一种源于中国鲎抗菌肽的抗氧化多肽、其制备及其应用
技术领域
本发明属于生物医学
技术领域
，涉及一种源于中国鲎抗菌肽的抗氧化多肽、其制备及其应用。背景技术
生物活性肽是介于氨基酸与蛋白质之间的分子聚合物，对生物机体的生命活动具有生理调节作用。生物活性肽在药品、食品和化妆品行业极具发展前景，其中具有抗氧化活性的多肽也叫做抗氧化肽。
人类多种疾病的发生，如癌症、老化、风湿性关节炎、动脉硬化等慢性疾病，都与机体的氧化损伤有关。正常生理环境下，机体会产生少量活性氧自由基，当受到环境压力时，会产生大量氧自由基，从而对机体造成氧化损伤，进而引起慢性疾病及器官衰老。人体通过适当摄入具有抗氧化活性的物质，可降低体内自由基水平，预防氧化应激，防止脂质过氧化，帮助机体抵御疾病。此外，由于皮肤的光老化作用是紫外线诱导皮肤细胞产生大量的氧自由基堆积而造成的，现在许多护肤品中加入抗氧化剂，不仅能清除体内过剩的自由基，而且对紫外线引起的线粒体的损伤和自由基诱导的脂质过氧化具有明显保护作用，还具有减少雀斑、延缓衰老、调节免疫和保护皮肤的作用。
目前，国内外对抗氧化肽的研究越来越多，对抗氧化肽的制备、分离纯化到抗氧化肽的检测方法以及性质研究与日俱增，专利文献CN 107226841 B提供了一类抗氧化超短肽及其应用，含有5～6个氨基酸；专利文献CN110256530A提供了一种抗氧化肽及其应用，分子量为700～800Da；专利文献CN 108373496A公开了一种抗氧化性多肽GTMGAVGPRG及其制备方法。利用化学固相合成法合成多肽的技术越来越成熟，未来将是合成抗氧化短肽的一种快速和有效方法。虽然以上方法能够成功获取抗氧化肽，但其产品的抗氧化性能还有进一步提升的空间。
因此，开发一种抗氧化性能极佳的抗氧化肽极具现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗氧化性能极佳的抗氧化肽，具体为一种源于中国鲎抗菌肽的抗氧化多肽、其制备及其应用。
鲎是一种古老的海洋生物，隶属节肢动物门、肢口纲、剑尾目、鲎科，在地球上已存活了4亿多年，被称为海洋“活化石”，其血液中存在50多种生物活性物质。本发明根据鲎血液中已发现的抗菌肽Tachystatin C，氨基酸序列为DYDWSLRGPPKCATYGQKCRTWSPPNCCWNLRCKAFRCRPR，截取其N末端第7～22位氨基酸残基，发现截取的小分子短肽RW-16，氨基酸序列为RGPPKCATYGQKCRTW，具有极强的抗氧化活性，稳定性极高。一级序列全长有16个氨基酸残基，分子量小、结构简单、无蛋白修饰，通过化学合成方法制备，工艺简便、产量高且纯度高。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种源于中国鲎抗菌肽的抗氧化多肽，所述抗氧化多肽包括如下所示的氨基酸序列(即SEQ ID NO:1)：
Arg-Gly-Pro-Pro-Lys-Cys-Ala-Thr-Tyr-Gly-Gln-Lys-Cys-Arg-Thr-Trp即RGPPKCATYGQKCRTW。
本发明的抗氧化多肽具有极强的抗氧化活性，极强的清除自由基能力，分子量小，结构简单，易于合成，可以用作抗氧化药物、食品添加剂、抗氧化化妆品，推广价值极高。
作为优选的技术方案：
如上所述的一种源于中国鲎抗菌肽的抗氧化多肽，抗氧化多肽含有16个氨基酸残基，故将其命名为RW-16，所述抗氧化多肽全序列的一级结构如下：
Arg-Gly-Pro-Pro-Lys-Cys-Ala-Thr-Tyr-Gly-Gln-Lys-Cys-Arg-Thr-Trp。
RW-16富含三种人体必需氨基酸，如赖氨酸(Lys)、苏氨酸(Thr)和色氨酸(Trp)，同时含有半胱氨酸(Cys)，其具有极强的抗氧化活性，稳定性极高，浓度为0.2mg/mL时对DPPH自由基的清除率为95.58％，对超氧自由基的清除率为52.97％；浓度为2mg/mL时对DPPH自由基的清除率为95.85％，对超氧自由基的清除率达95.07％。
如上所述的一种源于中国鲎抗菌肽的抗氧化多肽，所述抗氧化多肽的分子量为1852.14Da，等电点为9.85，净电荷为4，不稳定系数为1.41(极稳定)。本发明的抗氧化多肽的分子量小，易被机体吸收和利用，在水溶液中呈弱碱性，带正电荷，理论上食用(后续需临床验证)可中和胃酸，利于肠胃吸收，不稳定系数小于40代表稳定性较高，大于40代表稳定性较低，本发明的抗氧化多肽不稳定系数为1.41，说明在环境中极其稳定，不易失活。
本发明还提供制备如上所述的源于中国鲎抗菌肽的抗氧化多肽的方法，根据所述抗氧化多肽的氨基酸序列采用Fmoc多肽固相合成法化学合成得到源于中国鲎抗菌肽的抗氧化多肽。本发明的保护范围并不仅限于此，本领域技术人员可根据实际需要采用合适的制备方法，只要保证抗氧化多肽的氨基酸序列无误即可。
作为优选的技术方案：
如上所述的方法，在采用Fmoc多肽固相合成法化学合成多肽后通过反相高效液相色谱对多肽进行纯化得到源于中国鲎抗菌肽的抗氧化多肽。
此外，本发明还提供了如上所述的源于中国鲎抗菌肽的抗氧化多肽在制备抗氧化药物、保健品、食品添加剂和抗氧化化妆品的应用。
此外，本发明还提供了一种抗氧化药物，含有如上所述的源于中国鲎抗菌肽的抗氧化多肽。
一种保健品，含有如上所述的源于中国鲎抗菌肽的抗氧化多肽。
一种食品添加剂，含有如上所述的源于中国鲎抗菌肽的抗氧化多肽。
一种抗氧化化妆品，含有如上所述的源于中国鲎抗菌肽的抗氧化多肽。
有益效果：
(1)本发明的源于中国鲎抗菌肽的抗氧化多肽，具有极强的抗氧化活性，极强的清除自由基能力，分子量小，结构简单，易于合成，可以用作抗氧化药物、食品添加剂、抗氧化化妆品，推广价值极高；
(2)本发明的源于中国鲎抗菌肽的抗氧化多肽的制备方法，工艺简单，成本低廉，可大规模生产，极具应用前景。
附图说明
图1为对实施例1步骤(5)制得的粗品多肽进行纯化时的高效液相色谱图；
图2为实施例1制得的抗氧化多肽的质谱图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式做进一步阐述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
一种源于中国鲎抗菌肽的抗氧化多肽的制备方法，其步骤如下：
(1)投Fmoc-Trp(Boc)-王树脂(wang Resin)到多肽合成仪中。
(2)脱保护：以20％哌啶(DMF:六氢吡啶＝4:1)脱去树脂上的Fmoc保护基，反应20分钟，用DMF对树脂进行洗涤，茚三酮检验(Kaiser test)，树脂显蓝色证明Fmoc保护基团已经脱除。
(3)氨基酸缩合：将DIC、HOBT和FMOC-Thr(tBu)-OH加入合成仪，缩合反应40分钟，用DMF对树脂进行洗涤，茚三酮检验(Kaiser test)，树脂无色，证明氨基酸被成功接上，即可以进行下一个氨基酸的接合。重复(2)(3)步骤，按照如下所示的多肽序列依次接合：
Arg-Gly-Pro-Pro-Lys-Cys-Ala-Thr-Tyr-Gly-Gln-Lys-Cys-Arg-Thr-Trp。
(4)在最后一个氨基酸脱保护、茚检完成后，抽干残留液体，用DCM洗涤，洗涤后抽干，抽至树脂呈松散状无结块。
(5)向树脂中加入切割剂三氟乙酸，将多肽从树脂上切割下来，然后用乙醚萃取，冻干得到多肽粗品。
(6)将得到的粗肽用反相高效液相色谱纯化(图1)，通过反相柱Kromasil C18(4.6*250mm,5um)，用含0.1％三氟乙酸的CH3CN/H2O以1mL/min的流速进行梯度洗脱，共洗脱80min，监测214nm处的光吸收，收集主峰，冻干，得到纯化后的抗氧化多肽。最后通过质谱法测定肽的分子量(图2)。
从图1可以看出，提纯的抗氧化多肽，其纯度大于95％，从图2可以得到抗氧化多肽RW-16的相对分子量为1852.14Da。
而后对步骤(6)制得的抗氧化多肽RW-16的抗氧化活性进行测定，测定内容包括DPPH自由基清除能力的测定及超氧自由基(O2 -)清除能力的测定，具体内容如下：
1)DPPH自由基清除能力的测定
多肽用蒸馏水稀释成浓度分别为0.02、0.2和2mg/mL的溶液。用95％乙醇配制DPPH溶液浓度为0.2mmol/L，将2mL多肽样品和2mL DPPH溶液混合均匀，避光条件下28℃恒温水浴30min，反应结束后在517nm处测定其吸光度。对照组为2mL无水乙醇溶液与2mL样液混合液的吸光度，空白组为2mL DPPH溶液与2mL蒸馏水混合液的吸光度，用无水乙醇调零。
其中，As为实验组的吸光度；Ac为对照组的吸光度；Ab为空白组的吸光度。
2)超氧自由基(O2 -)清除能力的测定
将200uL浓度分别为0.02、0.2和2mg/mL的多肽溶液与1.3mL 50mM Tris-HCl(pH8.8)混合，加入100μL1.5mM邻苯三酚(用10mM HCl配制)室温反应10min后加入50μL 8M HCl终止反应，420nm处测吸光度A1，200μL蒸馏水代替样品为空白组A0，100μL HCl代替邻苯三酚为对照组A2。
其测试结果如表1所示；
表1
多肽浓度(mg/mL)
DPPH清除率(％)
O<sub>2</sub><sup>-</sup>清除率(％)
0.02
24.84
50.01
0.2
95.58
52.97
2
95.85
95.07
由表1可以看出，抗氧化多肽RW-16具有极强的抗氧化活性，在样品浓度为2mg/mL时，其对DPPH的清除率高达95.85％，对O2 -的清除率高达95.07％。
对抗氧化多肽RW-16的分子量、等电点、净电荷及不稳定系数进行测试后得到以下结果：分子量为1852.14Da，等电点为9.85，净电荷为4，不稳定系数为1.41。
经验证，本发明的源于中国鲎抗菌肽的抗氧化多肽，具有极强的抗氧化活性，极强的清除自由基能力，分子量小，结构简单，易于合成，可以用作抗氧化药物、食品添加剂、抗氧化化妆品，推广价值极高；制备方法，工艺简单，成本低廉，可大规模生产，极具应用前景。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应该理解，这些仅是举例说明，在不违背本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。
序列表
<110> 上海海洋大学
<120> 一种源于中国鲎抗菌肽的抗氧化多肽、其制备及其应用
<141> 2021-04-29
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Arg Gly Pro Pro Lys Cys Ala Thr Tyr Gly Gln Lys Cys Arg Thr Trp
1 5 10 15
