子和定性离子的离子丰度比与相近浓度的基质标准工作溶液的离子丰度比，当相对丰度＞50％，允许±20％偏差；当相对丰度＞20％至50％，允许±25％偏差；当相对丰度＞10％至20％，允许±30％偏差；相对丰度≤10％，允许±50％偏差。
本实施例中，步骤S3中HPLC-MS/MS的高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：ZORBAXRRHD Eclipse Plus C18色谱柱，100mm×3.0mm，1.8μm；柱温箱温度：28℃～42℃；流动相：A相为乙腈，B相为0.1％甲酸水溶液，流动相采用线性梯度洗脱；流速：0.3mL/min～0.5mL/min；进样量：5μL。
本实施例中，线性梯度洗脱在0～4min，A相与B相的梯度变化洗脱条件为：0min时A相∶B相的体积比为60∶40，0.5min时A相∶B相的体积比为60∶40，0.6min时A相∶B相的体积比为90∶10，3min时A相∶B相的体积比为90∶10，3.1min时A相∶B相的体积比为60∶40，4min时A相∶B相的体积比为60∶40。
本实施例中，步骤S3中HPLC-MS/MS的质谱的检测条件为：离子源类型：ESI+；离子源温度：500℃；气帘气压力：40psi；喷雾气压力：45psi；辅助加热气压力：45psi；离子化电压：5500v，检测方式：多重反应监测。通过前期试验，确定正离子模式下四唑虫酰胺和代谢物的响应值更高，因此采用正离子模式。
本实施例中，多重反应监测参数包括：保留时间为1.96min，去簇电压为30V，定性离子对(m/z)为545/356和545/376，定量离子对(m/z)为545/356，碰撞电压为19eV和37eV。
根据本发明的另一方面，还提供了一种上述检测四唑虫酰胺及其代谢物残留量的方法在谷物中的应用。上述检测四唑虫酰胺及其代谢物残留量的方法用于对谷物进行检测，采用液相色谱与质谱联用进行检测，可有效检测谷物样品中四唑虫酰胺及其代谢物的残留量，且该方法操作简便、快速、分离效果好，准确度和精密度均能达到定量分析的要求，具有灵敏度高、重复性好、操作简便、快速、准确等优点。优选地，谷物包括玉米或大米。
实施例
高效液相色谱质谱联用仪LC1290-MS-SCIEX 4500Q购自美国安捷伦公司和AB公司；
多功能食品加工机XBLL-25A购自上海帅佳电子科技有限公司；
氯化钠，硫酸镁，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；
乙腈，色谱纯，购自默克化工技术(上海)有限公司；
四唑虫酰胺及其代谢物标准品，纯度99.5％，购自Dr.Ehrenstorfer GmbH。
实施例1
检测四唑虫酰胺及其代谢物残留量的方法，包括以下步骤：
S1、将鲜玉米样品用多功能食品加工机进行粉碎，准确称取10g±0.01mg待测样品至100mL具塞塑料离心管内，加入10mL水，待测样品含水量大于75％，加入20mL的色谱纯乙腈进行提取，涡旋混匀至少2min，再加入5g NaCl和1g MgSO4进行盐析处理涡旋混匀至少1min，于4000r/min离心机中离心5min，取1mL上清液于装有40mg PSA的2mL离心管中，进行净化处理，涡旋混匀至少30s，12000r/min离心机中离心4min，上清液过0.2μm有机系滤膜，获得供试溶液；
S2、准确称取10±0.01mg四唑虫酰胺及其代谢物标准品于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至10mL，配置得到1000.0μg/mL的标准储备液，移取1.0mL标准储备液置于10mL容量瓶中，用乙腈定容得到10.0μg/mL标准中间液，并将10.0μg/mL的标准溶液用乙腈逐级稀释配成浓度为1.0、0.5、0.1、0.05和0.001μg/mL一系列混合标准溶液，取不含四唑虫酰胺及其代谢物的同种类基质的空白样品，按照步骤S1进行处理，得到空白样品基质溶液，在此溶液中加入一定体积上述一系列混合标准溶液，涡旋混匀，分别配成1.0、0.5、0.1、0.05和0.001μg/mL浓度的基质标准工作溶液；
S3、定性检测，将步骤S2中的配成1.0、0.5、0.1、0.05和0.001μg/mL浓度的基质标准工作溶液和步骤S1的供试溶液进样，用HPLC-MS/MS检测，比较保留时间是否一致，以及在扣除背景后的供试溶液质谱图中，观察定量离子和定性离子是否具有明显色谱峰，而且定量离子和定性离子的离子丰度比与相近浓度的基质标准工作溶液的离子丰度比是否一致，一致则判断供试溶液中存在四唑虫酰胺及其代谢物的残留，若两个条件不能同时满足，则判断供试溶液中不存在四唑虫酰胺及其代谢物的残留；
S4、定量检测，将步骤S2中的配成1.0、0.5、0.1、0.05和0.001μg/mL浓度的基质标准工作溶液进样，用HPLC-MS/MS检测，以色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，绘制四唑虫酰胺及其代谢物的基质标准曲线，将步骤S1的供试溶液进样，用HPLC-MS/MS检测，在相同条件下测得供试溶液中四唑虫酰胺及其代谢物的色谱峰面积，代入基质标准曲线，计算得到供试溶液中四唑虫酰胺及其代谢物的含量，然后根据供试溶液所代表试样的质量计算得到鲜玉米样品中及其代谢物残留量；
其中，HPLC-MS/MS色谱条件为：
色谱柱：ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18色谱柱，3.0×100mm，1.8μm；
样品室温度：35℃；
流动相：0.1％甲酸水溶液和乙腈；
流动相梯度洗脱条件如表1所示，
表1流动相梯度洗脱条件
流速：0.4mL/min；
进样量：5μL。
质谱检测条件包括：
离子源类型：ESI+；
离子源温度：500℃；
气帘气压力：40psi；
喷雾气压力：45psi；
辅助加热气压力：45psi；
离子化电压：5500v
检测方式：多重反应监测(MRM)，参数如下表2。
表2待测成分主要MRM参数
(一)加标回收率和重复性试验
在不含四唑虫酰胺及其代谢物的新鲜玉米中加入5、50和500μg/kg 3个浓度水平的四唑虫酰胺及其代谢物的标准溶液，吸收30min后按上述步骤S4处理进行残留量测定，将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定5次，得其相对标准偏差。
(二)检出限试验
将四唑虫酰胺及其代谢物的标准溶液注入HPLC-MS/MS，以最低浓度鲜玉米基质标准溶液色谱峰的信噪比推算得到3倍信噪比所对应目标物的浓度为方法检出限。
实施例2
检测四唑虫酰胺及其代谢物残留量的方法，包括以下步骤：
S1、将大米样品用多功能食品加工机进行粉碎，准确称取10g±0.01mg待测样品至100mL具塞塑料离心管内，加入10mL水，待测样品含水量大于75％，加入20mL的含0.1％乙酸的色谱纯乙腈进行提取，涡旋混匀至少2min，再加入5g NaCl和1g MgSO4进行盐析处理涡旋混匀至少1min，于5000r/min离心机中离心5min，取1mL上清液于装有40mg PSA的2mL离心管中，进行净化处理，涡旋混匀至少30s，12000r/min离心机中离心5min，上清液过0.2μm有机系滤膜，获得供试溶液；
S2、准确称取10±0.01mg四唑虫酰胺及其代谢物标准品于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至10mL，配置得到1000.0μg/mL的标准储备液，移取1.0mL标准储备液置于10mL容量瓶中，用乙腈定容得到10.0μg/mL标准中间液，并将10.0μg/mL的标准溶液用乙腈逐级稀释配成浓度为1.0、0.5、0.1、0.05和0.001μg/mL一系列混合标准溶液，取不含四唑虫酰胺及其代谢物的同种类基质的空白样品，按照步骤S1进行处理，得到空白样品基质溶液，在此溶液中加入一定体积上述一系列混合标准溶液，涡旋混匀，分别配成1.0、0.5、0.1、0.05和0.001μg/mL浓度的基质标准工作溶液；
S3、定性检测，将步骤S2中的配成1.0、0.5、0.1、0.05和0.001μg/mL浓度的基质标准工作溶液和步骤S1的供试溶液进样，用HPLC-MS/MS检测，比较保留时间是否一致，以及在扣除背景后的供试溶液质谱图中，观察定量离子和定性离子是否具有明显色谱峰，而且定量离子和定性离子的离子丰度比与相近浓度的基质标准工作溶液的离子丰度比是否一致，一致则判断供试溶液中存在四唑虫酰胺及其代谢物的残留，若两个条件不能同时满足，则判断供试溶液中不存在四唑虫酰胺及其代谢物的残留；
S4、定量检测，将步骤S2中的配成1.0、0.5、0.1、0.05和0.001μg/mL浓度的基质标准工作溶液进样，用HPLC-MS/MS检测，以色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，绘制四唑虫酰胺及其代谢物的基质标准曲线，将步骤S1的供试溶液进样，用HPLC-MS/MS检测，在相同条件下测得供试溶液中四唑虫酰胺及其代谢物的色谱峰面积，代入基质标准曲线，计算得到供试溶液中四唑虫酰胺及其代谢物的含量，然后根据供试溶液所代表试样的质量计算得到大米样品中四唑虫酰胺及其代谢物残留量；
其中，HPLC-MS/MS色谱条件为：
色谱柱：ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18色谱柱，3.0×100mm，1.8μm；
样品室温度：38℃；
流动相：0.1％甲酸水溶液和乙腈；
流动相梯度洗脱条件如表3所示。
表3流动相梯度洗脱条件
流速：0.4mL/min；
进样量：5μL。
质谱检测条件包括：
离子源类型：ESI+；
离子源温度：500℃；
气帘气压力：40psi；
喷雾气压力：45psi；
辅助加热气压力：45psi；
离子化电压：5500v
检测方式：多重反应监测(MRM)，参数如下：
表4待测成分主要MRM参数
(一)加标回收率和重复性试验
在不含四唑虫酰胺及其代谢物的大米中加入5、50和500μg/kg 3个浓度水平的四唑虫酰胺及其代谢物的标准溶液，吸收30min后按上述步骤S4处理进行残留量测定，将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定5次，得其相对标准偏差。
(二)检出限试验
将四唑虫酰胺及其代谢物的标准溶液注入HPLC-MS/MS，以最低浓度鲜玉米基质标准溶液色谱峰的信噪比推算得到3倍信噪比所对应的目标物浓度为方法检出限。
对比例1
准确称取10±0.01mg四唑虫酰胺及其代谢物标准品于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至10mL，配置得到1000.0μg/mL的标准储备液，移取1.0mL标准储备液置于10mL容量瓶中，用乙腈定容得到10.0μg/mL标准中间液，并将10.0μg/mL的标准溶液用乙腈逐级稀释配成浓度为1.0、0.5、0.1、0.05和0.001μg/mL一系列混合标准溶液，将上述标准溶液进样，用HPLC-MS/MS检测，绘制四唑虫酰胺及其代谢物的溶剂标准曲线，其他与实施例1相同。
实施例1中的测定结果，图1为四唑虫酰胺及其代谢物(0.025μg/mL)鲜玉米供试溶液的HPLC-MS/MS选择离子色谱图，图2为不含四唑虫酰胺及其代谢物的鲜玉米空白样品基质溶液的HPLC-MS/MS选择离子色谱图，图3为鲜玉米空白样品添加四唑虫酰胺及其代谢物标准品(0.05mg/kg)的HPLCMS/MS选择离子色谱图，说明玉米供试溶液中的四唑虫酰胺及其代谢物，与四唑虫酰胺及其代谢物标准品色谱峰保留的时间相一致，且定量离子和定性离子的离子丰度比与相近浓度的标准品的离子丰度比一致。
图4为实施例1的四唑虫酰胺及其代谢物的基质标准曲线，公式为：y＝8573051.47x+32806.28，R2＝0.9996。
实施例1的加标回收率和重复性试验结果如表5所示。
表5鲜玉米中四唑虫酰胺及其代谢物的回收率和重复性
由表5可以看出，在3个加标水平上，四唑虫酰胺的平均回收率为89.8％～95.1％，平均相对标准偏差(RSD)为1.8％～3.4％，四唑虫酰胺代谢物(BCS-CQ63359)的平均回收率为84.0％～91.8％，平均相对标准偏差(RSD)为0.8％～5.9％，说明上述检测四唑虫酰胺及其代谢物残留量的方法回收率较高，重复性好。
实施例1的检出限试验测试结果，鲜玉米的四唑虫酰胺及其代谢物的检出限为0.13μg/kg。
实施例2中的测定结果：图5给出了四唑虫酰胺及其代谢物(0.1μg/mL)大米供试溶液的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；图6为不含四唑虫酰胺及其代谢物的大米空白样品基质溶液的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；图7为大米空白样品添加四唑虫酰胺及其代谢物标准品(0.5mg/kg)的HPLCMS/MS选择离子色谱图，说明大米供试溶液中的四唑虫酰胺及其代谢物，与四唑虫酰胺及其代谢物标准品色谱峰保留的时间相一致，且定量离子和定性离子的离子丰度比与相近浓度的标准品的离子丰度比一致。
图8为实施例2的四唑虫酰胺及其代谢物的基质标准曲线，公式为：y＝9010410.71x+61886.34，R2＝0.9983。
实施例2的加标回收率和重复性试验结果如表6所示。
表6大米中四唑虫酰胺及其代谢物的回收率和重复性
由表6可以看出，在3个加标水平上，四唑虫酰胺的平均回收率为90.1％～96.7％，平均相对标准偏差(RSD)为2.6％～3.5％，四唑虫酰胺代谢物(BCS-CQ63359)的平均回收率为86.4％～93.3％，平均相对标准偏差(RSD)为1.2％～1.7％，说明本发明方法的回收率较高，重复性较好。
实施例2的检出限试验测试结果，大米的四唑虫酰胺及其代谢物的检出限为0.1μg/kg。
对比例1的测定结果：如图10所示的四唑虫酰胺及其代谢物的溶剂标准曲线，公式为：y＝8133832.49x+16948.44，R2＝0.9996，并参见图9四唑虫酰胺及其代谢物的溶剂标准溶液的HPLC-MS/MS总离子色谱图。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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