一种提高抗体产量的信号肽
技术领域
本发明涉及分子生物学
技术领域
，具体涉及一种提高抗体产量的信号肽。背景技术
信号肽是位于新生分泌型蛋白质及细胞膜蛋白N端的一段特有的氨基酸序列，可以将蛋白定位于细胞膜或跨膜到达细胞外。信号肽的长度一般在30个氨基酸左右，由带有正电荷的N结构域、富含疏水氨基酸的H结构域以及带有负电荷的C结构域组成。抗体是哺乳动物免疫B细胞分泌的一类蛋白，由于抗体的多态性，每一个抗体分子的序列均不一样，因此，每种抗体的信号肽序列也不同，导致抗体分泌效率差异。当抗体或抗体融合蛋白分泌表达效率低下时，找到分泌效率更高的信号肽就尤为重要。
早有报道表明更换信号肽后可以显著提高蛋白分泌表达量。周同等人用鼠源信号肽序列替换人激肽释放酶基因(hK)原有的信号肽序列后，Fc融合蛋白hK＇-Fc的分泌效率提高约5～10倍，且具有生物学活性(生物工程学报.11,1697-1704.2009)。Yizhou Zhou等为了改善单克隆抗体重链分泌，研究了在受控TIR强度下各种信号肽的作用。与其他测试的信号肽相比，二硫键氧化还原酶(DsbA)的信号肽介导了重链的更有效分泌(Microbial CellFactories.15:47,2016)。蔡海松等人研究不同的信号肽和化学通透剂对重组环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)胞外分泌的影响，Omp A信号肽介导的分泌效果最好，胞外酶活达到7.44U/m L，分别是Pel B、CHB1自身信号肽的2.04倍和11.27倍(微生物学通报.3,601-610.2017)。Zhu Jiang等人筛选了12个枯草芽孢杆菌中二乙酰壳聚糖脱乙酰酶分泌的信号肽，信号肽YncM达到了最高的13.5diU/ml的细胞外二乙酰壳聚糖脱乙酰酶活性(Appliedand Environmental Microbiology.85:17,2019)。
因此优化筛选信号肽对于提高抗体或抗体融合蛋白及酶类等分泌表达量，降低生产成本具有重要意义。
发明内容
针对现有技术所存在的上述缺点，本发明在于提供一种提高抗体产量的信号肽。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种提高抗体产量的信号肽，所述信号肽氨基酸序列为：
MNFGLSWVFLVLVLKGVQC或MVFTPQILGLMLFWISASRG，分别来自抗体1G11的重链和轻链。
本发明进一步设置为：所述信号肽用于提高目的蛋白的分泌性表达。
本发明进一步设置为：所述信号肽为抗体的分泌性表达。
本发明进一步设置为：所述信号肽通过PCR扩增hIgG1-SpyTag基因片段，然后凝胶回收相应片段，克隆至phIgG1-3D6载体上的多克隆位点Sal I与HindⅢ之间，构建成可表达融合蛋白3D6-SpyTag的重链表达载体phIgG1-3D6-SpyTag。
本发明进一步设置为：所述信号肽通过PCR扩增hIgG1Fc-SpyTag基因片段，然后凝胶回收相应片段，克隆至pVKD1.0-V3载体上的多克隆位点Xba I与BglⅡ之间，构建成可表达融合蛋白V3-SpyTag的表达载体pVKD1.0-V3-SpyTag。
本发明进一步设置为：所述信号肽通过PCR扩增hIgG1Fc-SpyTag基因片段，然后凝胶回收相应片段，克隆至pVKD1.0-V3载体上的多克隆位点Sal I与BglⅡ之间，构建成可表达融合蛋白V3-SpyTag-His的表达载体pVKD1.0-V3-SpyTag-His。
本发明进一步设置为：所述信号肽通过PCR扩增1G11SP-LA5VH基因片段，然后凝胶回收相应片段，克隆至phIgG1-Vclone载体上的多克隆位点EcoR I与Sal I之间，构建成可表达抗体LA5的重链表达载体phIgG1-LA5。
本发明进一步设置为：所述信号肽通过PCR扩增1G11SP-LA5VL基因片段，然后凝胶回收相应片段，克隆至phIgK-Vclone载体上的多克隆位点EcoR I与Xho I之间，构建成可表达抗体LA5的轻链表达载体phIgK-LA5。
本发明进一步设置为：所述信号肽通过PCR扩增1G11SP-3D6-SpyTag基因片段，然后凝胶回收相应片段，克隆至phIgG1-3D6-SpyTag载体上的多克隆位点EcoR I与HindⅢ之间，构建成可表达融合蛋白3D6-SpyTag的重链表达载体
phIgG1-3D6-SpyTag。
本发明进一步设置为：所述载体的构建均采用限制内切酶鉴定载体。
有益效果
采用本发明提供的技术方案，与已知的公有技术相比，具有如下有益效果：
本发明中，将信号肽进行PCR扩增不同的基因片段，并进行凝胶回收，在通过限制内切酶进行载体的鉴定，可以提高目的基因，特别是抗体分泌的产生量。
附图说明
图1为抗体融合蛋白3D6-SpyTag重链表达载体phIgG1-3D6-SpyTag的质粒图谱；
图2为抗体融合蛋白3D6-SpyTag重链表达载体phIgG1-3D6-SpyTag的双酶切鉴定图；
图3为抗体融合蛋白3D6-SpyTag(N)重链表达载体phIgG1-3D6-SpyTag(N)的质粒图谱；
图4为抗体融合蛋白3D6-SpyTag(N)重链表达载体phIgG1-3D6-SpyTag(N)的双酶切鉴定图；
图5为抗体融合蛋白3D6-SpyTag(N)轻链表达载体phIgK-3D6(N2)的质粒图谱；
图6为抗体融合蛋白3D6-SpyTag(N)轻链表达载体phIgK-3D6(N2)的双酶切鉴定图；
图7是抗体融合蛋白3D6-SpyTag和3D6-SpyTag(N)的表达鉴定图；
图8为抗体融合蛋白V3-SpyTag表达载体pVKD1.0-V3-SpyTag的质粒图谱；
图9为抗体融合蛋白V3-SpyTag表达载体pVKD1.0-V3-SpyTag的双酶切鉴定图；
图10为抗体融合蛋白V3-SpyTag-His表达载体pVKD1.0-V3-SpyTag-His的质粒图谱；
图11为抗体融合蛋白V3-SpyTag-His表达载体pVKD1.0-V3-SpyTag-His的双酶切鉴定图；
图12是抗体融合蛋白V3-SpyTag和V3-SpyTag-His的表达鉴定图；
图13为抗体LA5(N)重链表达载体phIgG1-LA5(N)的质粒图谱；
图14为抗体LA5(N)重链表达载体phIgG1-LA5(N)的双酶切鉴定图；
图15为抗体LA5(N)轻链表达载体phIgK-LA5(N)的质粒图谱；
图16为抗体LA5(N)轻链表达载体phIgK-LA5(N)的双酶切鉴定图；
图17为抗体LA5和LA5(N)的表达鉴定图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
参照图1-17所示：本发明的目的是提供一种提高抗体产量的信号肽，分别来自抗体1G11的重链和轻链，信号肽氨基酸序列为：
MNFGLSWVFLVLVLKGVQC或MVFTPQILGLMLFWISASR。
信号肽用于提高目的蛋白的分泌性表达，信号肽为抗体的分泌性表达。
实施例1抗体融合蛋白3D6-SpyTag重链表达载体构建
SpyTag(多肽段)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的哺乳动物密码子优化序列(SEQID NO:2)及3D6(抗人DEC205单克隆抗体)重链表达载体phIgG1-3D6(信号肽为鼠IgG1信号肽，氨基酸序列SEQ ID NO:3)和轻链表达载体phIgK-3D6(信号肽为鼠IgG1信号肽，氨基酸序列SEQ ID NO:3)由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供。以phIgG1-3D6为模板，设计引物(表1)，通过PCR扩增hIgG1-SpyTag基因片段，然后凝胶回收相应片段，克隆至phIgG1-3D6载体上的多克隆位点Sal I与HindⅢ之间，构建成可表达融合蛋白3D6-SpyTag的重链表达载体phIgG1-3D6-SpyTag(质粒图谱如图1)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶Sal I与HindⅢ鉴定载体phIgG1-3D6-SpyTag(酶切体系如表2)，其酶切验证图谱如图2所示。
表1：实施例1中的引物
表2：质粒phIgG1-3D6-SpyTag的酶切鉴定体系(37℃酶切4小时)
实施例2抗体融合蛋白3D6-SpyTag(N)重链表达载体构建
1G11重链信号肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的哺乳动物密码子优化序列(SEQID NO:7)由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供。以phIgG1-3D6-SpyTag(实施例1自构建)为模板，设计引物(表3)，通过PCR扩增1G11SP-3D6-SpyTag基因片段，然后凝胶回收相应片段，克隆至phIgG1-3D6-SpyTag载体上的多克隆位点EcoR I与HindⅢ之间，构建成可表达融合蛋白3D6-SpyTag(N)的重链表达载体phIgG1-3D6-SpyTag(N)(质粒图谱如图3)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶EcoR I与HindⅢ鉴定载体phIgG1-3D6-SpyTag(N)(酶切体系如表4)，其酶切验证图谱如图4所示。
表3：实施例2中的引物
表4：质粒phIgG1-3D6-SpyTag(N)的酶切鉴定体系(37℃酶切4小时)
实施例3抗体融合蛋白3D6-SpyTag(N)轻链表达载体构建
1G11轻链信号肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)的哺乳动物密码子优化序列(SEQID NO:12)和3D6(抗人DEC205单克隆抗体)轻链表达载体phIgK-3D6(信号肽为鼠IgG1信号肽，氨基酸序列SEQ ID NO:3)由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供。以phIgK-3D6为模板，设计引物(表5)，通过PCR扩增1G11SP-3D6VL-hIgkappa基因片段，然后凝胶回收相应片段，克隆至phIgK-3D6载体上的多克隆位点EcoR I与HindⅢ之间，构建成可表达融合蛋白3D6-SpyTag(N)的轻链表达载体phIgK-3D6(N2)(质粒图谱如图5)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶EcoR I与HindⅢ鉴定载体phIgK-3D6(N2)(酶切体系如表6)，其酶切验证图谱如图6所示。
表5：实施例3中的引物
表6：质粒phIgK-3D6(N2)的酶切鉴定体系(37℃酶切4小时)
实施例4抗体融合蛋白3D6-SpyTag和3D6-SpyTag(N)表达鉴定
将实施例1中构建的抗体融合蛋白3D6-SpyTag重链表达载体和3D6(抗人DEC205单克隆抗体)轻链表达载体phIgK-3D6(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)以质量比1:1共同转染293T细胞，表达3D6-SpyTag蛋白。将实施例2中构建的抗体融合蛋白3D6-SpyTag(N)重链表达载体和实施例3中构建的抗体融合蛋白3D6-SpyTag(N)轻链表达载体质量比1:1共同转染293T细胞，表达3D6-SpyTag(N)蛋白。具体方法如下。第1天，在6孔细胞培养板(JET，TCP-010-006)铺293T细胞，0.8×106/孔，于37℃二氧化碳细胞培养箱中过夜孵育。第二天，准备两个蛋白的表达载体/转染试剂复合物。转染试剂为Turbofect(ThermoFisher Scientific，R0531)，转染剂量与复合方法可参见转染试剂说明书。复合体系完成后，将293T细胞上清换为2mL/孔的含20％Ultraculture(含1％Glu，Lonza，BEBP12-725F)的DMEM维持培养基，然后加入表达载体/转染试剂复合物。转染72小时后，取上清80微升加20微升5×SDS-PAGE上样缓冲液(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)，沸水浴10分钟制样，Westblot鉴定蛋白表达。Westblot的方法为本领域人员熟知，简述如下。按照蛋白标记(Thermo，货号26616)、阴性对照、3D6-SpyTag、3D6-SpyTag(N)的顺序依次点样，电泳80v 30分钟后再调电压至120v至指示剂到底，转膜(millipore，IPVH00010)300mA2小时，5％脱脂牛奶室温封闭1小时，HRP-兔抗人IgG(BOSTER，BA1070)1:2000稀释室温孵育2小时，再用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗5遍后，化学发光结果表明1G11信号肽显著提高了抗体融合蛋白3D6-SpyTag(N)的分泌表达，如图7所示。
实施例5抗体融合蛋白V3-SpyTag表达载体构建
3D6(抗人DEC205单克隆抗体)单链表达载体pVKD1.0-V3(信号肽为鼠IgG1信号肽，氨基酸序列SEQ ID NO:3)由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供。以phIgG1-3D6-SpyTag(实施例1自构建)为模板，设计引物(表7)，通过PCR扩增hIgG1Fc-SpyTag基因片段，然后凝胶回收相应片段，克隆至pVKD1.0-V3载体上的多克隆位点Xba I与BglⅡ之间，构建成可表达融合蛋白V3-SpyTag的表达载体pVKD1.0-V3-SpyTag(质粒图谱如图8)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶Xba I与BamH I鉴定载体pVKD1.0-V3-SpyTag(酶切体系如表8)，其酶切验证图谱如图9所示。
表7：实施例5中的引物
表8：质粒pVKD1.0-V3-SpyTag的酶切鉴定体系(37℃酶切4小时)
实施例6抗体融合蛋白V3-SpyTag-His表达载体构建
1G11重链信号肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的哺乳动物密码子优化序列(SEQID NO:7)和3D6(抗人DEC205单克隆抗体)单链表达载体pVKD1.0-V3(信号肽为鼠IgG1信号肽，氨基酸序列SEQ ID NO:3)由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供。以pVKD1.0-V3为模板，设计引物(表9)，通过PCR扩增V3-GSGSGS-ST-His基因片段，然后凝胶回收相应片段，克隆至pVKD1.0-V3载体上的多克隆位点Sal I与BglⅡ之间，构建成可表达融合蛋白V3-SpyTag-His的表达载体pVKD1.0-V3-SpyTag-His(质粒图谱如图10)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶Sal I与BglⅡ鉴定载体pVKD1.0-V3-SpyTag-His(酶切体系如表10)，其酶切验证图谱如图11所示。
表9：实施例6中的引物
表10：质粒pVKD1.0-V3-SpyTag-His的酶切鉴定体系(37℃酶切4小时)
实施例7抗体融合蛋白V3-SpyTag和V3-SpyTag-His表达鉴定
将实施例5中构建的抗体融合蛋白V3-SpyTag表达载体转染293T细胞，表达V3-SpyTag蛋白。将实施例6中构建的抗体融合蛋白V3-SpyTag-His表达载体转染293T细胞，表达V3-SpyTag-His蛋白。具体方法如下。第1天，在6孔细胞培养板(JET，TCP-010-006)铺293T细胞，0.8×106/孔，于37℃二氧化碳细胞培养箱中过夜孵育。第二天，准备两个蛋白的表达载体/转染试剂复合物。转染试剂为Turbofect(Thermo Fisher Scientific，R0531)，转染剂量与复合方法可参见转染试剂说明书。复合体系完成后，将293T细胞上清换为2mL/孔的含20％Ultraculture(含1％Glu，Lonza，BEBP12-725F)的DMEM维持培养基，然后加入表达载体/转染试剂复合物。转染72小时后，取上清80微升加20微升5×SDS-PAGE上样缓冲液(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)，沸水浴10分钟制样，Westblot鉴定蛋白表达。Westblot的方法为本领域人员熟知，简述如下。按照蛋白标记(Thermo，货号26616)、阴性对照、V3-SpyTag、V3-SpyTag-His的顺序依次点样，电泳80v 30分钟后再调电压至120v至指示剂到底，转膜(millipore，IPVH00010)300mA 2小时，5％脱脂牛奶室温封闭1小时，HRP-兔抗人IgG(BOSTER，BA1070)1:2000稀释室温孵育2小时，再用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗5遍后，化学发光结果表明1G11重链信号肽显著提高了抗体融合蛋白V3-SpyTag-His的分泌表达，如图12所示。
实施例8抗体LA5(N)重链表达载体构建
1G11重链信号肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的哺乳动物密码子优化序列(SEQID NO:7)和抗体LA5重链表达载体phIgG1-LA5及人源化抗体重链表达载体phIgG1-Vclone由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供。以phIgG1-LA5为模板，设计引物(表11)，通过PCR扩增1G11SP-LA5VH基因片段，然后凝胶回收相应片段，克隆至phIgG1-Vclone载体上的多克隆位点EcoR I与Sal I之间，构建成可表达抗体LA5(N)的重链表达载体phIgG1-LA5(N)(质粒图谱如图13)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶EcoR I与HindⅢ鉴定载体phIgG1-LA5(N)(酶切体系如表12)，其酶切验证图谱如图14所示。
表11：实施例8中的引物
表12：质粒phIgG1-LA5(N)的酶切鉴定体系(37℃酶切4小时)
实施例9抗体LA5(N)轻链表达载体构建
1G11重链信号肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的哺乳动物密码子优化序列(SEQID NO:7)和抗体LA5轻链表达载体phIgK-LA5及人源化抗体轻链表达载体phIgK-Vclone由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供。以phIgK-LA5为模板，设计引物(表13)，通过PCR扩增1G11SP-LA5VL基因片段，然后凝胶回收相应片段，克隆至phIgK-Vclone载体上的多克隆位点EcoR I与Xho I之间，构建成可表达抗体LA5(N)的轻链表达载体phIgK-LA5(N)(质粒图谱如图15)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶Kpn I鉴定载体phIgK-LA5(N)(酶切体系如表14)，其酶切验证图谱如图16所示。
表13：实施例9中的引物
表14：质粒phIgK-LA5(N)的酶切鉴定体系(37℃酶切4小时)
实施例10抗体LA5和LA5(N)表达鉴定
将抗体LA5的重链表达载体phIgG1-LA5和轻链表达载体phIgK-LA5(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)以质量比1:1共同转染293T细胞，表达LA5蛋白。将实施例8中构建的抗体LA5(N)重链表达载体和实施例9中构建的抗体LA5(N)轻链表达载体质量比1:1共同转染293T细胞，表达LA5(N)蛋白。具体方法如下。第1天，在6孔细胞培养板(JET，TCP-010-006)铺293T细胞，0.8×106/孔，于37℃二氧化碳细胞培养箱中过夜孵育。第二天，准备两个蛋白的表达载体/转染试剂复合物。转染试剂为Turbofect(Thermo FisherScientific，R0531)，转染剂量与复合方法可参见转染试剂说明书。复合体系完成后，将293T细胞上清换为2mL/孔的含20％Ultraculture(含1％Glu，Lonza，BEBP12-725F)的DMEM维持培养基，然后加入表达载体/转染试剂复合物。转染72小时后，取上清80微升加20微升5×SDS-PAGE上样缓冲液(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)，沸水浴10分钟制样，Westblot鉴定蛋白表达。Westblot的方法为本领域人员熟知，简述如下。按照蛋白标记(Thermo，货号26616)、阴性对照、LA5、LA5(N)的顺序依次点样，电泳80v 30分钟后再调电压至120v至指示剂到底，转膜(millipore，IPVH00010)300mA 2小时，5％脱脂牛奶室温封闭1小时，HRP-兔抗人IgG(BOSTER，BA1070)1:2000稀释室温孵育2小时，再用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗5遍后，化学发光结果表明1G11重链信号肽显著提高了抗体LA5(N)的分泌表达，如图17所示。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不会使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
