本发明公开了一种使用IMAC层析纯化非标签化CRM197蛋白的方法,包括如下步骤:(1)将大肠杆菌表达系统得到非标签化的CRM197蛋白包涵体用变性剂处理,(2)过滤后上样IMAC层析柱,使用洗脱液洗脱,收集洗脱峰,(3)用复性液复性及超滤浓缩,(4)然后进行分子筛层析或疏水层析,获得CRM197蛋白。本发明不需要添加His标签,只需要对蛋白进行变性处理,从而打开蛋白结构使蛋白结构内部的His暴露出来,从而增加与金属离子的结合能力,然后根据适当的洗脱步骤将目的蛋白与杂质分离,该技术方案特别适用于包涵体的纯化,一步层析就能得到纯度大于90%的样品。