具体实施方式

本发明提供一种靶向Beclin1的订书肽，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。应该理解，当我们称元件被“连接”或“耦接”到另一元件时，它可以直接连接或耦接到其他元件，或者也可以存在中间元件。此外，这里使用的“连接”或“耦接”可以包括无线连接或无线耦接。这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的全部或任一单元和全部组合。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。

Beclin 1((Bcl-2interacting coiled coil protein 1)是一种进化保守的哺乳动物蛋白，在真核生物中发现了同源蛋白，包括酵母和植物，线虫，果蝇和斑马鱼。Beclin1最初是在酵母双杂交筛选中作为Bcl-2相互作用蛋白被发现的，后来被证实是哺乳动物磷脂酰肌醇3-激酶复合体(PI3K)中不可或缺的成员。PI3K是一个多蛋白组合，其核心单元由三个分子组成，包括Beclin 1、特异性地将磷脂酰肌醇(PI)磷酸化生成的3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3P)的脂质激酶Vps34(Vacuolar Protein Sorting 34)；以及一种丝氨酸/苏氨酸激酶Vps15(Vacuolar Protein Sorting 15)，它是Vps34稳定的结合伙伴。PI3K是哺乳动物细胞中PI3Ps的主要生产者，在多个涉及富含PI3P的囊泡，如自噬、内体-溶酶体运输和吞噬等细胞过程中是必不可少的。作为PI3K复合体的关键调节因子，Beclin 1在糖代谢、胚胎发育和先天免疫等多种生理过程中发挥着重要作用。Beclin 1的缺乏或功能障碍与多种人类疾病有关，如癌症和神经退行性疾病。

大量研究证实Beclin 1是一种单倍体不足的肿瘤抑制因子，与肿瘤发生密切相关。在40-75％的散发性乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌病例中，Beclin1被单等位基因敲除。小鼠中Beclin1杂合子敲除导致自发恶性肿瘤，如淋巴瘤和肺或肝细胞癌等的发生率更高。此外，非小细胞肺癌(NSCLC)中的表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)和乳腺癌中的人表皮生长因子受体2(Human Epidermal Growth Factor Receptor,HER2)等细胞表面致癌受体可与Beclin 1结合，抑制自噬，促进肿瘤发生。此外，在过表达HER2的转基因小鼠中，通过过表达不与其抑制剂Bcl-2结合的Beclin 1F121A突变体已被证明可增强自噬并抑制肿瘤发生。值得注意的是，Tat-Beclin 1是一种包含HIV Tat序列的订书肽，该订书肽包含了来自Beclin 1进化保守区(AA269-279)的11个氨基酸片段，在HER2阳性(HER2+)人乳腺癌小鼠移植瘤模型中显示出强大的抗增殖作用。疗效与临床使用的HER2抑制剂拉帕替尼相当。这些遗传学和药理学研究结果表明，靶向Beclin 1可能是EGFR或HER2驱动的癌症的一种有效的抗增殖策略。

本申请人实验室的结构研究已经描述了Beclin 1上调PI3K复合体活性的分子机制。两种正向调控因子Atg14L和UVRAG竞争性地与支架分子Beclin 1结合，形成含有Atg14L或UVRAG的PI3KC3复合物，并显著增强脂激酶活性，从而促进PI3K参与的细胞活动。Beclin1-Atg14L/UVRAG相互作用依赖于它们各自的卷曲螺旋域。申请人的研究创新性地揭示了Beclin 1卷曲螺旋结构域形成了亚稳态的同源二聚体，因为它的疏水二聚体界面被几个“不完美”的极性或带电残基显著削弱。亚稳态的Beclin 1同源二聚体在与Atg14L/UVRAG结合后很容易解离，并转化为高度稳定的异源二聚体Beclin 1-Atg14L/UVRAG复合物，其卷曲螺旋域界面由于疏水对和静电互补作用而显著增强。利用Beclin 1卷曲螺旋结构域的亚稳定特性，申请人开发了一系列全碳氢链装订的订书肽，这些订书肽特异性地结合在该区域，以减少Beclin 1的同源二聚化，并增强Beclin 1-Atg14l/UVRAG相互作用。这些设计的订书肽也显示出在诱导自噬和促进细胞表面受体如EGFR的内体-溶酶体降解方面的功效。

考虑到Beclin 1在肿瘤发生中的重要功能，申请人合理设计的靶向Beclin 1的订书肽可能通过增强自噬和促进EGFR和HER2的内体-溶酶体降解来抑制EGFR或HER2驱动的癌细胞的增殖。然而，我们前期研究开发的订书肽与Beclin 1具有中度的体外结合亲和力(Kd～6-60μM)，并在多个NSCLC细胞系中表现出少量的细胞毒性。

基于此，本发明提供了一种新型的靶向Beclin1的订书肽，其中，所述订书肽包含的氨基酸序列与Beclin1氨基酸残基191-205至少有66.7％相同，所述订书肽中的E195氨基酸残基和N202氨基酸残基被一个全碳氢链连接起来以稳定其α-螺旋结构。

本发明选择的订书肽是以Beclin1卷曲螺旋结构域上的氨基酸残基191-205(Native-P1肽)为模板，对其进行氨基酸突变和修饰之后制得的。本发明之所以选择Native-P1肽这个片段作为模板，是因为研究表明，这个片段是Beclin 1同源二聚体界面的一部分，但与UVRAG的结合位点并不重叠。因此，Beclin1卷曲螺旋结构域上的氨基酸残基191-205(Native-P1肽)有望与Beclin 1卷曲螺旋结构域结合，减少其同源二聚化，并促进Beclin 1-Atg14l/UVRAG异源二聚体的形成，随后促使自噬和内体-溶酶体降解上调。

当Native-P1肽与Beclin 1卷曲螺旋结构域结合时，形成如图1所示的α-螺旋结构。在本发明中，我们使用了一种全碳氢链将所述Native-P1序列上被6个残基隔开的两个氨基酸残基(即E195氨基酸残基和N202氨基酸残基)连接起来，使得所述全碳氢链能够穿过两圈螺旋，从而稳定订书肽的α-螺旋结构。

如图2所示，本发明尝试了6种可能的支架来插入这种全碳氢链，所有的支架都保持了4个关键的Beclin 1结合残基(即L192、L196、V199和R203)不受干扰。在本发明的MD模拟中，所有6个订书肽的螺旋结构都保持不变，特别是在L192到R203残基之间。虽然本发明的MD模拟，每个长为100ns,不够广泛达到真正的构象收敛，然而所有6种订书肽的预测结合能表明i7-01s,i7-02s,i7-04s,i7-06s倾向于与Beclin 1卷曲螺旋域形成更稳定的结合。

本发明选择i7-01s支架来插入全碳氢链，如图3所示，Native-P1序列上的E195氨基酸残基和N202氨基酸残基被突变并使用全碳氢链将其连接起来，所述E195氨基酸残基、N202氨基酸残基以及全碳氢链都位于卷曲螺旋结构域表面疏水区域附近，如图4所示，因此，E195氨基酸残基和N202氨基酸残基的突变可能会减少卷曲螺旋结构域与订书肽之间的疏水性-亲水性的不匹配。此外，根据我们预测的模型，i7-01s上的全碳氢链实际上是堆积在卷曲螺旋结构域的表面，这可能会进一步增强该订书肽与Beclin 1的结合。在i7-01s支架的基础上，本发明对Native-P1序列进行了系统的单点突变。如图5所示，所有这些突变订书肽的预测结合能表明，Q194、E197、D198、E200、K201、K204和K205位点的突变更有可能提高结合亲和力。然后本发明手动选择了一些有利的单点突变体，并将其组合成新的多点突变体设计，希望获得更高的结合亲和力。具体来说，所述订书肽包含的氨基酸序列以Beclin1氨基酸残基191-205为模板，且与所述Beclin1氨基酸残基191-205相比有1-5个氨基酸发生突变。本发明中设计的所有75个订书肽的结合能总结在表1中，所述75个订书肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1-75，它们中的大多数(75分之72)的平均结合能比基于相同i7-01s支架的Native-P1肽的结合能更优，符合我们在分子设计上的预期。

表1基于i7-01s支架设计的多肽的结合能

在综合考虑了预测的结合方式，结合亲和力以及订书肽的理化性质(如总电荷)的基础上，本发明最终在所有的设计中选择了17个订书肽来进行化学合成。用等温滴定量热法(ITC)测定了所有17个新合成的订书肽与Beclin1卷曲螺旋结构域的结合亲和度，如表2所示。

表2 17个新合成的订书肽与Beclin 1卷曲螺旋结构域的结合亲和度

Tat-SP4是我们之前研究中获得的亲和力最好的订书肽(Kd＝3.2μM)，与之相比，这些新合成的订书肽中有12个与Beclin 1具有相当或更强的结合能力。特别是这两种订书肽(i7-01s-20和i7-01s-31)的结合亲和力分别比Tat-SP4强约10-30倍，如图6所示。我们的分子建模结果表明，如图4所示，新获得的订书肽上的全碳氢链更接近于卷曲螺旋结构域表面，而不是像Tat-SP4那样延伸到溶剂中，这是它们结合亲和力增强的主要因素。总之，我们通过调整全碳氢链插入的位置和订书肽的氨基酸序列的新设计策略已经获得了一批至少在体外结合试验中具有良好活性的订书肽。

在一些实施方式中，本发明提供的靶向Beclin 1的订书肽能有效诱导自噬。本实施例将重点放在i7-01s-20和i7-01s-31这两个与Beclin 1结合亲和力最强的新订书肽上，以进行后续的功能表征。我们首先使用台盼蓝拒染法证实i7-01s-20和i7-01s-31分别在10μm和20μm浓度下处理24小时后对HEK293T细胞的细胞毒性可以忽略，如图7所示。

通过检测两种自噬分子标志物LC3和p62的蛋白水平，检测这两种订书肽对细胞自噬活性的影响。在自噬过程中，胞浆蛋白LC3由apo型(LC3-I)转化为脂化型(LC3-II)在自噬体上积累。因此，LC3-II水平的升高被认为是细胞自噬活性升高的可靠指标。同样，p62是一种自噬受体，与自噬底物一起在溶酶体中降解。虽然有研究表明p62不如LC3-II敏感，但p62水平的降低也常被用作自噬活性较高的指标。我们的结果显示，使用10μM和20μM i7-01s-31处理HEK293T细胞3小时后，LC3-II水平明显升高(如图8中a和b所示)。在使用溶酶体抑制剂氯喹(CQ)的情况下，这种增加显著增强(如图8中a和c所示)。使用订书肽处理后，p62的蛋白水平没有显示出任何明显的变化，无论是存在或不存在CQ(如图8中a、d和e所示)。这种LC3-II和p62水平的变化模式与我们之前的研究中所报道的Tat-SP4的变化模式相似。因此，新设计的订书肽i7-01s-20和i7-01s-31虽然对Beclin 1的结合亲和力比Tat-SP4强10-30倍，但实际上诱导自噬的效果相当。

在一些实施方式中，本发明提供的靶向Beclin 1的订书肽能有效促进内体-溶酶体运输。Beclin 1作为PI3KC3复合体的一个支架成员，在自噬、内体-溶酶体运输和吞噬等多种PI3KC3依赖的过程中起着至关重要的作用。为了评估我们新设计的订书肽对内体-溶酶体转运过程的有效性，我们使用过表达EGFR和HER2的SKBR3乳腺癌细胞系，通过免疫印迹法(western blotting)对配体诱导的细胞表面受体HER2和EGFR的内体-溶酶体降解进行了表征。在SKBR3细胞中，激动剂EGF的处理触发了EGFR和HER2的缓慢降解，24小时后仍有大约50％的细胞残留(如图9中a、d和e所示)。2μM的Tat-SP4处理对降解曲线无明显影响(如图9中b、d和e所示)。相比之下，2μM i7-01s-31处理导致HER2水平显著下降，在EGF刺激后15小时下降约50％，24小时下降约70％(如图9中c和d所示)。i7-01s-31处理也强烈促进了EGFR降解，在EGF刺激15小时后，约有60％的减少(如图9中c和e所示)。

为了进一步比较新设计的订书肽与Tat-SP4的效力，我们使用更高浓度的Tat-SP4重复了EGFR和HER2降解试验。我们发现Tat-SP4的浓度应该升高到20或40μm，以达到类似的对HER2和EGFR降解的效果(如图10所示)。我们的数据表明，新设计的与Beclin 1具有更高结合亲和力的订书肽在促进HER2和EGFR的内体-溶酶体转运方面也显示出显著更高的功效。

在一些实施方式中，本发明提供的靶向Beclin 1的订书肽能有效抑制HER2+癌细胞的增殖。具体来讲，为了评估我们新设计的订书肽对EGFR-或HER2驱动的癌症的抗增殖能力，我们使用台盼蓝拒染法来测量我们的订书肽对SKBR3细胞的IC₅₀值。结果表明，虽然Tat-SP4具有中等的抗增殖作用，IC₅₀为33.68μM，但i7-01s-20和i7-01s-31的IC₅₀分别为13.55μM和7.12μM，是前者抗增殖能力的2-5倍(如图11中a所示)。同样，为期5天的增殖试验证实，虽然在20μM时，Tat-sp4使SKBR3细胞的增殖减少了约30％(如图11中b所示)，但在20μM时，i7-01s-20处理组，或在10μM时，i7-01s-31处理组，均显示出更高的剂量依赖性的完全抑制细胞增殖的效能(如图11中c和d所示)。这些发现证实，与Tat-SP4相比，新设计的订书肽抑制了SKBR3的增殖，且效果显著更高。

在一些实施方式中，本发明提供的靶向Beclin1的订书肽能诱导细胞死亡。具体来讲，鉴于新设计的订书肽具有强大的抗增殖作用，我们开始研究这一过程的分子机制。台盼蓝拒染试验中的观察证实，经i7-01s-31处理后，SKBE3细胞发生了细胞死亡，而不是细胞生长停滞。为探讨订书肽诱导的细胞死亡是否与凋亡有关，对SKBR3细胞进行Annexin V和碘化丙啶(PI)染色，并使用流式细胞术进行分析。用FITC荧光团标记的Annexin V可特异性标记磷脂酰丝氨酸(PS)，这是一种凋亡的标记物，因为这种磷脂通常位于细胞膜的内侧，但在凋亡过程中通常翻转到细胞膜的表面。因此，Annexin V染色的增加是凋亡的可靠及特异性指标。PI是一种核酸结合染料，在坏死导致的细胞死亡后标记细胞，因为它只能在细胞膜完整性丧失时到达细胞核，这是坏死的标志特征。相比之下，我们的流式细胞术数据显示，使用阿霉素(一种已知可诱导凋亡的化疗药物)处理后，Annexin V阳性细胞显著增多，证实了凋亡是细胞死亡的主要原因(如图12所示)。无论是Tat-SP4还是新开发的i7-01s-31，都只导致PI阳性染色细胞的显著增加，而没有导致Annexin V阳性细胞的增加(如图12所示)。此外，细胞坏死程度与剂量有关，并与所使用的订书肽的效力密切相关。i7-01s-31在10μM时可诱导约30％的PI阳性细胞，而在相同浓度下，Tat-SP4只能诱导约8％的PI阳性细胞(如图12所示)。这种细胞坏死是由自噬活性升高引起的还是由EGFR和HER2受体的快速降解引起的还需要进一步的研究。

设计带有全碳氢链的订书肽来强化其α-螺旋结构已成为一种产生能够与目标蛋白特异性结合的分子原型的有效策略。订书肽在调节特定生物活性方面的效力受到许多因素的影响。最重要的考虑是，确保订书肽及其全碳氢链桥连结构能够特异性且紧密地插入目标蛋白上的预期结合位点。为了实现强特异性结合，订书肽的氨基酸序列经过系统筛选，以确定最适合目标蛋白结合位点的残基。对于全碳氢链，通常的方法是将这部分远离预期的结合位点，以避免可能的干扰。有趣的是，本发明发现位于结合界面边缘的全碳氢链实际上可以通过与目标蛋白的互补疏水相互作用来加强蛋白质-订书肽的相互作用。在这里，我们提供的数据表明，这种将全碳氢链放置在靠近蛋白-订书肽结合界面的策略有助于增强Beclin 1靶向订书肽的结合亲和力和生物活性。Beclin 1的卷曲螺旋结构域形成了一个长长的α-螺旋，其表面宽广但缺乏明确的结合位点。我们之前研究的原型肽是一个短的三圈两性螺旋结构，有11个残基，因此只有3个疏水残基(L192、L196和V199)与Beclin 1卷曲螺旋结构域界面直接相互作用(如图4中a所示)。在本研究中，我们进行了“装订位置扫描”，以探索所有可能的位置，以便在α-螺旋肽上安装全碳氢链。我们的分子建模结果表明，在i7-01s支架中，将全碳氢链放置在靠近Beclin 1-多肽结合界面边缘的位置，可以使其停留在Beclin 1分子表面的疏水区域(如图4中b所示)。这些新设计的订书肽在体外与Beclin 1的结合亲和力提高了10-30倍，在体内抗HER2阳性癌细胞增殖的能力提高了2-5倍。我们的研究表明，对于靶向缺乏常规结合位点的卷曲螺旋结构域的多肽，将全碳氢链放置在更靠近卷曲螺旋域表面可能是一种通过有效扩大疏水结合界面来增强其结合亲和力的有效方法。

尽管Beclin 1被广泛认为是一种肿瘤抑制因子，但通过药物靶向Beclin 1或调控Beclin 1介导的自噬过程来治疗癌症一直具有挑战性。大量的研究表明，自噬在癌症中的功能作用是一把双刃剑，其抗肿瘤和促肿瘤作用通常依赖于肿瘤组织和细胞的类型、肿瘤微环境及肿瘤分期。因此，单纯地增强或阻断自噬可能无法产生足够的临床疗效。事实上，一些临床试验测试了羟氯喹(一种常用的自噬抑制剂)的抗癌功效，结果并不确定。在这里，我们通过使用与Beclin 1卷曲螺旋结构域结合的，具有优化的特异性和效力的订书肽，提出了一种调节癌细胞中Beclin 1活性的替代方法。这些订书肽具有上调自噬和内体-溶酶体转运的独特功能，这是其他自噬诱导物如雷帕霉素或Tat-Beclin 1订书肽所没有的特征。而且，这些新的订书肽与Beclin 1的结合亲和力增强了10-30倍，显著增强了细胞表面致癌受体EGFR和HER2的内体-溶酶体降解，可能也减弱了它们的下游信号通路。考虑到EGFR或HER2驱动的癌细胞特别依赖EGFR和HER2信号通路来维持增殖和转移，它们可能对我们的Beclin 1靶向订书肽异常敏感。综上所述，我们利用全碳氢链订书肽靶向Beclin 1卷曲螺旋结构域来增强自噬和内体-溶酶体运输的方法可能是EGFR或HER2驱动的癌症的有效治疗策略。

在一些实施方式中，还提供了一种靶向Beclin1的订书肽的设计方法，其所用到的试剂和抗体包括：氯喹(CQ)、表皮生长因子(EGF)、蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics)、胰蛋白酶(Invitrogen)、异丙基-β-d-thiactopyranoside(IPTG)抗β-actin抗体(圣克鲁斯生物技术)，抗lc3抗体(Abnova)，抗p62抗体(Abnova)，抗egfr抗体(圣克鲁斯生物技术)，抗her2抗体(细胞信号技术)，抗小鼠IgG-HRP(Sigma-Aldrich)，抗兔IgG-HRP(Sigma-Aldrich)；其具体的计算设计方法包括：

将Beclin 1卷曲螺旋结构域上的α-螺旋片段(191-205残基)截断，作为设计与Beclin 1卷曲螺旋结构域结合的订书肽的模板。所有订书肽的分子模型均使用MOE软件(2019版，由化学计算小组发布)构建。在本研究中，我们将模板肽序列上被6个残基(即第i和第i+7个残基)分开的2个锚定残基使用一个全碳氢链桥连结构连接起来。一共设计了6对锚定残基(如图2所示)，分别是i7-01s(连接E195和N202)、i7-02s(连接R191和D198)、i7-03s(连接D198和V205)、i7-04s(连接Q194和K201)、i7-05s(连接E197和K204)、i7-06s(连接I193和E200)。

在本研究中，我们选择i7-01s支架对Native-P1的序列进行计算机模拟突变，以获得新的具有更高结合亲和力的多肽。除两个锚定残基(即E195和N202)外，Native-P1序列上有13个残基均可被突变。将这13个氨基酸残基分别突变为其他19个天然氨基酸残基，得到13*20＝260个肽。每个订书肽-Beclin 1卷曲螺旋域的复合物模型直接衍生于i7-01s-Beclin 1卷曲螺旋域的复合物结构模型。那些设计的订书肽使用了分子动力学模拟和结合能预测进行评估(详见下面的技术细节)。基于预测的结合能，我们手工选择了一些有利的单点突变体，并将其组合成新的多点突变体，进一步增强其与Beclin 1卷曲螺旋域的相互作用。这一尝试产生了75个基于Native-P1序列的多重突变(少于5个点)的订书肽。其中，我们综合考虑了预测的结合方式和结合亲和力，以及它们的理化性质(如总电荷)，最终选择了17个订书肽进行化学合成。值得注意的是，在我们的分子模型中，每个设计的订书在N端和C端分别使用一个乙酰基和一个氨基封端。

我们进一步利用分子动力学(MD)模拟来评估Beclin 1卷曲螺旋结构域和设计的订书肽之间的相互作用。所有计算均使用AMBER18软件的CPU版本或AMBER16软件的GPU版本进行。用AMBER FF14SB力场处理Beclin 1和订书肽。每个设计的订书肽上的全碳氢链被技术性地处理为由一个双键连接的两个非自然氨基酸残基(即R8G和S5G:R8G由7个亚甲基单元组成，它们衍生于多肽主链骨架上的R构型的α-碳；而S5G则由四个亚甲基组成，这些亚甲基来自于多肽主链上的另一个S构型的α-碳。使用Gaussian 09软件在HF/6-31G*水平上计算了这两种非自然氨基酸残基上的原子电荷分布，然后利用AMBER软件中的约束静电势(RESP)方法进行了推导。

在这项工作中，我们使用Beclin 1(PDB entry 3Q8T)的卷曲螺旋结构域的晶体结构作为MD模拟的起点。为了方便起见，我们对卷曲螺旋域进行了截断，只保留V213和K264之间的片段。同一晶体结构上的R191到V205之间的片段被截取，作为设计订书肽的模板。通过将特定的残基突变为所需的残基，构建了每个订书肽模型。首先，对初始的Beclin1卷曲螺旋域-订书肽复合物的模型进行能量最小化以释放整个系统不合理的接触。然后，将复合物模型放入在一个填充有TIP3P水分子的立方盒子中。通过多轮我们之前的研究中描述的步骤处理后，整个系统被成功构建并且能量达到最小化。在最小化后，整个系统在100ps内从0K升温到300K，然后在1atm的恒压下平衡500ps。然后，对得到的系统进行时长为100ns的MD模拟。对每个订书肽进行了三次平行模拟，以增强构象采样。上述MD模拟过程的技术设置也与我们之前的工作相同。

使用AMBER软件中的MM-GB/SA(Molecular Mechanics Generalized-BornSurface Area)模块，评估每个订书肽与Beclin 1卷曲螺旋域的结合能。MM-GB/SA的基本设置与我们之前的研究相同。在本研究中，根据对应的MD轨迹中最后20ns的部分计算每个订书肽肽的结合能。值得注意的是，MM-GB/SA方程中的构型熵在本研究中没有计算，因为我们假设这部分在所有设计的订书肽中都大致相同。

订书肽的化学合成：

所有多肽样品均购自GL生化(上海)有限公司，一般来说，多肽是通过自动固相合成的，在指定的位置加入含有烯烃的氨基酸。然后，利用Grubbs催化剂在含烯烃的氨基酸上进行闭环易位反应生成全碳氢链桥连结构。与我们之前的研究类似，一个有助于穿透细胞膜的Tat序列(YGRKKRRQRRR)被添加到每个订书肽N端以协助其在细胞内传递。用HPLC和HRMS对产物的化学结构和纯度进行了表征。这些订书肽的HRMS和HPLC谱可在补充材料中查看。将订书肽溶解于纯水中制备成浓度为20mM的储备液。

蛋白表达和纯化：

Beclin 1卷曲螺旋结构域的表达和纯化如之前发表的文章所述。简单地说，将人Beclin 1(176-268残基)的卷曲螺旋域克隆到包含HRV(Human Rhinovirus)3C蛋白酶剪切位点和硫氧还蛋白(Trx,thioredoxin)-6xHis融合标签的被改造过的pET32a载体中。重组Beclin1卷曲螺旋域蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，并经Ni²⁺-NTA亲和层析(HisTrapHP,GE Healthcare)和分子排阻层析(Superdex 75,GE Healthcare)纯化。

等温滴定热法(ITC)：

ITC检测采用MicroCal PEAQ-ITC Automated(Malvern)在25℃下进行。所有订书肽和纯化好的Beclin 1卷曲螺旋域蛋白使用含有50mM Tris,150mM NaCl，pH为7.4的缓冲液稀释。每次滴定均将40μl订书肽放置在滴定注射器中，同时将Beclin 1卷曲螺旋域蛋白放置在样品池中。通常，滴定包括19次注射，每次注射的时间间隔为180秒，以确保滴定峰返回基线。使用MicroCal PEAQ-ITC分析软件分析滴定数据，并采用单位点结合模型进行拟合。

细胞培养：

HEK283T和SKBR3细胞株使用含有10％胎牛血清(Life Technologies)、1％青霉素G(100U/ml)和链霉素(100mg/ml)的DMEM培养基(Gibco,Grand Island,NY,USA)，并在37℃，5％CO2的培养箱中培养。实验所用细胞系均使用支原体检测试剂盒(Lonza)进行了检测，结果均为阴性。

细胞活性试验：

按照制造商提供的标准操作步骤，用台盼蓝拒染法测定细胞活性。将SKBR3细胞接种于含有完全培养基的96孔板中，密度为1×10⁴细胞/孔。细胞贴壁后，使用指定的订书肽或对照试剂处理24小时。然后在光镜(Olympus)下人工计数台盼蓝染色细胞数和细胞总数。细胞存活率为活细胞数除以细胞总数。所有实验重复三次，计算平均值。

免疫印迹分析：

使用添加了不含EDTA的“鸡尾酒”型蛋白酶抑制剂(Roche)的Laemmli样品缓冲液(62.5mM Tris-HCl,pH 6.8,2％SDS,25％甘油，5％β-巯基乙醇)对细胞进行裂解。在免疫印迹实验前，使用标准Bradford法测定蛋白浓度。首先使用SDS-PAGE对蛋白样品进行分离，然后将蛋白转移到PVDF膜上(Millipore,USA)，使用相应的一抗和酶标二抗进行孵育。使用ECL试剂对蛋白条带进行显色。β-actin作为内参蛋白来控制SDS-PAGE的上样量。

EGFR/HER2降解试验：

将6孔板中的HEK293T或SKBR3细胞用PBS洗涤2次，在DMEM培养基中血清饥饿过夜。37℃下200ng/mL EGF可诱导EGFR和HER2的内吞作用。经EGF刺激后，在指定时间点收集细胞，并按照免疫印迹分析的方法裂解细胞。

流式细胞术：

按照制造商提供的标准操作步骤，通过流式细胞术评估细胞凋亡和坏死的程度。简单地说，用胰酶收集经过订书肽处理的SKBR3细胞，用Annexin V和PI(Invitrogen)进行标记，使用流式细胞仪系统检测(BD Accuri C6)，并使用BD Accuri C6软件进行结果分析。Annexin V/PI染色可区分细胞群。通常，左下象限的细胞群为活细胞(Annexin V-，PI-)，右下象限为早期凋亡细胞(Annexin V+，PI-)，右上象限为晚期凋亡细胞(Annexin V+，PI+)，左上象限为坏死细胞(Annexin V-，PI+)。

综上所述，本发明通过调整全碳氢链插入的位置和订书肽的氨基酸序列对靶向Beclin 1的订书肽进行了优化，结果表明，将全碳氢链放置在离Beclin 1-订书肽结合界面更近的位置，可使其结合亲和力提高10-30倍。与其他自噬诱导剂如雷帕霉素和Tat-Beclin1订书肽相比，本发明优化的订书肽在HER2阳性癌细胞中不仅能诱导自噬，还能显著增强细胞表面致癌受体EGFR和HER2的内体-溶酶体降解，考虑到EGFR和HER2信号通路在癌细胞增殖中的重要性，本发明提供的靶向Beclin 1的订书肽可作为EGFR或HER2驱动的癌症的有效治疗候选。

应当理解的是，本公开的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本公开所附权利要求的保护范围。

序列表

<110> 香港理工大学深圳研究院复旦大学

<120> 一种靶向Beclin1的订书肽、药物组合物

<160> 75

<210> 1

<211>

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 1

Arg Leu Ile Gln Xaa Leu Leu Asp Arg Glu Ala Xaa Arg Ile Val

1 5 10 15

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 2

Arg Leu Ile Gln Xaa Arg Glu Asp Arg Glu Lys Xaa Arg Ala Val

1 5 10 15

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 3

Arg Leu Ile Gln Xaa Thr Glu Asp Ser Glu Lys Xaa Arg Ala Val

1 5 10 15

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 4

Arg Leu Ile Ser Xaa Leu Glu Asp Arg Asp Lys Xaa Arg Lys Val

1 5 10 15

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 5

Arg Leu Ile Gln Xaa Arg Glu Asp Arg Glu Lys Xaa Arg Lys Val

1 5 10 15

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 6

Arg Leu Ile Ser Xaa Leu Leu Asp Arg Glu Lys Xaa Arg Gly Val

1 5 10 15

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 7

Arg Leu Ile Ser Xaa Leu Leu Asp Arg Glu Ala Xaa Arg Ala Val

1 5 10 15

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 8

Leu Lys Ile Gln Xaa Lys Glu Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Val

1 5 10 15

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 9

Leu Leu Ile Gln Xaa Lys Glu Asp Val Glu Lys Xaa Arg Ala Val

1 5 10 15

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 10

Arg Leu Ile Gln Xaa Arg Glu Asp Arg Glu Lys Xaa Arg Ala Arg

1 5 10 15

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 11

Arg Leu Ile Gln Xaa Arg Glu Asp Arg Glu Lys Xaa Arg Ala Glu

1 5 10 15

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 12

Arg Leu Ile Gln Xaa Arg Glu Asp Val Glu Lys Xaa Arg Ala Glu

1 5 10 15

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 13

Arg Leu Ile Gln Xaa Arg Glu Asp Val Glu Lys Xaa Arg Ala Glu

1 5 10 15

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 14

Leu Leu Ile Gln Xaa Arg Leu Asp Arg Glu Ala Xaa Arg Ala Glu

1 5 10 15

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 15

Arg Leu Ile Ser Xaa Arg Glu Asp Arg Glu Lys Xaa Arg Ala Val

1 5 10 15

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 16

Tyr Leu Ile Phe Xaa Leu Thr Asp Leu Glu Lys Xaa Arg Val Val

1 5 10 15

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 17

Cys Leu Ile Trp Xaa Leu Ile Asp Val Leu Lys Xaa Arg Ala Val

1 5 10 15

<210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 18

Met Leu Ile Asp Xaa Leu Ile Asp Val Val Lys Xaa Arg Val Val

1 5 10 15

<210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 19

Arg Leu Ile Ile Xaa Leu Arg Trp Lys Glu Arg Xaa Arg Lys Val

1 5 10 15

<210> 20

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 20

Arg Val Ile Gln Xaa Leu Val Ile Ile Glu Lys Xaa Arg Asp Val

1 5 10 15

<210> 21

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 21

Arg Leu Ile Val Xaa Leu His Asp Arg Ile Lys Xaa Arg Leu Val

1 5 10 15

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 22

Arg Leu Ile Lys Xaa Leu Phe Tyr Val Glu Lys Xaa Arg Cys Ile

1 5 10 15

<210> 23

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 23

Arg Leu Ile Gln Xaa Leu Thr Ile Val Leu Ile Xaa Arg Arg Val

1 5 10 15

<210> 24

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 24

Tyr Leu Ile Gln Xaa Leu Ile Tyr Val Glu Lys Xaa Arg Gln Ile

1 5 10 15

<210> 25

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 25

Arg Leu Pro Glu Xaa Ile Met Asp Val Ile Lys Xaa Arg Lys Val

1 5 10 15

<210> 26

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 26

Gln Leu Ile Gln Xaa Leu Phe Tyr Val Leu Lys Xaa Ile Lys Val

1 5 10 15

<210> 27

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 27

Trp Leu Phe Gln Xaa Leu Leu Asp Val Glu Lys Xaa Ile Val Val

1 5 10 15

<210> 28

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 28

Arg Leu Ile Met Xaa Lys Glu Asp Val Leu Lys Xaa Arg Ser Leu

1 5 10 15

<210> 29

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 29

Arg Leu Ile Met Xaa Val Glu Asp Val Leu Lys Xaa Lys Leu Val

1 5 10 15

<210> 30

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 30

Arg Leu Leu Gln Xaa Leu Lys Thr Val Leu Lys Xaa Arg Ser Val

1 5 10 15

<210> 31

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 31

Val Leu Phe Asn Xaa Leu Val Asp Val Ile Lys Xaa Arg Lys Val

1 5 10 15

<210> 32

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 32

Glu Leu Ile Ser Xaa Leu Phe Phe Val Glu Lys XaaArg Thr Val

1 5 10 15

<210> 33

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 33

Arg Leu Ile Gln XaaLeu Val Arg Val Gly Lys Xaa Ile Ser Val

1 5 10 15

<210> 34

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 34

Arg Phe Ile Gln Xaa Leu Glu Val Val Ile Lys Xaa Arg Ser Val

1 5 10 15

<210> 35

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 35

Asp Leu Ile Phe Xaa Leu Trp Tyr Val Glu Lys Xaa Ile Lys Val

1 5 10 15

<210> 36

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 36

Arg Leu Ile Gln Xaa Arg Glu Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 15

<210> 37

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 37

Arg Leu Ile Gln Xaa Lys Glu Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 15

<210> 38

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 38

Arg Leu Ile Gln Xaa Tyr Glu Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 15

<210> 39

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 39

Arg Leu Ile Gln Xaa Trp Trp Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Val

1 5 10 15

<210> 40

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 40

Arg Leu Ile Gln Xaa Trp Trp Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 15

<210> 41

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 41

Arg Leu Ile Gln Xaa His Glu Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 15

<210> 42

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 42

Arg Leu Ile Gln Xaa Trp Phe Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Val

1 5 10 15

<210> 43

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 43

Arg Leu Ile Gln Xaa Trp Ser Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Val

1 5 10 15

<210> 44

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 44

Arg Leu Ile Gln Xaa Glu Glu Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Trp

1 5 10 15

<210> 45

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 45

Arg Leu Lys Gln Xaa Leu Glu Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 15

<210> 46

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (4) ..(4)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 46

Arg Leu Ile Xaa Lys Ile Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 14

<210> 47

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 47

Tyr Leu Ile Gln Xaa Met Glu Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 15

<210> 48

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 48

Tyr Leu Ile Gln Xaa Gln Glu Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 15

<210> 49

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 49

Trp Leu Ile Gln Xaa Trp Thr Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Val

1 5 10 15

<210> 50

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 50

Arg Leu Ile Gln Xaa Met Glu Asp Val Glu Glu Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 15

<210> 51

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 51

Arg Leu Ile Gln Xaa Met Gly Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 15

<210> 52

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 52

Arg Leu Ile Gln Xaa Leu Glu Asp Val Glu Lys Xaa Arg Phe Trp

1 5 10 15

<210> 53

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 53

Tyr Leu Ile Gln Xaa Trp Met Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Val

1 5 10 15

<210> 54

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 54

Ala Leu Ile Gln Xaa Gln Glu Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 15

<210> 55

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 55

Arg Leu Ile Gln Xaa Phe Glu Asp Val Leu Lys Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 15

<210> 56

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 56

Arg Leu Ile Gln Xaa Met Glu Asp Val Leu Lys Xaa Arg Lys Trp

1 5 10 15

<210> 57

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 57

Arg Arg Ile Gln Xaa Met Glu Asp Val Leu Lys Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 15

<210> 58

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 58

Arg Leu Ile Glu Xaa Arg Glu Ile Val Glu Lys Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 15

<210> 59

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 59

Gln Leu Ile Gln Xaa Arg Ser Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Trp

1 5 10 15

<210> 60

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 60

Arg Leu Ile Gln Xaa Lys Cys Gly Val Glu Lys Xaa Arg Lys Trp

1 5 10 15

<210> 61

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 61

Arg Leu Ile Gln Xaa Met Glu Asp Val Thr Lys Xaa Arg Ile Trp

1 5 10 15

<210> 62

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 62

Arg Arg Ile Asn Xaa Lys Glu Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Lys

1 5 10 15

<210> 63

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 63

Arg Leu Ile Gln Xaa Tyr His Asp Val Asp Lys Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 15

<210> 64

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 64

Arg Leu Ile Ile Xaa Gln Glu Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 15

<210> 65

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 65

Arg Arg Ile Leu Xaa Leu Met Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 15

<210> 66

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 66

Arg Leu Ile Gln Xaa Trp Trp Ser Val Asp Lys Xaa Arg Lys Trp

1 5 10 15

<210> 67

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 67

Arg Leu Ile Gln Xaa Trp Lys Ser Val Glu Lys Xaa Arg Gly Trp

1 5 10 15

<210> 68

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 68

Arg Leu Ile His Xaa Lys Glu Asp Val Glu Thr Xaa Arg Gln Arg

1 5 10 15

<210> 69

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 69

Arg Leu Lys Gln Xaa Lys Ser Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Trp

1 5 10 15

<210> 70

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 70

Arg Leu Ile Gln Xaa Lys Gly Asp Val Glu Leu Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 15

<210> 71

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 71

Arg Leu Ile Asn Xaa Lys Glu Trp Val Glu His Xaa Arg Lys Trp

1 5 10 15

<210> 72

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 72

Arg Leu Ile Gln Xaa Arg Gln Asp Val Arg Ile Xaa Arg Lys Trp

1 5 10 15

<210> 73

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (6) ..(6)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 73

Arg Leu Lys His Met Xaa Trp Gly Ser Val Glu Lys Xaa Arg Lys Val

1 5 10 15 16

<210> 74

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 74

Arg Leu Ile Met Xaa Arg Glu Thr Asn Glu Lys Xaa Arg Lys Trp

1 5 10 15

<210> 75

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 杂项特征

<222> (5) ..(5)

<223> Xaa =(R)-2-氨基-2-甲基-9-癸烯酸残基

<221> 杂项特征

<222> (12) ..(12)

<223> Xaa =(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸残基

<400> 75

Arg Leu Ile Tyr Xaa Met Glu Asp Val Glu Lys Xaa Arg Lys Arg

1 5 10 15