一种同时检测多种外源性和内源性甾体激素的方法
技术领域
本发明涉及检测分析
技术领域
，具体涉及一种同时检测多种外源性和内源性甾体激素的方法，尤其涉及一种同时检测54种或以上的外源性和内源性甾体激素的方法。背景技术
生物样品中甾体激素的测定，在公开发表的论文中有过报道，但是多为体内甾体激素，也称类固醇激素的测定，外源性甾体激素体内测定报道较少，也没有同时测定外源性和内源性共54个甾体激素的报道。
在之前的文献和公开专利中，有一些测定甾体激素的方法报道，但是因为甾体激素种类众多，结构类似，在分析上一直具有比较大的挑战。主要的挑战包括：甾体激素种类众多，从来源上可以分为内源性甾体激素和外源性甾体激素，内源性甾体激素来源于人体或者动物体的自身分泌，是身体功能正常运行的重要化学成分，作为激素的一种，在调节人体和动物体的生物功能上扮演着重要的作用；外源性甾体激素目前主要来源于药物(包括人药和兽药，大量的甾体激素在医药中被使用，特别是糖皮质激素，部分药物的不当使用会造成人体中外源性的甾体激素增加)、食品(主要来源于兽药的残留，兽药中的甾体激素会在动物源性的食品中残留，借食品的途径被人体摄入，包括动物肌肉、肝脏、肾脏、奶制品以及相关的其他肉奶制品；另外，保健食品中甾体激素的非法添加也会成为人体内甾体激素暴露的来源之一；)、环境(主要通过人类及动物的排泄，医院、制药厂废水的排放等途径进入环境，污水处理厂、畜牧场和水产养殖场是环境中类固醇激素的主要来源。目前的污水处理系统不能完全除去这些甾体激素，使得甾体激素和其代谢物在环境中蓄积，通过环境进一步被人体吸收入体内)、化妆品(糖皮质激素是皮肤科最常见的外用药物，可抑制纤维细胞再生，对皮肤具有一定的美白功效，但长期使用会产生激素依赖症及其他副作用，甚至引发癌症，对人体造成严重伤害。我国《化妆品卫生规范》2007版明确规定，糖皮质激素属于禁用物质。但是由于其具有明显的美白、祛痘等效果，不少厂家仍然非法向化妆品中添加糖皮质激素类物质)外源性甾体激素和内源性甾体激素列表见下表所示：
外源性甾体激素和内源性激素结构上有一定的类似性，外源性激素均为非体内自身分泌的激素，而是来源于人工合成的激素。外源性的激素因为其对人体的影响很大，目前也被称为内分泌干扰物质，这类化合物在低浓度下就可以干扰生物机体的内分泌系统正常功能，长时间暴露于低浓度内分泌干扰物质可能会导致一系列生殖和发育问题。目前已经发现男性精力数量出现下降，女性乳腺癌发病率上升，新生儿免疫力下降，这些现象都被证明和内分泌干扰物质有关。动物的调查显示，一些鸟类出现蛋壳变薄，孵化率下降，海豹免疫力下降，鱼类雌性化现象明显，雄鱼生殖腺退化。目前虽然甾体激素对于生物体健康状况的影响很大，但是对于这些甾体激素体内决定定量的报道非常有限，偶见报道也只是集中于少数外源性的甾体激素，没有涵盖市场上所有常见的外源性甾体激素。另外，也有报道仅测定体内内源性的甾体激素。体内甾体激素的含量常用于评价人体或者生物体的病理状态，例如21-羟化酶缺乏，11β-羟化酶缺乏，17-羟化酶缺乏，3-羟基类固醇脱氢酶缺乏，多囊卵巢综合征等等疾病。但是对于体内所有甾体激素的绝对定量，特别是对于外源性甾体激素的体内含量绝对定量，对于评价人体的健康状态至关重要。因为外源性甾体激素，对人体影响很大，长期暴露会造成很多的潜在的健康问题，这些化合物都是造成疾病的严重潜在风险，尽早检测尽早干预，对于人体的健康至关重要。
但是目前对于人体和动物体内外源性和内源性的甾体激素的测定方法非常有限，特别是同时测定所有主要的外源性甾体激素以及内源性甾体激素尚未见报道。
同时测定体内众多的外源性激素和内源性激素存在以下挑战：(1)甾体激素的结构类似，甚至有很多的同分异构体，特别是大量甾体激素在一起同时测定的时候，这个问题就更加的突出，仅测定20-30个甾体激素就已经非常挑战了，但是随着经济和市场的发展，仅仅测定20-30个激素其实是远远不够的，这样就必须解决激素的良好分离和准确测定的问题；(2)体内甾体激素的含量彼此之间相差很大，有的激素含量很高，有的激素含量很低，在众多激素同时测定的时候，需要兼顾高浓度激素和低浓度激素，解决这个问题最大的挑战在于样品的前处理条件的优化和检测器条件的设置；(3)体内激素的检测使用生物样品基质复杂，在检测20个以内的激素时，可以尽量的把激素和基质进行分离，减少基质的影响，但是当需要分析的激素数目越来越多的时候，激素在色谱行为上分布在整个分析周期的各个时间，这时避开和减少基质效应的影响就变得更加挑战；(4)甾体激素在血中主要以原型形式存在，在尿中主要以葡萄糖醛酸结合物以及原型的形式存在，需要特别对待，不能以尿中甾体激素原型的含量直接来表现体内甾体激素的暴露，这样会使测定结果偏低，造成分析结果和评价方案不合理；(5)虽然需要同时定量的甾体激素数目很多，但是分析时间要尽可能的短，因为体内样品通常很多，面对成千上万个样品的分析必须尽可能的简化样品的前处理时间和分析的时间，否则不能满足于体内样品检测样品量大、需要快速出报告的要求。
其中专利文献CN103698414A中记载了一种基于化学衍生的尿液中甾体激素的检测方法，提供了一种采用4-二甲氨基苯甲酸作为新型衍生化试剂，结合高分辨高灵敏度的液相色谱-质谱检测仪器用于检测衍生化后的尿中甾体激素的方法。但该专利衍生化需要的时间太长，仅衍生化的反应就需要在75度水浴的条件下进行5个小时。针对临床样品来说，不计算其他操作，仅衍生化就要用掉5个小时的时间，可能实在是太长了，临床样品的检测没有办法等待这么长时间。另外，75度的水浴温度太高，对激素的稳定影响很大，通常来说，激素的标准品和生物样品都是在-20度或者-80度保存以保证其稳定性，在这么高温度的长时间水浴下，很多激素的含量会发生变化而不能准确测定了。另外，该专利只检测了内源性的甾体激素而且在质谱仪中分析一个样品的时间需要37分钟以上(见专利附图，最后一个色谱峰出完是37分钟，后面还有色谱柱再生的时间未体现在附图上)，37分钟以上对于一个临床样品的分析，时间同样太长了。加上样品提取、衍生化反应和质谱分析，一个样品的分析周期大约需要6-7个小时。每个样品出报告的时间太长，而且不能用于大规模人群的测定。
专利文献CN110187043A中记载了一种种同时检测血清中13种甾体激素的方法，其采用的超高效液相色谱-串联质谱技术对所述检测液进行检测，也是仅针对内源性的血液中的甾体激素进行了检测，检测的甾体激素数量有限且仅限于内源性的甾体激素，仅限于血液样品。专利文献CN 106198786 A中记载了一种UPLC-MS/MS技术快速检测尿甾体激素的方法，其采用β-葡萄糖醛酸酶酶解法结合UPLC-MS/MS技术快速同时检测人尿5种甾体激素。检测的甾体激素非常有限且仅限于内源性甾体激素，酶解时间需要3个小时，不适用于临床样品高通量分析的需求。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种同时检测多种外源性和内源性甾体激素的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种同时检测多种外源性和内源性甾体激素的方法，包括以下步骤：
A、将待测样品进行前处理；
B、将步骤A处理后的待测样品在SPE板上样；
C、加入乙腈和水的混合溶液进行洗脱；
D、再加入己烷洗脱，弃去洗脱液；
E、加入甲醇和乙腈的混合溶液进行洗脱，收集洗脱液；
F、将步骤D的洗脱液稀释后注入LC-MS质谱仪进行检测分析，得多种外源性和内源性甾体激素的含量；
所述外源性和内源性甾体激素的检测种类为54种或以上。
优选地，步骤A中，所述待测样品为血清样品或尿液样品。
优选地，所述待测样品为血清样品时，其前处理的方法包括：将血清样品中加入甲醇和水，斡旋离心，所得上清液进行后续处理。
优选地，所述待测样品为尿液样品时，其前处理的方法包括：将尿液样品中加入磷酸盐缓冲液，再加入葡萄糖醛酸化酶进行酶解，55℃孵育1个小时，冷却至室温；所得上清液进行后续处理。
优选地，所述尿液样品、磷酸盐缓冲液和葡萄糖醛酸化酶的添加体积比为2:1:0.05；若采用的磷酸盐缓冲液过多(例如体积比2:2:0.05)或过少(例如2:0.5:0.05)、葡萄糖醛酸酶过多(例如体积比2:1:0.1)或过少(例如体积比2:1:0.02)时，会对尿液中待测的甾体激素的释放率和实验的稳定性产生影响，葡萄糖醛酸酶的量不需再增加，继续增加是对酶的浪费。尿液样品、磷酸盐缓冲液和葡萄糖醛酸化酶的添加体积比2:1:0.05是酶解的最佳配方，可以达到最佳的效果和最合适的时间，在1个小时就可以完成稳定的高效率的酶解释放，大大减少了样品的前处理时间，达到最佳效果和效率。
优选地，葡萄糖醛酸化酶选用来源于罗曼蜗牛的β-葡萄糖醛酸酶。β-葡萄糖醛酸酶有很多种，分别来源于大肠杆菌，牛肝脏，帽贝(Patella vulgata)，通过实验发现不同的β-葡萄糖醛酸酶对于甾体激素结合物的释放效果是不同的。来源于罗曼蜗牛的β-葡萄糖醛酸酶是适合的，能够把尿液中的待测甾体激素全部稳定释放出来，同时不干扰甾体激素本身的稳定性，而来源于大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶等其他的β-葡萄糖醛酸酶均不能实现甾体激素的充分释放。
优选地，步骤C中，所述乙腈和水的混合溶液中，乙腈和水的体积比为1:9；优化了除去杂质和基质的洗脱溶液配比，乙腈和水比例为1:9时为最佳的配比，不会影响到甾体激素在SPE板上的保留，同时可以最大程度的除去的杂质和背景基质。
步骤D中，所述己烷为正己烷；正己烷为最佳的洗脱溶液，不会影响甾体激素在SPE板上的保留，同时可以最大程度的除去极性较弱的杂质和背景基质。
步骤E中，所述甲醇和乙腈的混合溶液中，甲醇和乙腈的体积比为1:9；优化了洗脱甾体激素的最佳溶液，甲醇和乙腈的比例为1:9可以把甾体激素充分地从SPE板上洗脱。
优选地，步骤E中，采用所述LC-MS质谱仪进行分析时，采用的液相分析条件为：
色谱柱采用ACQUITY BEH C18色谱柱；
采用的流动相A为水；流动相B为乙腈和含有0.1％FA的甲酸铵水溶液的混合液，其中甲酸铵水溶液在混合液中的浓度为10mM；
我们发现仅采用0.1％的FA(甲酸)不能实现数量这么多的甾体激素的良好分离，甲酸铵是很有效的改性剂，乙酸铵的效果不如甲酸铵。另外，甲酸铵的浓度对于分离效果也有影响，10mM的甲酸铵能够达到最佳的分离效果，过高浓度的甲酸铵(超过20mM,包括20mM,30mM,40mM)对化合物的响应会产生一定的影响，较低浓度的甲酸铵(5mM)对于流动相系统分离效果的稳定性不足。
采用的流动相梯度条件为：
流动相的梯度对于这么多的甾体激素同时分析，也会起到关键的作用。始终采用相同的流速，例如0.3ml/min或者0.4ml/min均不能达到满意的效果；在7分钟之内，采用0.3ml/min的流速，7.2-14分钟采用0.4ml/min的流速，能够在有限的分析周期内对所有的甾体激素实现良好的分离。
优选地，当同时检测的外源性和内源性甾体激素为54种化合物时，因为同时检测的甾体激素数目多而且含量相差较大，另外，还有背景基质的影响，需要对分析条件进行大量的优化。
在质谱条件优化过程中，选择和优化了不同的检测用母离子和子离子，选择和优化了不同的碰撞电压和解簇电压，
最优的质谱分析条件为：
除了选定的最终采用的质谱检测条件之外，其余所有的检测用母离子、子离子和相应的质谱参数均不是最佳条件。在母离子和子离子的选择中，考察了不同母离子和子离子对于分析的适用性，实验证明，虽然有的母离子和子离子确实对于提高检测的灵敏度有帮助，但是不适合生物样本的检测用，有的会有基质的干扰，有的离子不稳定，均不能满足分析的要求。
曾经优化过的主要的母离子、子离子和相应的质谱参数列表如下(通过实验验证，除了本发明中采用的系列参数，该表所示的其他质谱参数条件无法满足分析要求)：
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明方法实现了在同一个样品中，同时检测至少54个甾体激素，该54个甾体激素涵盖了来源于药品、食品、环境等，使人体和动物体暴露其中的常见的所有外源性甾体激素(42个)以及主要的内源性激素(13个)。通过这种方法，可以快速评价生物体的外源性激素暴露水平和内源性激素水平。本发明操作简便、分析时间仅需15分钟，建立和验证了2种最主要的生物基质(血清和尿液)，未来可用于血清和尿液中甾体激素的准确含量测定。该发明大大提高了体内甾体激素检测的速度、通量和覆盖的甾体激素的种类和数量，可以对各种生物体、病人、健康人进行快速的综合的评价。和甾体激素直接相关的表征，都可以通过这种方法进行快速分析和评价。
2、该发明特别是针对目前来源于药品、食品、环境和化妆品的众多外源性甾体激素暴露，所对人体造成的高风险隐患，提供了分析方法，可以尽早的进行检测、尽早进行干预，避免了未来潜在的疾病风险。
3、本发明测定了47个儿童的血清样品和尿液样品，结果发现血清样品和尿液样品中甾体激素的含量变化趋势一致，结果表明，未来尿液可以代替血清作为甾体激素的评价用生物样品。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施例1中分析得到的54个甾体激素的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1测定54个甾体激素的定量限、标准曲线、回归方程和色谱图
步骤一，将54个甾体激素的标准品分别依次配置不同浓度的标准品溶液0.01ng/ml，0.05ng/ml，0.1ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml；
步骤二，分别取以上54种甾体激素系列标准溶液250微升，加入250微升甲醇，加入250微升水，涡旋离心，沉淀蛋白；
步骤三，取600微升上清液，在SPE板上样；
步骤四，加入乙腈：水(1:9)洗脱；
步骤五，加入200微升己烷洗脱，弃去洗脱液；
步骤六，加入30微升甲醇/乙腈(1:9)，收集洗脱液；
步骤七，洗脱液加入30微升水稀释；
步骤八，稀释液(10微升)注入LC-MS质谱仪进行分析；
色谱柱采用ACQUITY BEH C18色谱柱；
采用的流动相A为水；流动相B为乙腈和含有0.1％FA的甲酸铵水溶液的混合液，其中甲酸铵水溶液在混合液中的浓度为10Mm；
采用的流动相梯度条件为表1所示：
表1
采用的具体质谱分析条件为表2所示：
表2
通过分析54个甾体激素系列不同浓度的标准溶液，得到54个甾体激素的标准回归方程和线性回归系数见表3。
表3 54个甾体激素的标准回归方程和回归系数
NA：检测限为标准曲线最高点，采用单点计算含量；
以标准曲线最低点作为54个甾体激素的检测定量限LOQ，54个甾体激素的检测定量限见下表4所示。
表4
54个甾体激素的色谱图结果如图1所示，图1显示了54个甾体激素的MRM总离子流图的叠加图。
实施例2同时测定54个甾体激素的方法回收率
步骤一，取54个甾体激素混合标准品溶液(10ng/mL)250微升，加入250微升甲醇，加入250微升水，涡旋离心，沉淀蛋白；
步骤二，取600微升上清液，在SPE板上样；
步骤三，加入乙腈：水(1:9)洗脱；
步骤四，加入200微升己烷洗脱，弃去洗脱液；
步骤五，加入30微升甲醇/乙腈(1:9)，收集洗脱液，洗脱液加入30微升水稀释；
步骤六，稀释液(10微升)注入LC-MS质谱仪进行分析；
步骤七，该化合物峰面积与未经萃取的标准品的峰面积进行比对，求得回收率。
采用的具体液相分析条件和质谱分析条件与实施例1相同。
所得方法回收率计算结果见表5。
表5 54个甾体激素的方法回收率计算结果
NA：回收率考察用浓度未达到该化合物检测限。
实施例3 46个儿童血清中54个甾体激素含量测定
本实施例提供了一种54个甾体激素含量测定方法，步骤如下：
步骤一：按照标准方法采集血清样本，-80℃保存至测定之前，测定前融化样品准备测定；
步骤二：取250微升血清样本，加入250微升甲醇，加入250微升水，涡旋离心，沉淀蛋白；
步骤三：取600微升上清液，在SPE板(SPE板型号：Oasis PRiME HLBμElution96plate)上样；
步骤四：加入乙腈/水(体积比1:9)的混合溶液洗脱，再加入200微升己烷洗脱，弃去洗脱液；
步骤五：加入30微升甲醇/乙腈(体积比1:9)的混合溶液，收集洗脱液，洗脱液加入30微升水稀释；
步骤六：稀释液(10微升)注入LC-MS质谱仪进行分析；采用的具体液相分析条件和质谱分析条件与实施例1相同。
采用本发明的方法测定46个儿童血清中54个甾体激素，结果如表6所示。其中：
Cases:性早熟组(n＝23)
Control：健康儿童组(n＝23)
Average concentration of Serum in cases(ng/mL)(n＝23):性早熟组儿童血清中各个甾体激素的平均浓度(ng/mL)(n＝23)
SD of plasma in cases(n＝23)：性早熟组儿童血清中各个甾体激素的偏差(ng/mL)(n＝23)
Average concentration of Serum in control(ng/mL)(n＝23)：健康儿童组儿童血清中各个甾体激素的平均浓度(ng/mL)(n＝23)
SD of plasma in control(n＝23)：健康儿童儿童血清中各个甾体激素的偏差(ng/mL)(n＝23)
P values：性早熟组和健康儿童组甾体激素含量的差异T检验结果；
Fold Change：性早熟组和健康儿童组甾体激素含量的变化比值。
表6
NA：未检出
其中测得的3个性早熟儿童(样品1-3)和3个健康儿童(样品4-6)的血清中54个甾体激素结果如表7所示。
表7
NA：未检出
实施例3 46个儿童尿液中54个甾体激素含量测定
本实施例提供了一种54个甾体激素含量测定方法，步骤如下：
步骤一：按照标准方法采集尿液样本，-80℃保存至测定之前，测定前融化样品准备测定；
步骤二：取0.5毫升尿液样本，加入0.25毫升磷酸盐缓冲液，加入12.5微升来源于罗曼蜗牛的葡萄糖醛酸化酶进行酶解，55℃孵育1个小时，冷却至室温；
步骤三：取600微升上清液，在SPE板(SPE板型号：Oasis PRiME HLBμElution 96plate)上样；
步骤四：加入乙腈/水(体积比1:9)的混合溶液洗脱，再加入200微升己烷洗脱，弃去洗脱液；
步骤五：加入30微升甲醇/乙腈(体积比1:9)的混合溶液，收集洗脱液，洗脱液加入30微升水稀释；
步骤六：稀释液(10微升)注入LC-MS质谱仪进行分析；
采用的具体液相分析条件和质谱分析条件与实施例1相同。
采用本发明的方法测定46个儿童尿液中54个甾体激素，结果如表8所示。其中：
Cases:性早熟组(n＝23)
Control：健康儿童组(n＝23)
Average concentration of Serum in cases(ng/mL)(n＝23):性早熟组儿童尿液中各个甾体激素的平均浓度(ng/mL)(n＝23)
SD of plasma in cases(n＝23)：性早熟组儿童尿液中各个甾体激素的偏差(ng/mL)(n＝23)
Average concentration of Serum in control(ng/mL)(n＝23)：健康儿童组儿童尿液中各个甾体激素的平均浓度(ng/mL)(n＝23)
SD of plasma in control(n＝23)：健康儿童儿童尿液中各个甾体激素的偏差(ng/mL)(n＝23)
P：性早熟组和健康儿童组甾体激素含量的差异T检验结果
Fold Change：性早熟组和健康儿童组甾体激素含量的变化比值。
表8
NA：未检出
其中测得的与实施例3相同的3个性早熟儿童(样品1-3)和3个健康儿童(样品4-6)的血清中54个甾体激素结果如表9所示。
表9
NA：未检出
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
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