旋毛虫病的特异性检测抗原及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测
技术领域
，具体涉及一种旋毛虫病的特异性检测抗原及其应用。背景技术
旋毛虫病为一种严重的全球性的人畜共患病，人或反刍动物主要通过误食了被旋毛虫感染的肉而发病，该病为二类动物疫病，每年给畜牧业造成巨大的经济损失。目前，关于旋毛虫的诊断，国际兽医局(OIE)公认的方法为压片镜检法和消化法。然而上述的两种方法在检测时存在着一定的憋端，镜检法费时费力且敏感性较低。消化法虽然在一定程度上可以提高旋毛虫的检出率，但该方法虫体检出率必须为每克肉中含有3条虫以上，才能检出，且此方法在操作时及其繁琐，需消耗大量的人力和物力。免疫学诊断，如ELISA试剂盒法、胶体金等，但从临床应用发现，这些方法检测的准确性不高、方便性不强，无法便于基层工作者操作检测。动物感染旋毛虫时，传统的诊断方法为屠宰时诊断，然而，在屠宰过程中，典型的包囊组织白色针尖大小，不易诊断；血清学诊断包括胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附试验。这些方法通常使用的是排泄分泌物做抗原，假阳性高，制备昂贵且难以进行商品化。
综上所述，现有的对旋毛虫的诊断手段，存在着检测过程繁琐，假阳性高，检测成本高的缺陷，因此，如何提高旋毛虫的免疫诊断，寻找一种可靠的抗原，建立一种高效、准确、特异性好而又简便的诊断技术是亟待解决的技术问题。
发明内容
为此，本发明提供旋毛虫病的特异性检测抗原及其应用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明实施例提供一种蛋白质，如下(a1)或(a2)的蛋白质：
(a1)氨基酸序列如SEQ ID.1所示的蛋白质；
(a2)将(a1)限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且可与绵羊旋毛虫病血清抗体特异性结合的蛋白质。
编码上述所述的蛋白质的核酸分子，也属于本发明保护的范围。
本发明的一个实施例中，所述核酸分子是编码权利要求1所述的蛋白质的基因，所述基因是如下任一所述的DNA分子：
(b1)编码序列如SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述的蛋白质的DNA分子；
(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码权利要求1所述的蛋白的DNA分子。
本发明还提供所述的蛋白质在制备检测绵羊旋毛虫病的免疫层析试纸条中的应用，其中，所述试纸条包括底板、以及位于所述底板上依次固定连接样品垫、结合垫、设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，所述检测线靠近所述结合垫一端，所述质控线靠近所述吸水垫一端，所述检测线处包被有所述的蛋白质；
所述结合垫上包被有微球标记的小鼠IgG抗体和上述所述的蛋白质；
所述质控线处包被有山羊抗小鼠IgG抗体。
本发明的一个实施例中，所述检测抗原为在SEQ.ID.1所示的氨基酸序列的氨基末端添加6个组氨酸的蛋白。
本发明的一个实施例中，所述检测线处抗原蛋白质的包被浓度为2mg/mL。
本发明的一个实施例中，所述结合垫中，小鼠IgG标记浓度为1mg/mL，所述蛋白质的标记浓度为50μg/ml。
本发明的一个实施例中，所述山羊抗小鼠IgG的包被浓度为2mg/mL。
本发明中，putative trypsin(Tsp_00436)抗原经过功能域预测发现该蛋白质为丝氨酸家族的胰蛋白酶，此家族的许多酶是作为不活跃的前体酶被合成的，该蛋白质在参与水解过程被裂解以产生其活性形式，具有催化三联体残基取代的功能；该蛋白具有B细胞抗原表位20个(临界值为0.81)，T细胞抗原表位21个(临界值为21)。亲水性良好，有一个信号肽，有1个跨膜区，为外膜蛋白。且具Ruo Dan Liu等人报道称相关的丝氨酸蛋白酶被认定为早期诊断抗原，而此蛋白为丝氨酸家族的假定蛋白。
本发明时间分辨荧光免疫层析技术结合了免疫标记和免疫层析的特点。以时间分辨荧光微球作为示踪物，制备免疫层析试纸条，这个技术的特点就是能在临床上操作简单、快速诊断、灵敏度高、特异性强、定性准确的检测牛、羊体内感染的旋毛虫的方法。
本发明建立的方法基于双抗原夹心免疫层析法，根据抗原抗体的特异性反应及免疫层析分析技术，检测样本中旋毛虫抗体。在荧光结合垫(玻璃纤维膜)中包被荧光微球标记的重组抗原和小鼠IgG抗体，同时在硝酸纤维膜上的检测线包被重组抗原，质控线包被山羊抗小鼠IgG抗体。检测时，如果样品内含有旋毛虫IgG抗体时，样品中的IgG抗体可以与试纸条前端结合垫中的“荧光-抗原”结合，由于虹吸作用沿层析条侧向流动，在检测区被另一个重组抗原所捕获，形成荧光-抗原-抗体-抗原免疫复合物，利用荧光免疫分析仪，测定复合物中的稀土离子发射的荧光强度。在紫外灯(365nm)投射下，层析试纸条的测试区和控制区域，激发附着的荧光微球偶联物，发射光被聚集并转变为电信号，电信号的强弱和荧光分子数目密切相关，待测样本中被分析物的含量可由荧光分析仪自动分析。
本发明具有如下优点：
本发明旋毛虫病的特异性检测抗原及其应用，首次将检测时间提前至48h，操作简便、敏感性和准确性良好；
本发明建立的检测方法具有良好的特异性，为流行病学调查和疾病的诊断提供了一种快速的诊断方法，可同时检测成虫期、新生幼虫期、肌肉幼虫期不同时期感染旋毛虫的血清，其可用于临床中绵羊旋毛虫病的各个时期的检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例提供的putative trypsin(Tsp_00436)-pET-28a重组表达质粒双酶切验证图，其中，1-NdeI and XhoI酶切putative trypsin(Tsp_00436)-pET-28a重组表达质粒；2-putative trypsin(Tsp_00436)-pET-28a重组表达质粒；
图2为本发明实施例提供的putative trypsin(Tsp_00436)-His重组蛋白质的SDS-PAGE和Western-blot验证；
图3为本发明实施例提供的时间分辨荧光微球层析试纸条的结构示意图，其中，1-PVC底板；2-样品垫；3-结合垫；4-吸水纸；5-硝酸纤维素薄膜；6-检测线T；7-质控线C；
图4为本发明实施例提供的时间分辨荧光微球层析试纸条特异性检测结果，其中，1-绵羊旋毛虫病阳性血清；2-绵羊仰口线虫阳性血清；3-绵羊食道口线虫阳性血清；4-绵羊毛尾线虫阳性血清；
图5为本发明实施例提供的时间分辨荧光微球层析试纸条灵敏度检测结果图，其中，1-4：血清依次按1:400，1:800，1:1600，1:3200，5：样品稀释液；
图6为本发明实施例提供的检测试纸条检测旋毛虫病不同时期血清及阴性血清检测结果图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、putative trypsin(Tsp_00436)重组抗原的制备
本实施例提供putative trypsin(Tsp_00436)重组抗原的制备的制备方法，根据putative trypsin(Tsp_00436)基因序列优化后的putative trypsin(Tsp_00436)重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该蛋白质的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
1、该基因片段由苏州泓迅生物科技股份有限公司上合成了含有相对应目的基因的表达载体putative trypsin(Tsp-00436)双酶切的步骤如下：
(1)将装有目的基因的表达载体冻干粉的离心管3000rpm/常温离心1min。
(2)用50μL无菌ddH2O溶解冻干粉，之后用涡旋仪轻轻混匀，掌上离心机瞬离30s。
(3)用NANODROP测浓度。
(4)表达载体质粒pET-28a用限制性内切酶酶切，酶切系统表见表1。反应条件为37℃/10min。
表1 pET-28a表达质粒双酶切体系
2、重组质粒转化表达感受态
(1)取50μL冰浴完毕的BL21(DE3)放入1.5mL无菌离心管中，置于冰盒中融化(切勿用手搓化)，用移液器吸取5μL pET-28a-putative trypsin(Tsp_00436)表达质粒加入其中，在冰上静置30min。
(2)冰浴后，将离心管置于水浴中，在42℃的热冲击下漂浮45S，然后将管转移到冰中进行冰浴2min。
(3)在无菌超净台中，以220rpm的速度向各离心管中加入400-500μL无菌液体LB培养基，在37℃的摇床中培养1h。
(4)先将对应抗性的LB固体平皿置于37℃预热，待平皿内的水蒸气完全挥发后取出备用。
(5)根据实验需求，吸取适量转化之后的感受态细胞，呈散点似的滴加在预热好的平皿中，均匀涂布感受态细胞，放入37℃培养箱。
(6)在37℃恒温培养箱中过夜培养。
3、His标签重组蛋白质的小量诱导表达
(1)用无菌白枪头挑取转化后BL21(DE3)的单个菌落，PCR鉴定正确后，接种于10mL含有相应抗性的液体LB培养基，200rpm/37℃恒温培养箱，过夜培养。
(2)次日，在无菌操作台中保菌后，用移液器吸取100μL的菌液接种于10mL含有相对抗性的液体LB培养基中，37℃200rpm条件下培养，当菌液OD600nm＝0.6-0.8时，可加入IPTG诱导。
(3)加蛋白诱导剂前，在无菌操作台中，吸100μL未诱导全菌，作为阴性对照。之后，加入0.1M IPTG诱导剂，使IPTG终浓度为0.1mM、0.2mM、0.5mM，在不同的温度进行诱导(16℃、32℃、37℃)。
(4)集取16℃低温培养16h、32℃低温培养8h、37℃恒温培养5h的菌液，收集好的菌液置于15mL除酶管中，在4℃离心机4000rpm离心15min，弃掉上清，菌体沉淀用1mL磷酸盐缓冲液重悬后，取60μL菌液作为诱导后全菌样品，余下的菌液用小型超声破碎仪破碎，仪器的破碎功率为28w，超声2s，停歇3s，观察菌体清澈即可(部分菌液在破碎时，清澈度越来越低，可能该蛋白为包涵体，属正常现象)，破碎后的菌液置于1.5mL EP管中，在4℃离心机中5000rpm离心10min，取60μL上清(诱导后上清)后，弃掉上清，沉淀用1mL磷酸盐缓冲液重悬后，取60μL作为诱导后沉淀。
(5)将不同温度和不同IPTG浓度下的上清、沉淀、全菌，分别加入20μL 1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，在100℃沸水中煮10min后，取出备用。
(6)将制备好的不同温度和不同IPTG浓度的全菌、上清、沉淀的蛋白样品，各取10μL(同一温度不同的IPTG浓度的蛋白样品依次上样，以便后续观察)加样于10％SDS-PAGE蛋白胶电泳中，蛋白电泳槽的设置功率为：电压150V，时间55min。
(7)将切好的蛋白胶放入预先倒入G250-考马斯亮蓝染色液的蛋白染色盒中，在水平摇床上摇晃70min。
(8)将染色完毕的蛋白胶，放入脱色液中，过夜脱色后，用照胶仪观察重组蛋白的表达情况，同时确定转入表达感受态目的基因是否表达、表达量以及表达形式为可溶性存在于上清中还是包涵体存在于沉淀中。
本步骤中确定的蛋白诱导表达的最佳条件为：诱导温度37℃，IPTG浓度为0.2mM。
4、His标签包涵体重组蛋白质的大量表达与纯化
(1)预先从-20℃冰箱取出带有His标签重组蛋白质的菌液，放入4℃冰箱中，待菌液完全融化后，在无菌超净台中，用接种环挑取适量菌液，在Kana抗性培养板采取交叉划线法快速划线后，将培养皿放于37℃恒温培养箱，培养10h。
(2)次日取出培养皿，用白枪头挑取形态圆润的1-2mm的单菌落，接种于20mL Kana抗性的液体LB培养基中，37℃恒温摇床中200rpm，过夜培养。
(3)在无菌操作台中，吸取5mL过夜培养的菌液，加入500mL含有Kana抗性的液体LB培养基中，37℃恒温摇床，200rpm摇3h后，测量菌液的OD值。
(4)若分光光度计的OD值为0.6-0.8之间，证明该菌液以达到生长曲线的峰值，根据该蛋白在小量诱导表达时优化完毕的条件，进行培养。
(5)将摇好的菌液从锥形瓶中分到若干个无菌50mL离心管中，在低温离心机中，4000rpm离心15min，将上清弃到废液缸中，每管再加入5mL PBS将沉淀用涡旋器重悬，集入到两个无菌50mL离心管中，同样条件下再次离心，最后用每管菌液再加入25mL PBS重悬洗涤后，在4℃离心机中4000rpm离心20min后，弃掉上清。
(6)提前半小时将冷却机设置为4℃预冷，启动高压破碎仪，等待气压缓冲完毕后，用75％酒精、ddH2O、His Binding Buffer依次通过破碎管，3遍后，排气、排废液。
(7)根据菌体沉淀量，加入适量的PBS，用涡旋器将菌体沉淀完全重悬，倒入高压破碎管中反复破碎3-4次后，用超高速4℃离心机，12000rpm离心13min，留取沉淀备用。
(8)将沉淀用100μL的ddH2O混匀，加入10mL含6M-8M尿素Binding Buffer混匀放圆形旋转仪室温过夜感作。
(9)第二天，在4℃离心机中以12000rpm的转速对所感测到的破碎细菌液体离心13min，并保留上清液以备后用。
(10)将空纯化柱，先用6M-8M尿素His Binding Buffer润洗两遍，留有少量的HisBinding Buffer，根据上清液的量，吸取适量的Ni-Agarose Resin，缓缓加入纯化柱中，待Ni-珠子完全下沉到底部时，打开底部开关，排出废液后，在使用适量的His BindingBuffer过柱洗涤填料。
(11)将步骤(9)收集的上清加入处理完毕后的Ni-Agarose Resin填料中，置于水平旋转仪上，在室温中，缓慢感作3h。
(12)将结合完毕后的上清与Ni-Agarose Resin的混合物倒入纯化柱中，待Ni-Agarose Resin完全沉淀后，打开底部开关，调整流速，待Ni-Agarose Resin完全在纯化柱内时，过柱完毕。
(13)第一次摸索His重组蛋白纯化的条件时，先用从低到高浓度的咪唑洗脱：6M-8M尿素bingding buffer、10、20、40、60、80、100、250、500mM，每次3mL依次洗脱并用2mL无菌离心管收集，暂时储存在冰盒内。确定最佳洗脱浓度为250mM。
(14)将不同梯度的咪唑洗脱下来的蛋白、过柱液、以及最后一遍洗脱后的Ni-Agarose Resin，分别制取样品，进行蛋白凝胶电泳，用蛋白照胶仪观测目的条带后，决定该蛋白的洗杂和洗脱浓度。
5、His标签包涵体重组蛋白质的透析和浓缩
(1)观察SDS-PAGE蛋白胶，根据条带的粗细与纯度，确定目的蛋白质的体积，用浓缩仪，1500rpm，30min离心浓缩备用。
(2)先将透析袋的一端，折两小折，在用蛋白透析夹子将一端夹住，将目的蛋白质沿着透析袋的边缘缓缓加入，再将另一端透析袋折两小折，夹紧，进行梯度透析：
a.将夹在透析袋中间的蛋白质在含有6M尿素和0.5M精氨酸的3L PBS中透析过夜。
b.次日，观察透析后的蛋白是否有絮状物，若有絮状物，终止透析，若无絮状物，将夹住的靶蛋白置于含4M尿素和0.5M精氨酸的2L PBS中，透析4h，每1.5h观察透析袋中是否有絮状物。
c.若无絮状物，将夹好的蛋白质放入含有2M尿素、0.5M精氨酸的2LPBS中，透析4h，每隔1.5h观察透析袋内是否有絮状物。
d.若无絮状物，将夹住的蛋白质置于含0.5M精氨酸的3L PBS中，透析4h，每1.5h观察一次透析袋中是否有絮状物。
(3)将透析完毕的目的蛋白，转移至2mL无菌离心管中，放置于冰盒中，用Nanodrop测其浓度后，再根据SDS-PAGE观察目的蛋白的条带，决定是否要浓缩蛋白质。
(4)变性好的目的蛋白质，分装到无菌200μL离心管中，置于-80℃存储，最好是立即使用。
6、His标签包涵体重组蛋白质的Western-blot鉴定
(1)SDS-PAGE跑胶参照步骤三。
(2)根据蛋白胶的大小，裁剪适当大小的PVDF膜，并用甲醇激活1min，将定性滤纸(3层为一个)剪成合适大小，浸泡在转膜液中，赶出滤纸与滤纸间的气泡，转膜时，夹子的黑面水平放在下面，上面依次为吸水网-3层定性滤纸-蛋白胶-PVDF膜-层定性滤纸-吸水网，确保无气泡后，将夹子合上，放入转膜槽内，并且夹子的黑面对转膜槽的黑面，夹子的透明面对转膜槽的红面，检查好正负极，开始转膜，设置的功率为：电流175mA，时间为86min。
(3)转膜后，将PVDF膜放入提前配制完毕的含有封闭液(5％脱脂奶)的塑料盒中，放入37℃培养箱中，摇床上摇动封闭1h。
(4)用含His-tag单克隆抗体(1:5000)的5％脱脂乳封闭，4℃孵育过夜。
(5)PBST洗膜，每次10min，洗4次。
(6)AP山羊抗小鼠IgG 1:5，000PBST稀释，37℃孵育60min。
(7)重复步骤(5)。
(8)配取适量的BCIP/NET显色试剂，进行避光显色2-3min，观察结果并扫描。
结果与分析，重组质粒双酶切验证
由苏州泓迅生物科技股份有限公司分别合成构建了目的基因的表达载体pET-28a。并合成目的基因putative trypsin(Tsp_00436)重组表达质粒，目的基因为1275bp，用NdeI and XhoI限制性内切酶酶切后鉴定，其双酶切验证结果如图1所示。
纯化后的蛋白质经SDS-PAGE和免疫印迹验证，和预期蛋白大小相同，其重组蛋白质大小为55KDa，如图2所示。
实施例2、旋毛虫病时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备
如图3所示，本实施例提供了一种旋毛虫病时间分辨荧光免疫层析试纸，该时间分辨荧光免疫层析试纸条包括样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素薄膜5(NC膜、层析膜)和吸水纸4和PVC底板1。PVC底板1上的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜5、吸水纸4。其中，硝酸纤维素膜5的一端与结合垫3一端叠压，硝酸纤维薄膜5的另一端与吸水纸4的一端叠压，样品垫2的一端与结合垫3的另一端叠压；结合垫3上包被有荧光微球标记的山羊抗牛IgG抗体，硝酸纤维素薄膜5上靠近结合垫一侧设检测线6，靠近吸水纸4的设有质控线7，
样品垫2中有加样孔，结合垫3中包被有时间分辨荧光微球标记的putativetrypsin(Tsp_00436)重组抗原和小鼠IgG，硝酸纤维素薄膜5的检测线6有putativetrypsin(Tsp_00436)重组抗原，质控线7上包被有山羊抗小鼠IgG，山羊抗小鼠IgG的包被浓度为2mg/mL。
本实施例为了提高绵羊旋毛虫病时间分辨荧光免疫层析试纸条检测时的准确性，进行了如下实验：优化时间分辨荧微球免疫层析试纸条的条件：其他条件不变，每次只改变其中一个变量。
反应条件为：阳性样本和阴性样本的加样量均为75μL(血清与稀释液的比例为1:2)，其反应时间均为15min。其包被参数为0.75μL/cm喷洒参数在NC膜上进行抗原或者抗体的包被，形成检测线6(T)和质控线(C)。
1、包被抗原的确定
将检测线6上，putative trypsin(Tsp_00436)重组抗原包被浓度分别1.0mg/ml，2.0mg/ml，3.0mg/ml工作浓度进行，C线山羊抗小鼠IgG以2.0mg/ml浓度包被。放入温度45±1℃湿度≤35％烘箱烘干16h。搭配荧光垫和样品垫，制备小样。在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，已确定最佳的包被抗原浓度。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表1，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。当putative trypsin(Tsp_00436)重组抗原浓度为2.0mg/ml时，是最适包被量。
表1包被抗原浓度的检测结果
2、标记抗原浓度的确定
取100μL荧光微球加入适量的EDC，放置于涡旋振荡仪振荡混匀后，室温孵育30min。所需用量的重组抗原或鼠IgG，用0.01M磷酸盐缓冲液定容至500μL，混合均匀后加入处理好的荧光微球中，立即振荡混均，置于旋转混合仪，室温避光孵育1h。上述反应完成后，加入2％BSA，置于旋转混合仪，室温避光孵育1h。12000rpm离心20min。去除上清，得到的浓缩的标记的重组抗原或标记的鼠IgG，加入适量的荧光微球工作液，放入4℃密封避光保存。
以相同上述标记方法，用处理好的荧光微球分别标记不同量的putative trypsin(Tsp_00436)抗原，标记量分别为：25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml。以同以4倍的稀释浓度对其稀释制备小样，搭配包被片材和样品垫，喷涂在结合垫中，放入温度45±1℃湿度≤35％烘箱烘干8h备用，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最佳的标记抗原浓度。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表2，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现当标记抗原putative trypsin(Tsp_00436)浓度为50μg/ml时，是最适的结合垫标记浓度。
表2标记抗原浓度的检测结果
3、荧光标记溶液稀释比例的确定
将标记好的荧光微球分别作2倍、4倍、8倍，3种稀释度稀释。制备小样，搭配包被片材和样品垫，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最佳的荧光标记溶液稀释比例。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表3，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。当荧光标记溶液稀释比例为4倍时，为最佳的荧光标记溶液最适稀释比例。
表3荧光标记溶液稀释比例的检测结果
4、荧光工作液的确定
按确定的荧光标记溶液稀释比例，选取合适的荧光微球悬浮液，其分为三组：第一组为：0.05MTris-HCl、0.9％NaCl、0.05％BSA、0.05％Tween20，调至pH＝7.9；第二组为：0.02MTris-HCl、0.4％BSA，调至pH＝7.5；第三组为：0.1MTris-HCl、0.1％BSA(5mL)、10％S9、10％Tween 20、10％PEG12000、3g海藻糖。制备小样，搭配包被片材和样品垫，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的荧光工作液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表4，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现使用第二组荧光工作液时，为最佳的荧光工作液。
表4荧光工作液检测结果
5、样品垫处理液的确定
为了是使样品中的抗体能更好的与结合垫中荧光微球标记的抗原结合，配制了三种样品垫处理液，分为三组。第一组为：1％BSA、0.1％Triton-100的、0.02mol/L的pH 7.4的磷酸盐缓冲液；第二组为：0.1MNa2B4O7·10H2O、1％PVP、0.2％Casein-Na、1％Triton-X100、1％Tetronic1307、0.2％NaN3，调至pH＝9.3；第三组为：0.5M硼酸缓冲液、1％TritonX-100、1％PVP、2％NaCl，调至pH＝9.0。制备小样，搭配包被片材和荧光垫，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的样品垫处理液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表5，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现使用第二组样品垫处理液时，为最佳的样品垫处理液。
表5样品垫处理液检测结果
6、反应时间的确定
用移液器吸取75μL样本加入到150μL样本缓冲液内，充分混匀30s-1min，用移液器吸取75μL混合后的样本，滴加到检测卡的加样孔内，待反应10min，15min，20min后分别进行读数。在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，已确定最佳反应时间。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表6，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。层析试纸条最佳反应时间为15min。
表6反应时间的检测结果
7、样品缓冲液的确定
为了确保抗原抗体充分反应，摸索了三种样品稀释液，分成三组，分别为：第一组：pH＝7.8的0.02MTris-HCl、0.9％NaCl、0.1％BSA、0.5％Tween-20、0.1％NaN3；第二组：pH＝7.8的0.05MTris-HCl、0.9％NaCl、1.5％BSA、0.01％Tween-20、0.1％NaN3；第三组：pH＝7.8的PBS缓冲液。在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的样品稀释液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表7，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。第二组样品缓冲液为最佳的样品稀释液。
表7样品缓冲液的检测结果
8、样品稀释比例的确定
样本与样品缓冲液，分别按照下表8的比例，进行混合，混合后的样本，滴加至检测卡加样孔中，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的样本稀释比例。
表8样本与样品缓冲液稀释比例
结果见表9，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。最适的稀释比例为1:2(样品体积:样品缓冲液)
表9样品稀释液的检测结果
本实施例制备的旋毛虫病时间分辨荧光免疫层析试纸条中，putative trypsin(Tsp_00436)重组抗原的包被浓度为2.0mg/ml，标记抗原的putative trypsin(Tsp_00436)浓度为50μg/ml，荧光标记溶液稀释比例为4倍，荧光微球悬浮液为：0.1MTris-HCl、0.1％BSA(5mL)、10％S9、10％Tween20、10％PEG12000、3g海藻糖。层析试纸条最佳反应时间为15min。样品稀释液为pH＝7.8的0.05MTris-HCl、0.9％NaCl、1.5％BSA、0.01％Tween-20、0.1％NaN3；样品体积:样品缓冲液体积最适的稀释比例为1:2。
实施例3、时间分辨荧光微球层析试纸条特异性
对绵羊旋毛虫阳性血清、绵羊仰口线虫阳性血清、绵羊食道口线虫阳性血清、绵羊毛尾线虫阳性血清样本进行检测，除绵羊旋毛虫的阳性血清外，在荧光免疫分析仪下，其他非绵羊旋毛虫病原体的血清在T线均没有检测到信号，只有C线有出现一条带，即为阴性，结果如图4。
实施例4、时间分辨荧光微球层析试纸条灵敏度
阳性血清倍比稀释后，分别将稀释好的样本滴加到样品垫中，15min后在荧光免疫层析下观测T线的荧光强度。结果显示当阳性血清稀释比例为1:800时，可以清晰的看见T、C线，当阳性血清稀释比例为1:3200时，T线的亮度很微弱，但C线依旧亮度明显，证明检测结果有效。结果如图5。
如图6所示，利用实施例2制备的检测试纸条检测旋毛虫病不同时期血清及阴性血清检测结果图。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 沈阳农业大学
<120> 旋毛虫病的特异性检测抗原及其应用
<130> GG21928940A
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Met Ile Arg Arg Leu Phe Gln Tyr Thr Ser Met Thr Phe Ala Trp Ile
1 5 10 15
Leu Leu Phe Leu Ser Ala Ala Ser Pro Ser Leu Gly Glu Phe Glu Cys
20 25 30
Gly Val Pro His Phe Lys Pro Tyr Ile Trp Lys Ser Gly Arg Ile Val
35 40 45
Gly Gly Thr Asp Val Arg Pro His Ser His Pro Trp Gln Ile Gln Leu
50 55 60
Leu Lys Ser Glu Thr Gly Gly Tyr Ser Ser Leu Cys Gly Gly Ser Leu
65 70 75 80
Val His Phe Gly Glu Pro Ser Asn Gly Thr Arg Phe Val Leu Thr Ala
85 90 95
Ala His Cys Ile Thr Thr Ser Asn Met Tyr Pro Arg Thr Ser Arg Phe
100 105 110
Thr Val Val Thr Gly Ala His Asn Ile Lys Met His Glu Lys Glu Lys
115 120 125
Lys Arg Ile Pro Ile Thr Ser Tyr Tyr Val Gln His Trp Asn Pro Val
130 135 140
Met Thr Thr Asn Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu Ala Glu Thr Val Tyr
145 150 155 160
Tyr Asn Lys Tyr Thr Arg Pro Val Cys Leu Pro Glu Pro Asn Glu Glu
165 170 175
Leu Thr Pro Gly Asp Ile Cys Val Val Thr Gly Trp Gly Asp Thr Thr
180 185 190
Glu Asn Gly Thr Thr Ser Asn Thr Leu Lys Gln Val Asp Val Lys Ile
195 200 205
Met Lys Lys Gly Thr Cys Ala Asn Val Arg Ser Glu Val Ile Thr Phe
210 215 220
Cys Ala Gly Ala Met Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser
225 230 235 240
Gly Gly Pro Leu Ile Cys Lys Lys Asn Gly Lys Ser Val Gln Phe Gly
245 250 255
Val Val Ser Tyr Gly Thr Gly Cys Ala Arg Lys Gly Tyr Pro Gly Val
260 265 270
Tyr Ala Lys Val Pro Ser Tyr Val Thr Trp Leu Asn Lys Ala Ala Lys
275 280 285
Glu Leu Glu Asn Ser Pro Glu Gly Thr Val Lys Trp Ala Ser Lys Glu
290 295 300
Asp Ser Pro Val Asp Leu Ser Thr Thr Ser Arg Pro Thr Asn Pro Tyr
305 310 315 320
Thr Gly Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr
325 330 335
Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro
340 345 350
Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Gln Asp Gln His Leu His Leu Val Asp Gln
355 360 365
Asp Pro His Ile His Leu Val Asp Gln Asp Gln His Ile His Ile Leu
370 375 380
Asp Gln Asp Leu Leu Leu Lys Ser Gln Tyr Phe His His Thr Lys Asn
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Ile Arg Gln Gln Phe Lys Asn Thr Leu Ile Val Tyr Gln Ala Glu Arg
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420 425 430
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435 440 445
<210> 2
<211> 1263
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tttgaatgcg gtgtgccaca ttttaaaccc tacatatgga aatctggtcg aattgttggt 60
ggaactgacg tacgaccaca ctcacatcca tggcagattc aattgttaaa gtcagaaacg 120
ggaggctaca gcagcttgtg cggtggtagt cttgttcatt tcggtgaacc ctcaaatggt 180
actcgattcg tacttaccgc cgcgcactgc ataactacta gcaatatgta tccaagaacg 240
tcaagattta cagttgtgac cggtgcccac aacatcaaaa tgcatgaaaa agaaaaaaag 300
cgcataccaa ttacttccta ttatgttcag cactggaacc ctgtgatgac aacaaacgac 360
attgcgttgc ttcgcctggc agaaactgtt tattataata aatatactag gcctgtctgt 420
ttgccagaac caaatgaaga attgactcct ggagatattt gcgttgtcac cggatggggt 480
gatacgactg aaaatggaac tacttctaat actttgaagc aagttgatgt caaaattatg 540
aagaaaggaa cttgtgcaaa tgtgagaagt gaagttatta ctttttgcgc tggagctatg 600
gagggtggta aagacagttg tcaaggtgat tctggtggcc cactgatatg caagaaaaat 660
gggaaaagtg ttcaattcgg tgtcgttagt tatggtactg gatgcgccag aaaaggttat 720
cccggagtgt atgccaaagt tccatcatat gtcacatggt taaataaagc tgcaaaagaa 780
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ctacaacaac atattatcac ttttctaagt aaaaatatta tgattaattc actactgctc 1260
tga 1263
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