一种基于固相萃取检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法
技术领域
本发明属于生物药分析检测
技术领域
，具体涉及一种吐温80的检测方法，尤其涉及一种基于固相萃取检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法。背景技术
吐温80(Tween-80)又名聚山梨酯80，其化学名为聚氧乙烯20山梨醇酐单油酸酯。吐温80作为助溶剂、乳化剂和稳定剂，常用于治疗性单克隆抗体注射液制剂中。由于近年来关于吐温80能够诱发过敏反应的报道越来越多，因此建立一种准确有效的吐温80含量的测定方法尤为重要。
目前，用于检测吐温80含量的方法主要有比色法、HPLC-蒸发光散射(ELSD)检测法、水解法、质谱法和HPLC-荧光(FLD)法等。
比色法因对设备要求比较低而应用广泛，例如，CN107300555A公开了一种快速高效测定吐温80含量的比色方法。该方法系在水性介质中，使吐温80的聚乙氧基与硫氰酸钴铵盐在沸水浴加热条件下快速显色反应，定量生成不溶于水的蓝色显色产物，待冷却至室温后，定量加入有机溶剂萃取显色产物，比色法测定吐温80含量。该方法适用于各种药物制剂中药用辅料吐温80的快速定量测定，但该方法耗时、重复性较差，且对蛋白浓度较高样品适用性差。
HPLC-ELSD法结果较准确，应用范围较广，但是ELSD系统易受蛋白污染而影响检测结果；水解法是将Tween 80水解成油酸，利用高效液相色谱-紫外检测器检测，该方法耗时较长，易受油酸稳定性的影响；质谱法需要使用昂贵的仪器，因此使用范围受限；HPLC-FLD法由于将样品直接进样分析，蛋白质在吐温80出峰位置有干扰，因此检测准确度差。
此外，CN103940773A公开了一种快速测定血必净注射液中吐温-80含量的方法。该方法包括如下步骤：(1)向血必净注射液中添加不同质量的吐温-80，配制至少15种含有不同浓度吐温-80的血必净注射液标准品；(2)采集所述血必净注射液标准品的近红外光谱图；(3)采用化学计量学方法，建立所述血必净注射液标准品中吐温-80的含量与所述近红外光谱图之间的校正模型；(4)采集待测血必净注射液的近红外光谱图，并输入至所述校正模型中，即得到待测血必净注射液中吐温-80的含量。该方法作为一种快速测定方法，亦可用于生产过程中血必净注射液关键生产工艺点的中间体的快速在线测定，为生产过程的质量控制提供一种实时在线快速的检测方法。该方法与质谱法同样需要昂贵的仪器，且同样无法排除蛋白质的干扰。
因此，提供一种准确有效的、能够检测单克隆抗体注射液中吐温80的含量且不受蛋白质干扰的检测方法，对于本领域而言具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于固相萃取检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法。所述方法具有操作便捷，检测周期短，数据重现性好，结果准确度高等优点。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种基于固相萃取检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法，所述方法包括单克隆抗体注射液的预处理和流动注射高效液相色谱检测的步骤；
所述预处理的具体步骤如下：
将所述单克隆抗体注射液上样至平衡后的固相萃取柱，收集初始流出液，再使用淋洗液进行淋洗，收集后续流出液，而后将所得初始流出液与后续流出液混合，浓缩干燥后复溶，得到待测样品；
其中，所述固相萃取柱的填料为以Protein A为配基的亲和层析介质；所述淋洗液为40～100％的甲醇水溶液；
所述高效液相色谱检测使用的流动相包括：
氯化钠0.1～0.15M、十水四硼酸钠0.025～0.03M、乙腈3～5wt％、N-苯基-1-萘胺4～6M和吐温80 2～3mg/L。
本发明所述的单克隆抗体多为IgG类抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4四种亚型，其Fc片段与Protein A具有良好的结合作用。本发明所使用的固相萃取柱中填有Protein A为配基的介质，单克隆抗体注射液经固相萃取预处理后，单克隆抗体结合在了固相萃取柱上，吐温80随淋洗液冲洗而流出，并收集，经干燥复溶后进行液相色谱检测，使得检测结果不受单克隆抗体的干扰。
本发明中，所述单克隆抗体注射液中蛋白的浓度为60～200mg/mL，例如可以是60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、120mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、180mg/mL或200mg/mL等；吐温80的含量为0.005～0.015wt％，例如可以是0.005wt％、0.006wt％、0.008wt％、0.01wt％、0.012wt％或0.015wt％等。
本发明所述方法尤其适用于蛋白含量较高、吐温浓度较低的单克隆抗体注射液，对于此类单克隆抗体，所述方法相比于常规的添加饱和氯化钠的乙醇溶液使蛋白质沉淀后检测吐温80的方法，其效果明显较好；且对于蛋白含量和吐温含量都较低的单克隆抗体注射液，本发明所述方法也同样适用，但是相比于蛋白含量较高、吐温浓度较低的注射液，其改善效果的提升度并不明显。
本发明中，对于淋洗液的要求较高，在样品的预处理过程中，超纯水、甲醇水溶液或乙醇水溶液均为可使用的淋洗液，但是以乙腈为淋洗液时，在吐温80出峰位置处有很大的干扰；同时相比于超纯水、乙醇水溶液等淋洗液，所述淋洗液为甲醇水溶液，尤其是使用体积分数为40～100％(例如可以是40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的甲醇水溶液处理样品时，所得高效液相色谱图中吐温80的峰较为明显，无杂质干扰，便于定量。
本发明中，流动相中含有适量的吐温80，能保证形成胶束以便定量，不会对样品中的吐温80的定量测定造成影响。但是，吐温80的添加量会影响吐温80含量极低的样品定量。
本发明提供的固相萃取-流动注射HPLC荧光分析法检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法，一方面通过以Protein A为介质的固相萃取技术，消除了单克隆抗体对吐温80检测结果的干扰，另一方面，固相萃取与流动注射HPLC相结合，相比传统方法的操作更加便捷，数据重现性较好，检测周期也更短，5小时内就可以出检测结果，且该方法仅特异性的针对吐温80，对于单克隆抗体注射液中的其他杂质无明显的检出和定量效果。
本发明中，所述流动注射HPLC根据丹麦技术大学的J.Ruzicka和EH.Hansen提出的流动注射的概念而来，即：按照连续流动的方法，通过蠕动泵将反应试剂和待测样品按比例注入一个密闭、连续的流动载流中，在化学反应单元中发生显色反应，在检测器中测得其信号值，按照标准曲线法测定待测样品的浓度。
优选地，所述复溶使用的溶剂为超纯水。
作为本发明优选的技术方案，所述固相萃取柱的平衡方法为：将所述固相萃取柱的填料分散于平衡液中，而后离心，去除所述平衡液。
优选地，所述平衡液包括超纯水。
优选地，所述平衡液与所述固相萃取柱的填料的体积比为(4～6):1，例如可以是4:1、4.2:1、4.5:1、4.8:1、5:1、5.2:1、5.4:1、5.5:1、5.8:1或6:1等。
作为本发明优选的技术方案，所述方法中还包括清洗所述固相萃取柱的步骤。
优选地，所述清洗使用的清洗液包括摩尔质量为20～50mM(例如可以是20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM等)的醋酸水溶液。
作为本发明优选的技术方案，所述浓缩采用的方法包括真空离心浓缩、氮气浓缩或真空冷冻浓缩中的任意一种，优选为真空离心浓缩；其中，氮气浓缩通过鼓入氮气的方式，将样品进行浓缩，但是需要制氮气装置，若氮气不纯，容易引入杂质；真空冷冻浓缩需要将样品冷冻至较低的温度(-100℃左右)，然后抽真空进行浓缩，该方法需要外加冻干装置，周期比较长；本发明中选用离心浓缩，通过真空并离心，适当提高温度，加快样品浓缩，该浓缩方法不会引入杂质，且操作方便，浓缩时间较短。
优选地，所述真空离心浓缩的转速为1000～1500rpm，例如可以是1000rpm、1050rpm、1100rpm、1150rpm、1200rpm、1300rpm、1400rpm或1500rpm等。
优选地，所述真空离心浓缩的温度为25～50℃，例如可以是25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃、40℃、42℃、45℃、48℃或50℃等。
优选地，所述真空离心浓缩的时间为3～4h，例如可以是3h、3.1h、3.2h、3.3h、3.5h、3.6h、3.8h、3.9h或4h等。
作为本发明优选的技术方案，所述高效液相色谱检测使用的流动相包括氯化钠、十水四硼酸钠、乙腈、N-苯基-1-萘胺和吐温80。
优选地，所述流动相中氯化钠的摩尔浓度为0.1～0.15M，例如可以是0.1M、0.11M、0.12M、0.13M、0.14M或0.15M等。
优选地，所述流动相中十水四硼酸钠的摩尔浓度为0.025～0.03M，例如可以是0.025M、0.026M、0.027M、0.028M、0.029M或0.03M等。
优选地，所述流动相中乙腈的质量百分比为3～5％，例如可以是3％、3.2％、3.4％、3.5％、3.6％、3.8％、4％、4.2％、4.4％、4.5％、4.6％、4.8％或5％等。
优选地，所述流动相中N-苯基-1-萘胺的摩尔浓度为4～6M，例如可以是4M、4.2M、4.4M、4.5M、4.6M、4.8M、5M、5.2M、5.4M、5.6M或6M等。
优选地，所述流动相中吐温80的质量浓度为2～3mg/L，例如可以是2mg/mL、2.2mg/mL、2.5mg/mL、2.6mg/mL、2.8mg/mL或3mg/mL等。
优选地，所述流动相的流速为1～2mL/min，例如可以是1mL/min、1.2mL/min、1.4mL/min、1.5mL/min、1.6mL/min、1.8mL/min或2mL/min等。
作为本发明优选的技术方案，所述高效液相色谱检测的柱温为25～26℃，例如可以是25℃、25.2℃、25.4℃、25.5℃、25.6℃、25.8℃或26℃等。
优选地，所述高效液相色谱检测的进样量为8～10μL，例如可以是8μL、8.2μL、8.4μL、8.5μL、8.8μL、9μL、9.2μL、9.5μL、9.6μL、9.8μL或10μL等。
优选地，所述高效液相色谱检测的检测器为荧光检测器。
优选地，所述荧光检测器的荧光最大激发波长为350nm。
优选地，所述荧光检测器的荧光最大发射波长为420nm。
作为本发明优选的技术方案，所述方法还包括配制标准工作液并绘制标准曲线的步骤。
优选地，所述标准工作液中吐温80的终浓度为0.00125wt％～1wt％(即0.0125～10mg/mL)，例如可以是0.00125wt％、0.0025wt％、0.005wt％、0.01wt％、0.02wt％、0.05wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.5wt％、0.8wt％或1wt％等。
准确称取1.0g吐温80标准品，用超纯水定容至100mL，配制成吐温80储液(1wt％，即10mg/mL)，而后准确移取一定体积的吐温80储液，稀释得到一定浓度的标准工作液，分别为0.0025wt％、0.005wt％、0.01wt％、0.02wt％、0.04wt％和0.08wt％浓度。
优选地，所述标准曲线以吐温80的浓度为输入变量，以高效液相色谱检测图谱的峰面积为输出变量。
作为本发明优选的技术方案，所述方法还包括：通过所述标准曲线和所述高效液相色谱检测得到的峰面积计算待测溶液中的吐温80的含量。
作为本发明优选的技术方案，所述方法包括如下步骤：
(1)单克隆抗体注射液的预处理：
将所述单克隆抗体注射液上样至平衡后的固相萃取柱，收集初始流出液，再使用体积分数为40～100％甲醇水溶液进行淋洗，收集后续流出液，而后将所得初始流出液与后续流出液混合，浓缩干燥后复溶，得到待测样品；
其中，所述固相萃取柱的填料为以Protein A为配基的亲和层析介质，所述填料使用后采用摩尔质量为20～50mM的醋酸水溶液进行清洗，保存；
(2)高效液相色谱检测：
配制流动相，所述流动相包括：摩尔浓度为0.1～0.15M的氯化钠、摩尔浓度为0.025～0.03M的十水四硼酸钠、质量百分比为3～5％的乙腈、摩尔浓度为4～6M的N-苯基-1-萘胺和质量浓度为2～3mg/L的吐温80，所述流动相的流速为1～2mL/min；
所述高效液相色谱检测的进样量为8～10μL，柱温为25～26℃，检测器为荧光检测器，荧光最大激发波长为350nm，荧光最大发射波长为420nm；
(3)标准工作液的配制：
所述标准工作液中吐温80的终浓度为0.00125wt％～1wt％，以吐温80的浓度为输入变量，以高效液相色谱检测图谱的峰面积为输出变量绘制标准曲线；
(4)计算所述待测样品中吐温80的浓度：
根据所述标准曲线和高效液相色谱检测得到的峰面积计算待测溶液中的吐温80的含量。
示例性地，本发明中可采用如下方法进行吐温80的含量测试：
(1)单克隆抗体注射液的预处理：
取装有填料的固相萃取柱，先用2.0～5.0mL平衡液对固相萃取柱进行平衡。取0.1～0.5mL单克隆抗体注射液上样至固相萃取柱，并同时开始收集流出液，之后用1.2～3.0mL淋洗液进行淋洗，一并收集全部流出液，并离心浓缩干燥，用纯水复溶后待测。固相萃取柱经2.0～5.0mL冲洗液冲洗后，可重复使用。
(2)确定液相色谱仪的工作参数
反应线圈：规格750μL；或同等性能的反应线圈；
流动相：0.15M氯化钠，0.025M十水四硼酸钠，5.0％乙腈，5.0M N-苯基-1-萘胺，2.5mg/L吐温80；
流速：1.5mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；检测波长：荧光检测器，λex＝350nm，λem＝420nm；
(3)绘制标准工作曲线
配制标准工作液，并注入液相色谱仪中，按照步骤(2)中的工作参数测得对应的峰面积，以吐温80的浓度为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，得到线性方程；
(4)单克隆抗体注射液中吐温80含量的检测：
按步骤(1)将复溶后的样品注入液相色谱仪中，并按照步骤(2)的工作参数进行测定，以保留时间定位色谱峰，测得其峰面积，根据标准工作曲线的线性方程计算得出单克隆抗体注射液中吐温80的含量。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明用于检测单克隆抗体注射液中吐温80的含量，所述单克隆抗体含有Fc片段，利用Fc片段与Protein A的结合作用，单克隆抗体注射液经固相萃取预处理后，单克隆抗体结合在了固相萃取柱上，吐温80随淋洗液冲洗而流出，经干燥复溶后进行液相色谱检测，消除了单克隆抗体对吐温80检测结果的干扰；且以甲醇水溶液作为淋洗液时，所得结果最为准确；
(2)本发明所述的方法将固相萃取与流动注射HPLC相结合，相比传统方法的操作更加便捷，数据重现性较好，检测周期也更短，5小时内就可以出检测结果。
附图说明
图1为实施例1中提供的方法测得的吐温80色谱图。
图2为依据实施例1中提供的方法得到的标准工作曲线图。
图3为实施例2中提供的方法测得的吐温80色谱图。
图4为依据实施例2中提供的方法得到的标准工作曲线图。
图5为实施例3中提供的方法测得的吐温80色谱图。
图6为依据实施例3中提供的方法得到的标准工作曲线图。
图7为实施例4中提供的方法测得的吐温80色谱图。
图8为实施例5中提供的方法测得的吐温80色谱图。
图9为实施例6中提供的方法测得的吐温80色谱图。
图10为依据实施例6中提供的方法得到的标准工作曲线图。
图11为实施例7中提供的方法测得的吐温80色谱图。
图12为实施例8中提供的方法测得的吐温80色谱图。
图13为依据对比例1中提供的方法得到的标准工作曲线图。
图14为依据对比例2中提供的方法得到的标准工作曲线图。
图15为依据对比例3中提供的方法得到的标准工作曲线图。
图16为依据对比例4中提供的方法得到的标准工作曲线图。
图17为依据对比例5中提供的方法得到的标准工作曲线图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，若无特殊说明，所用的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
实施例1
本实施例提供一种检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法，检测重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体注射液中吐温80的含量，具体步骤如下：
(1)预处理：取装有0.5mL Protein A填料的固相萃取柱，先用2.5mL超纯水进行平衡；取0.1mL重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体注射液(蛋白浓度5mg/mL)上样至固相萃取柱，开始收集流出液，然后用1.5mL 100％甲醇(体积分数)的水溶液淋洗，收集全部流出液；
固相萃取柱用2.5mL含50mM醋酸的水溶液进行清洗，丢弃清洗液；
将收集到的全部流出液放置于离心浓缩仪中，1300转，25℃干燥3小时后，用超纯水复溶后作为待测样品。
(2)高效液相色谱检测：反应线圈选用750μL规格的反应线圈；
用摩尔浓度为0.15M氯化钠、摩尔浓度为0.025M十水四硼酸钠、质量百分比为5.0％乙腈、摩尔浓度为5.0M N-苯基-1-萘胺、质量浓度为2.5mg/L吐温80溶液作为流动相；
流速1.5mL/min；柱温25℃；进样量10μL；荧光检测器波长λex＝350nm、λem＝420nm；
将标准工作液注入高效液相色谱仪进行分析，其中，标准工作液的配制方法如下：
准确称取1.0g吐温80标准品，加入超纯水定容至100mL，配制吐温80储液(1wt％，即10mg/mL)，而后准确移取一定体积的吐温80储液，加入一定体积的超纯水，稀释得到0.0025wt％、0.005wt％、0.01wt％、0.02wt％、0.04wt％和0.08wt％浓度的标准工作液，具体稀释步骤如下表1所示：
表1
以标准工作溶液浓度(wt％)为横坐标(X)，吐温80色谱峰峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准工作曲线，得到的标准工作曲线的线性方程为Y＝1.07×109X-2.72×106，相关系数R2＝0.999638；检测范围为0.0025wt％～0.08wt％(即0.025-0.8mg/mL)。
图1为测得的吐温80色谱图，保留时间0.512min为吐温80色谱峰；
图2为标准工作曲线图；根据标准工作曲线计算待测样品中吐温80含量检测结果为0.0094％(即0.094mg/mL)，符合0.005％～0.015％(即0.05～0.15mg/mL)的范围要求(其中，重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体注射液中吐温80的标定量为0.01％)。
实施例2
本实施例提供一种检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法，检测特异性靶向人IL-4Ra人源化单克隆抗体注射液中吐温80的含量，具体步骤如下：
(1)取装有1mL Protein A填料的固相萃取柱，先用5.0mL超纯水进行平衡；取0.1mL特异性靶向人IL-4Ra人源化单克隆抗体注射液(蛋白浓度150mg/mL)上样至固相萃取柱，开始收集流出液，然后用3.0mL 100％甲醇(体积分数)的水溶液淋洗，收集全部流出液；
固相萃取柱用5.0mL含50mM醋酸的水溶液进行清洗，丢弃清洗液；
将收集到的全部流出液放置于离心浓缩仪中，1300rpm，40℃干燥4小时后，用超纯水复溶后作为待测样品。
(2)高效液相色谱检测：反应线圈选用750μL规格的反应线圈；
用摩尔浓度为0.15M氯化钠、摩尔浓度为0.025M十水四硼酸钠、质量百分比为5.0％乙腈、摩尔浓度为5.0M N-苯基-1-萘胺、质量浓度为2.5mg/L吐温80溶液作为流动相；
流速1.5mL/min；柱温25℃；进样量10μL；荧光检测器波长λex＝350nm、λem＝420nm。
将标准工作液注入高效液相色谱仪进行分析，然后注入待测样品，检测其中的吐温80含量。
以标准工作溶液浓度(％)为横坐标(X)，吐温80色谱峰峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准工作曲线，得到的标准工作曲线的线性方程为Y＝1.23×109X-2.78×106，相关系数R2＝0.999711。
图3为测得的吐温80色谱图，保留时间0.512min为吐温80色谱峰；
图4为标准工作曲线图；根据标准工作曲线，计算待测样品中吐温80含量检测结果为0.0086％(即0.086mg/mL)，符合0.005％～0.015％(即0.05～0.15mg/mL)的范围要求。
实施例3
本实施例提供一种检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法，检测全人源抗PD-L1抗体注射液中吐温80的含量，具体步骤如下：
(1)取转有0.5mL Protein A填料的固相萃取柱，先用2.5mL超纯水进行平衡。取0.1mL全人源抗PD-L1抗体注射液(蛋白浓度20mg/mL)上样至固相萃取柱，开始收集流出液，然后用1.5mL 50％甲醇(体积分数)的水溶液淋洗，收集全部流出液。固相萃取柱用2.5mL含50mM醋酸的水溶液进行清洗，丢弃清洗液。将收集到的全部流出液放置于离心浓缩仪中，1300转，50℃干燥4小时后，用超纯水复溶后作为待测样品。
(2)高效液相色谱检测：反应线圈选用同750μL规格性能的反应线圈；
用摩尔浓度为0.15M氯化钠、摩尔浓度为0.025M十水四硼酸钠、质量百分比为5.0％乙腈、摩尔浓度为5.0M N-苯基-1-萘胺、质量浓度为2.5mg/L吐温80溶液作为流动相；
流速1.5mL/min；柱温25℃；进样量10μL；荧光检测器波长λex＝350nm、λem＝420nm。
将标准工作液注入高效液相色谱仪进行分析，然后注入待测样品，检测其中的吐温80含量。
以标准工作溶液浓度(％)为横坐标(X)，吐温80色谱峰峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准工作曲线，得到的标准工作曲线的线性方程为Y＝1.46×109X-2.21×106，相关系数R2＝0.999951。
图5为测得的吐温80色谱图，保留时间0.512min为吐温80色谱峰；
图6为标准工作曲线图；根据标准工作曲线，计算待测样品中吐温80含量检测结果为0.0101％(即0.101mg/mL)，符合0.005％～0.015％(即0.05～0.15mg/mL)的范围要求
实施例4
与实施例1的区别在于，本实施例中，使用质量分数为100％的乙醇作为淋洗液进行淋洗；
其余步骤与实施例1保持一致。
图7为测得的吐温80色谱图，保留时间0.514min为吐温80色谱峰；
根据标准工作曲线(同实施例1)计算待测样品中吐温80含量检测结果为0.0062％(即0.062mg/mL)，其理论值为0.01％。
实施例5
与实施例1的区别在于，本实施例中，使用质量分数为40％的甲醇作为淋洗液进行淋洗；
其余步骤与实施例1保持一致。
图8为测得的吐温80色谱图，保留时间0.512min为吐温80色谱峰；
根据标准工作曲线(同实施例1)计算待测样品中吐温80含量检测结果为0.0105％(即0.105mg/mL)，其理论值为0.01％。
实施例6
与实施例1的区别在于，本实施例中，使用质量分数为40％的乙腈作为淋洗液进行淋洗；
其余步骤与实施例1保持一致。
图9为测得的吐温80色谱图，保留时间0.461min为吐温80色谱峰；
图10为标准工作曲线图；标准工作曲线的线性方程为Y＝1.54×109X-3.75×106，相关系数R2＝0.999336。根据标准工作曲线计算待测样品中吐温80含量检测结果为0.0621％(即0.621mg/mL)，理论值0.01％。
实施例7
与实施例1的区别在于，本实施例中流动相的流速为0.5mL/min；其余步骤与实施例1保持一致。
图11为测得的吐温80色谱图，保留时间1.557min为吐温80色谱峰，样品中吐温80含量检测结果为0.0107％，流速降低不影响吐温80的定量，而使色谱峰的保留时间增加、色谱峰变宽。
实施例8
与实施例1的区别在于，本实施例中流动相的流速为2.5mL/min；其余步骤与实施例1保持一致。
图12为测得的吐温80色谱图，保留时间0.316min为吐温80色谱峰，样品中吐温80含量检测结果为0.0106％，流速增加不影响吐温80的定量，而使色谱峰的保留时间缩短、色谱峰变窄。
对比例1
与实施例2相比，本对比例中所述的单克隆抗体注射液(蛋白浓度150mg/mL)不进行预处理，将其直接上样，且高效液相色谱检测参数与实施例2保持一致；
同时，配制标准工作液绘制该方法下得到的标准曲线(图13)为Y＝1.31×109X-2.73×106，相关系数R2＝0.999752；
根据所得标准曲线得到单克隆抗体注射液中吐温80的含量0.0168％(即0.168mg/mL)，理论值0.01％。
对比例2
与实施例1相比，本对比例中所述的单克隆抗体注射液(蛋白浓度5mg/mL)不进行预处理，将其直接上样，且高效液相色谱检测参数与实施例2保持一致；
同时，配制标准工作液绘制该方法下得到的标准曲线(图14)为Y＝1.49×109X-3.87×106，相关系数R2＝0.998711；
根据所得标准曲线得到单克隆抗体注射液中吐温80的含量0.0104％(即0.104mg/mL)，理论值0.01％。
对比例3
与实施例3相比，本对比例中所述的单克隆抗体注射液(蛋白浓度20mg/mL)不进行预处理，将其直接上样，且高效液相色谱检测参数与实施例2保持一致；
同时，配制标准工作液绘制该方法下得到的标准曲线(图15)为Y＝1.29×109X-2.36×106，相关系数R2＝0.999798；
根据所得标准曲线得到单克隆抗体注射液中吐温80的含量0.0114％(即0.114mg/mL)，理论值0.01％。
对比例4
与实施例1相比，本对比例中固相萃取柱采用的填料为亲水键合填料(安捷伦的GLYCOCLEANTM S CARTRIDGES)；
其余步骤与实施例1保持一致。
同时，配制标准工作液绘制该方法下得到的标准曲线(图16)为Y＝1.48×109X-3.15×106，相关系数R2＝0.999433，根据所得标准曲线得到单克隆抗体注射液中吐温80的含量0.0035％(即0.035mg/mL)，理论值0.01％。
对比例5
采用本领域常规方法检测实施例2中的注射液，用饱和氯化钠的乙醇溶液沉淀蛋白，取上清干燥，其余步骤与实施例2保持一致。
同时，配制标准工作液绘制该方法下得到的标准曲线(图17)为Y＝1.77×109X-3.54×106，相关系数R2＝0.999717，根据所得标准曲线得到单克隆抗体注射液中吐温80的含量0.0061％(即0.061mg/mL)，理论值0.01％。
其中，检测重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体注射液的实施例1、实施例4～8及对比例4中所得峰面积及浓度如表2所示：
表2
由上表结果可知，比较实施例1和实施例6，本发明中淋洗液采用乙腈时，所得待测样品中吐温80含量检测结果为0.0621％，远超待测样品的标定值，该结果的可信度较差；
由实施例1、实施例4、实施例5比较可知，本发明中淋洗液分别采用100％甲醇、100％乙醇、40％甲醇时，当使用100％甲醇或40％甲醇时，所得检测结果较为接近待测样品的标定值，而以100％乙醇为淋洗液时，所得检测结果与标定值存在一定差距；
由实施例1、实施例7、实施例8比较可知，本发明中，流动相的流速会影响色谱峰的保留时间和宽度，当其流速为1～2mL/min时，所得峰的峰型较为标准；
由实施例1与对比例4比较可知，本发明中采用以Protein A为配基的亲和层析介质作为萃取柱的填料，所得检测结果较为准确。
此外，通过比较实施例2与对比例1可知，若单克隆抗体注射液不进行预处理，将其直接上样，在蛋白含量较高的情况下，所得单克隆抗体注射液中吐温80的含量明显偏高。
比较实施例2和对比例5可知，本发明提供的方法(检测值为0.0086％)相较于本领域常规的沉淀法(检测值为0.0061％)，在蛋白含量较高的情况下，其偏差较小，准确度更高。
且结合实施例1～3与对比例1～3比较(表3)可知，相比于5mg/mL和20mg/mL的注射液，本发明所述的方法在处理150mg/mL的单克隆抗体注射液时，具有更加明显的优势：对于高蛋白浓度低吐温80含量的样品，其检测偏差明显降低。
表3
注：偏差＝|理论值-实测值|/理论值×100％；各实验组样品吐温80含量的理论值均为0.01％(即为0.1mg/mL，本技术领域较低含量水平)。
综上所述，本发明提供的检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的方法，结果准确度高，检测周期短，操作便捷，对于单克隆抗体注射液中杂质的检测具有较高的应用价值。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
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