检测pHLA复合物中抗原肽的超滤-高效液相色谱法
技术领域
本发明属于蛋白与多肽互作研究
技术领域
，具体涉及检测pHLA复合物中抗原肽的超滤-高效液相色谱法。背景技术
HLA-I类分子(human lymphocyte antigen class I molecules)是由高度多态性的重链跨膜糖蛋白(HC)和β2微球蛋白(β2m)组成的异源二聚体。内源性抗原经抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APCs)处理后，产生与HLA-I类分子结合的抗原肽(又称抗原CTL表位肽)，通过APCs的抗原递呈作用，被CD8+ T细胞抗原受体(TCR)特异性识别，诱导形成细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)克隆产生免疫应答。HLA-I类分子HC的α1和α2结构域形成抗原肽结合槽，抗原肽结合槽底部有6个小袋状凹陷(A→Fpocket)，其中A pocket和F pocket上的保守氨基酸与多肽N末端氨基和C末端氨基形成氢键，对结合的抗原肽起到固定作用。同一等位型的HLA-I类分子通过识别多肽序列上特定的锚定氨基酸残基(anchor amino acid residues)，可以结合多种抗原肽。筛选不同肽与HLA-I类分子相互作用形成HLA-I类分子/抗原肽复合物(pHLA复合物)的研究有助于发现新抗原CTL表位肽，对于阐明CD8+ T细胞特异免疫识别机制，研制多肽疫苗及发展特异性细胞免疫治疗都具有重要意义。而且在pHLA基础上发展的HLA四聚体技术也为CTL的特异性检测与研究提供更直接、有效的方法。
目前获得pHLA复合物的常用方法是分别重组表达HC和β2m，在复性缓冲液中结合抗原肽后获得。然而pHLA复合物的人工复性过程受复性缓冲液体系包括HC、β2m、抗原肽的摩尔数之比、pH值和温度以及电解质条件的影响，复性效果不易控制，耗时长，且容易形成HC二聚体和极度不稳定的空载HLA分子。因此在其制备过程中，需要对制备产物进行检测以优化复性条件，促进HC、β2m的正确折叠及与抗原肽之间相互作用形成pHLA复合物。此外由于HLA的高度多态性，不同型别的HLA-I类分子又可通过识别多肽基序结合多种抗原肽，理论上可形成无数种pHLA复合物。筛选与HLA-I类分子相互作用的抗原肽、研究pHLA复合物生物学功能、或者探索pHLA复合物制备条件，往往采用少量的复性缓冲液制备体系，不仅成本低，而且易于操作。
目前验证制备pHLA复合物成功与否的常用方法有Western blot、ELISA以及层析分离技术等方法。使用HLA-I类分子构象特异性抗体W6/32进行Western blot、ELISA等方法是验证少量制备pHLA复合物成功与否的最常用方法，其中W6/32是抗HLA-I类分子的单克隆构象抗体，能识别HC、β2m折叠后与抗原肽结合形成HC-α2区的特定表位，与单独的β2m不能结合，与单独的HC仅有极微弱结合。但基于构象特异性抗体W6/32进行Western blot、ELISA等方法只能定性检测pHLA复合物是否形成，并不能定量检测pHLA复合物中结合的抗原肽。而且有研究表明体外稀释复性获得的pHLA复合物可能具有不同的构象，但具有相同的生物学活性。这种构象差异有可能无法被构象特异性抗体W6/32特异性识别而导致鉴定结果具有不确定性。因此对于pHLA复合物的质量检测及制备条件探索过程中对少量pHLA复合物制备产物的检测鉴定还需要寻找其他方法，亟待建立一种能够定量检测重组pHLA复合物中的抗原肽的方法。
发明内容
本发明公开了检测pHLA复合物中抗原肽的超滤-高效液相色谱法，可用于pHLA复合物中结合的抗原肽的定量检测。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
检测pHLA复合物中抗原肽的超滤-高效液相色谱法，包括如下步骤：
(1)对pHLA复合物进行超滤处理，去除游离的抗原肽；
(2)使用酸性溶液对pHLA复合物进行处理；
(3)对步骤(2)获得的溶液超滤，收集抗原肽溶液；
(4)HPLC测定抗原肽溶液中的抗原肽含量。
优选地，还包括前处理步骤：将HLA-I类分子与含锚定残基位点的抗原肽共复性，产生相互作用，形成pHLA复合物。
优选地，HLA-I类分子由重组HC蛋白和重组β2m蛋白组成，或所述HLA-I类分子为重组β2m/HC融合蛋白；
HLA-I类分子与含锚定残基位点的抗原肽共复性在复性缓冲液中进行；
复性缓冲液中包含100-500mmol/L左旋精氨酸L-Arginine，10-500mmol/L TrisHCl，0.1-10mmol/L EDTA，0.1-5mmol/L氧化型谷胱甘肽，1-10mmol/L还原型谷胱甘肽，pH为7-9；
复性缓冲液中HLA-I类分子的摩尔浓度为0.5-10μmol/L；
重组HC蛋白、重组β2m蛋白、含锚定残基位点的抗原肽摩尔比为1：(1-10)：(5-100)；或者重组β2m/HC融合蛋白、含锚定残基位点的抗原肽摩尔比为1：(5-100)；
共复性温度为10-14℃，复性时间为12-48h。
重组HLA-I类分子/抗原肽复合物(pHLA复合物)在研究人类T细胞特异性免疫应答中有重要用途。pHLA复合物的制备以基因工程及蛋白体外稀释折叠复性技术为基础，其关键在于重组HLA-I类分子在复性体系中正确折叠，并结合抗原肽形成复合物。本发明通过对重组HLA-I类分子和抗原肽进行上样前处理，在复性缓冲液中重组HLA-I类分子的重链HC与轻链β2m复性折叠，与含锚定残基的抗原肽产生相互作用而形成pHLA复合物；经超滤去除未结合的游离抗原肽而保留复合物，最后将pHLA复合物经酸处理破坏其相互作用从而释放抗原肽，再超滤收集抗原肽并进行HPLC检测，所测得的抗原肽量即为重组HLA-I类分子与抗原肽相互作用所结合抗原肽的量。根据所制备的重组pHLA复合物可被HLA-I分子构象特异性抗体W6/32识别，说明重组HLA-I类分子折叠构象正确，可鉴定pHLA复合物存在；同时超滤-HPLC法检测到pHLA复合物中也含有抗原肽，因此将超滤-HPLC法用于检测抗原肽与HLA-I类分子结合形成pHLA复合物的方法可行。
优选地，步骤(1)、(3)中超滤截留分子量为3kD-10kD。
进一步优选地，超滤前，使用质量分数1％BSA溶液对截留分子量为3kD-10kD超滤管进行过夜钝化。
优选地，步骤(2)中，酸性溶液为体积分数2-10％的三氟乙酸水溶液，静置时间为10-30min。
优选地，步骤(4)中，HPLC采用C18色谱柱，流动相为含0.005-0.1％(v/v)三氟乙酸的乙腈：含0.005-0.1％(v/v)三氟乙酸的水＝15:85-40:60，流速为0.5-1.2mL/min，柱温为35±3℃，检测波长为214nm。
优选地，步骤(4)HPLC测定抗原肽溶液中的抗原肽含量之前，对抗原肽标准品进行检测，确定特征峰，并且绘制标准曲线(峰面积为纵坐标、抗原肽浓度为横坐标)。
优选地，还包括精密性验证：对同一样品进行多次检测，记录峰的保留时间和峰面积，并计算相对标准偏差RSD。
优选地，还包括超滤回收率的验证：分别配置两份浓度为1-10μg/mL抗原肽标准溶液，其中一份溶液直接HPLC进样检测，另外一份超滤离心后进行HPLC进样检测，进行抗原肽回收率考察。
优选地，步骤(4)中测定的抗原肽即为pHLA复合物中HLA-I类分子等摩尔结合的抗原肽，根据抗原肽的量即可计算pHLA复合物的量。
综上所述，本发明方法可实现pHLA复合物中结合的抗原肽的定量检测，适用于制备条件探索过程中针对少量pHLA复合物制备产物的检测鉴定，进而方便根据复合物中结合的抗原肽量来优化不同结合条件，以提高HLA-I类分子折叠效率并促进HLA-I类分子结合抗原肽，还可根据pHLA复合物结合的抗原肽含量计算复性体系中形成pHLA复合物的制备率。本发明所建立超滤-HPLC法可用于pHLA复合物制备过程的质量控制，在T细胞特异性免疫研究、人工APC以及特异性四聚体探针应用开发方面都具有优势。
附图说明
图1所示为肽标准品的色谱图；
其中，(A)为VYF抗原肽标准品，(B)为IRA对照肽标准品。
图2所示为肽标准品的标准曲线；
其中，(A)为VYF抗原肽标准品，(B)为IRA对照肽标准品。
图3所示为共复性验证结果；
其中，(A)为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，(B)为Western blot。
图4所示为共复性产物超滤-HPLC检测结果。
图5所示为不同pH、不同肽浓度对pHLA复合物结合量的影响；
其中，(A)为pH的影响，(B)为肽浓度的影响。
图6所示为不同pHLA复合物肽结合量比较。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
肽标准品制备：
选择HLA-A*2402限制性的人黑色素瘤相关抗原肽gp100-intron 4(氨基酸序列为NH2-VYFFLPDHL-COOH，简称VYF抗原肽，含对应锚定氨基酸残基，作为结合肽)和NH2-IRAWVAWRNR-COOH(简称IRA对照肽，不含对应锚定氨基酸残基，作为不结合肽)，溶于复性缓冲液(组分为400mmol/L左旋精氨酸，100mmol/LTris HCl，2mmol/LEDTA，0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽，5mmol/L还原型谷胱甘肽，pH为8.0)中，配置成肽标准品溶液。
色谱条件：使用LC-10AT高效液相色泵(日本岛津)，SPD-20A高效液相检测器(日本岛津)RP-HPLC，采用C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)。流动相为含0.1％(v/v)三氟乙酸的乙腈：含0.1％(v/v)三氟乙酸的水＝31：69(v/v)，流速为1mL/min，柱温为35℃，检测波长为214nm，上样体积为20μL。
在上述色谱条件下，VYF抗原肽标准品溶液和IRA对照肽标准品溶液的色谱图如图1。VYF抗原肽标准品溶液在14～15min有吸收峰，如图1(A)所示，因此选择14～15min的吸收峰为VYF抗原肽的特征峰；IRA对照肽在8～9min有吸收峰，因此选择8～9min的吸收峰为IRA对照肽的特征峰，如图1(B)所示。
精密配置浓度分别为1、2、3、4、5、6、7、8和9μg/ml的VYF抗原肽标准品溶液和IRA对照肽标准品溶液，依次测定。以峰面积为纵坐标，肽浓度(μg/ml)为横坐标，绘制标准曲线。如图2所示，在0-9μg/ml范围内，VYF抗原肽和IRA对照肽标准曲线线性良好。回归方程分别为：y＝13.031x，R2＝0.9963；y＝9.4913x，R2＝0.9921。
配置2μg/ml肽标准品溶液，按上述色谱条件进行多次检测，记录峰的保留时间和峰面积，计算相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)，验证该方法的精密性。结果见表1，VYF抗原肽和IRA对照肽的保留时间和峰面积RSD均小于2％，证明该方法的精密性良好。
表1
将VYF抗原肽和IRA对照肽分别配置成1、5、9μg/ml浓度的标准溶液，一组实验取20μL标准溶液进样检测，另外一组实验将标准溶液使用截留分子量3kD超滤管(预先使用质量分数1％BSA溶液进行过夜钝化)超滤后取20μL进样检测，根据检测结果计算超滤后肽的回收率。检测结果见表2，VYF抗原肽超滤回收率在96.91％-98.14％范围内，IRA对照肽超滤回收率在95.10％-98.48％范围内。实验结果表明，超滤法具有较好的回收率，可以用来测定VYF抗原肽和IRA对照肽与HLA分子的相互作用。
表2
实施例2
pHLA复合物的制备：选择HLA-A*2402重链蛋白(HC)、β2m；VYF抗原肽、IRA对照肽作为制备原料。
将HC+β2m+VYF抗原肽按照摩尔比约为1:2:11，进行稀释复性制备pHLA复合物：将每毫升预冷的复性缓冲液中加入10μg VYF抗原肽(8.69nmol)，10℃高速震荡混匀30min，然后缓慢滴加25μg的β2m(1.45nmol)，10℃高速震荡混匀1h，最后分3次加入总量为30μg的HC(0.77nmol)，每次间隔12h，10℃震荡复性至复性结束。
同时设置HC+VYF抗原肽、β2m+VYF抗原肽为对照组。
另外使用IRA对照肽作为不结合对照肽，进行同样的复性过程。
使用1％BSA溶液对截留分子量为3kDa超滤管进行过夜钝化。取2ml各组复性产物分别进行第一次超滤，然后用复性缓冲液补足至500μL，轻轻吹打混匀后再次超滤，重复三次以除去游离肽。取HC、β2m分别与VYF抗原肽及IRA对照肽复性折叠产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，并利用W6/32抗体进行Western blot验证。结果如图3所示，仅HC+β2m+VYF抗原共复性可以产生正确的HLA-A*2402/VYF复合物构象，说明HC、β2m通过复性折叠可结合VYF抗原肽才能形成正确构象的pHLA复合物。
将超滤后得到的pHLA复合物制备产物中加入3％三氟乙酸溶液补足至100μL，静置20min，再次超滤收集滤出液。按上述液相条件进样检测。如图4所示，HC+β2m+VYF抗原共复性制备的pHLA复合物中结合的VYF抗原肽浓度显著高于其余几组(P＜0.01)。
实施例3
pHLA复合物的制备：选择重组HLA-A*2402重链蛋白(HC)、重组β2m；重组β2m/HLA-A*2402融合蛋白(β2m/HC)，VYF抗原肽。
通过改变实施例2中的复性条件，包括复性缓冲液pH值和复性体系中抗原肽的浓度(复性缓冲液pH分别调节为8.0、7.5及7.0，抗原肽在复性缓冲液中的浓度分别调整为5、10、20和40μg/mL)，进一步优化条件制备pHLA复合物。
分别对HC+β2m+VYF抗原肽和β2m/HC+VYF抗原肽稀释复性制备pHLA复合物(其中β2m/HC+VYF抗原肽稀释复性在实施例2的基础上，将VYF抗原肽在复性缓冲液中震荡混匀后，分3次加入30μg(0.575nmol)β2m/HC，每次间隔12h，10℃震荡复性至复性结束)，并通过本发明方法检测pHLA复合物中抗原肽的结合量。根据超滤-HPLC法的检测结果比较不同pH，不同肽浓度对pHLA复合物肽结合量的影响。结果如图5所示，HC+β2m+VYF抗原肽复性条件优化结果为复性缓冲液pH为8.0，抗原肽浓度为20μg/mL，在此条件下制备获得pHLA复合物中肽含量最高。β2m/HC+VYF抗原肽复性条件优化结果为复性缓冲液pH为7.0，抗原肽浓度为20μg/mL，在此条件下制备获得pHLA复合物中肽含量最高。
利用VYF抗原肽标准曲线计算抗原肽的浓度，根据制备率＝HLA分子结合的抗原肽摩尔数/复性体系中总HLA重链蛋白摩尔数×100％，可计算pHLA复合物的制备率。按上述优化后的复性条件，以HC+β2m+VYF抗原肽制备pHLA复合物的最大抗原肽结合量为0.259μg，对应摩尔数为0.225nmol，即获得pHLA复合物为0.225nmol，其制备率约为14.6％。以β2m/HC+VYF抗原肽制备pHLA复合物的最大抗原肽结合量为0.490μg，对应摩尔数为0.426nmol，即折叠复性获得0.426nmol抗原肽-HLA复合体，其制备率约为36.9％。结果显示，以β2m/HC+VYF抗原肽制备pHLA复合物，其制备率显著高于HC+β2m+VYF抗原肽制备pHLA复合物的制备率(P＜0.01)，如图6所示。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
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