一种索马鲁肽的固相合成方法
技术领域
本发明属于多肽合成
技术领域
，具体涉及了一种索马鲁肽固相合成的方法。背景技术
糖尿病是一组由多病因引起的以慢性高血糖为特征的终身性代谢性疾病。根据国际糖尿病联盟(IDF)最新版数据显示，全球成人糖尿病患者数量达4.25亿，其中II型糖尿病占90％。长期血糖增高，大血管、微血管受损并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等，据世界卫生组织统计，糖尿病并发症高达100多种，是目前已知并发症最多的一种疾病。糖尿病死亡者有一半以上是心脑血管所致，10％是肾病变所致。临床数据显示，糖尿病发病后10年左右，将有30％～40％的患者至少会发生一种并发症，且并发症一旦产生，药物治疗很难逆转，因此强调尽早预防糖尿病并发症。
目前常用的降糖药物主要有胰岛素及其类似物、GLP-1受体激动剂、DDP-4酶抑制剂、二甲双胍类等多个类型品种。其中于2017年12月6日获得美国FDA批准上市的索马鲁肽，其在降糖、减肥领域的巨大优势，同时索马鲁肽也是继恩格列净、利拉鲁肽之后，第三个显示具有心血管获益的降糖药。索马鲁肽为GLP-1类似物，与人GLP-1有94％同源性。索马鲁肽在第8位修改为α-氨基异丁酸，用来增加稳定作用，避免被DPP-4酶降解。此外，通过结构修饰，把肽链第26位的赖氨酸位置连接上18碳脂肪二酸侧链，相比C16的利拉鲁肽，增长的碳链对白蛋白的亲和力增强5～6倍，与白蛋白结合，避免快速被肾脏清除并防止代谢性降解，延长体内半衰期。在安全性方面索马鲁肽跟利拉鲁肽、度拉糖肽类似，不良反应可随时间消失。2019年3月20日，诺和诺德宣布向FDA提交了口服索马鲁肽的两项新药上市申请(NDA)。索马鲁肽将是未来数年诺和诺德的业务支柱和增长驱动，有分析师预测其销售峰值有望超过100亿美元。索马鲁肽的结构式如下：
现有技术中26位K常用的侧链保护基有Mtt和Alloc，脱除Mtt的时候酸性条件难免对其他侧链保护基比如Trt，Boc有影响，且在放大过程中很难保证完全脱除；多次酸处理的话也会导致多肽从2-CTC树脂上裂解脱落；与此同时，Alloc保护基脱除的问题之一就是样品可能会被染色和金属残留的问题，使得样品的性状较差；此外，在Alloc脱除过程中，如果Alloc的捕获剂捕获不到位，会使MS大40，后续氨基酸没法偶联。两种方法，都会导致收率和纯度不高。
索马鲁肽序列中疏水性氨基酸的存在使得肽链之间的氢键更稳定，产生严重的β折叠，肽链与肽链之间的作用力增强，导致树脂缩聚，降低了偶联的反应活性和效率。目前，有专利中提到使用Ser-Thr伪脯二肽、Ser-Ser以二肽片段的形式偶联来提高偶联的效率。此外，还有使用在(Gly10-Thr11)、(Phe12-Thr13)、(Thr13-Ser14)、(Val16-Ser17)和(Ser17-Ser18)五个位置中的一个用O-异酰化二肽进行偶联，之后进行O→N转移反应，就可以得到粗肽索马鲁肽，但是在此过程中比较容易发生消旋的问题。
因此，在本领域仍需要开发一种简便、高效的索马鲁肽制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、高效的索马鲁肽制备方法，解决目前索马鲁肽制备工艺繁琐、效率低或纯化难度高的问题。本发明的目的可以通过以下技术方案实现。
本发明提供了一种索马鲁肽的制备方法，其特征在于，通过固相合成制备索马鲁肽，其中Ala24-Ala25的偶联使用Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH为原料。
在本发明的一些实施方案中，所述固相合成方法是按照索马鲁肽的序列从C端到N端的顺序依次偶联各氨基酸得到索马鲁肽主链-树脂。在本发明的一些实施方案中，Lys26的偶联使用Fmoc-Lys(Ivdde)-OH为原料，His7的偶联使用Boc-His(Trt)-OH为原料。
在本发明的一些实施方案中，所述制备方法进一步包括脱除索马鲁肽主链中Lys26的侧链保护基Ivdde，然后在Lys26上偶联索马鲁肽的侧链，得到索马鲁肽-树脂。
本发明还提供了一种索马鲁肽的制备方法，其包括如下步骤：
步骤1：将Gly与固相载体树脂偶联，获得Fmoc-Gly-树脂；
步骤2：使用步骤1中得到的Fmoc-Gly-树脂，按照索马鲁肽序列从C端到N端的顺序依次偶联其余氨基酸，得到索马鲁肽主链-树脂，
其中Ala24-Ala25的偶联使用Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH为原料；
步骤3：脱除索马鲁肽主链中Lys26的侧链保护基，然后在Lys26上偶联索马鲁肽的侧链，得到索马鲁肽-树脂；和
步骤4：将步骤3中得到的索马鲁肽-树脂裂解，纯化即得索马鲁肽。
在本发明的一些实施方案中，步骤1中的树脂为Wang树脂或2-CTC树脂。在本发明的一些实施方案中，偶联Gly的Wang树脂或2-CTC树脂的取代度为0.15-0.30mmol/g。在一个具体实施方案中，步骤1中偶联Gly的树脂为取代度为0.20mmol/g的2-CTC树脂。在另一个具体实施方案中，步骤1中偶联Gly的树脂为取代度为0.25mmol/g的Wang树脂。
在本发明的一些实施方案中，Lys26的偶联使用Fmoc-Lys(Ivdde)-OH为原料，His7的偶联使用Boc-His(Trt)-OH为原料。在一些实施方案中，氨基酸原料的投料当量为2-4当量，反应浓度为0.10-0.40mmol/mL。在一个具体实施方案中，氨基酸原料投料当量为3当量，反应浓度为0.15mmol/mL或0.30mmol/mL。在一个具体实施方案中，氨基酸原料投料当量为3当量，反应浓度为0.15mmol/mL。在一个具体实施方案中，氨基酸原料投料当量为3当量，反应浓度为0.30mmol/mL。
在本发明的一些实施方案中，偶联Arg36时使用HATU/DIEA或DIC/HOBt作为缩合试剂。在一个具体实施方案中，偶联Arg36时使用DIC/HOBt作为缩合试剂。在另一个实施方案中，偶联Arg36时使用HATU/DIEA作为缩合试剂。
在本发明的一些实施方案中，偶联除Arg36的其它氨基酸时，可以使用的缩合试剂为DIC/HOBt、HATU/HOBT/DIEA、HBTU/HOBT/DIEA和PyBOP/HOBT/DIEA中的一种或两种，溶剂可以为DMF、DCM和NMP中的一种或两种的混合物。优选地，使用的缩合试剂为DIC/HOBt，溶剂为DMF。
在本发明的一些实施方案中，Wang树脂与第一个氨基酸偶联时可以加入DMAP催化反应，时间优选为1.5h-2h，其中，DMAP的加入量可以由本领域技术人员常规确定，例如为氨基酸原料摩尔数的1/10。
在本发明的一些实施方案中，Lys26、Ala24-Ala25、His7和Gln23中的任意一种或更多种的偶联如下进行：使用缩合试剂DIC/HOBt偶联20-60min，溶剂为DMF，之后抽滤，用DMF洗涤树脂之后使用缩合试剂HATU/HOBT/DIEA再次偶联20-60min，溶剂为体积比为3:1-5:1的DMF:DCM。在一个优选地实施方案中，Lys26、Ala24-Ala25、His7和Gln23中的任意一种或更多种的偶联如下进行：使用缩合试剂DIC/HOBt偶联40min，溶剂为DMF，之后抽滤，用DMF洗涤树脂之后使用缩合试剂HATU/HOBT/DIEA再次偶联40min，溶剂为体积比为4:1的DMF:DCM。
在本发明的一些实施方案中，偶联Lys26时，使用Fmoc-Lys(Ivdde)-OH为原料，使用的缩合试剂为DIC/HOBt、HATU/HOBT/DIEA、HBTU/HOBT/DIEA和PyBOP/HOBT/DIEA中的两种，溶剂为DMF、DCM和NMP中的一种或两种的混合物；具体地，Fmoc-Lys(Ivdde)-OH的偶联如下进行：使用缩合试剂DIC/HOBt偶联20-60min，溶剂为DMF，之后抽滤，用DMF洗涤树脂之后使用缩合试剂HATU/HOBT/DIEA再次偶联20-60min，溶剂为体积比为3:1-5:1的DMF:DCM。优选地，Fmoc-Lys(Ivdde)-OH的偶联如下进行：使用缩合试剂DIC/HOBt偶联40min，溶剂为DMF，之后抽滤，用DMF洗涤树脂之后使用缩合试剂HATU/HOBT/DIEA再次偶联40min，溶剂为体积比为4:1的DMF:DCM。
在本发明的一些实施方案中，偶联His7时，使用Boc-His(Trt)-OH为原料，使用的缩合试剂为DIC/HOBt、HATU/HOBT/DIEA、HBTU/HOBT/DIEA和PyBOP/HOBT/DIEA中的两种，溶剂为DMF、DCM和NMP中的一种或两种的混合物；具体地，Boc-His(Trt)-OH的偶联如下进行：使用缩合试剂DIC/HOBt偶联20-60min，溶剂为DMF，之后抽滤，用DMF洗涤树脂之后使用缩合试剂HATU/HOBT/DIEA再次偶联20-60min，溶剂为体积比为3:1-5:1的DMF:DCM。优选地，Boc-His(Trt)-OH的偶联如下进行：使用缩合试剂DIC/HOBt偶联40min，溶剂为DMF，之后抽滤，用DMF洗涤树脂之后使用缩合试剂HATU/HOBT/DIEA再次偶联40min，溶剂为体积比为4:1的DMF:DCM。
在本发明的一些实施方案中，偶联Ala24-Ala25时使用Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH为原料，可以有效避免多肽的聚集和缺失肽的产生，提高样品的纯度。在本发明的一些实施方案中，偶联Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH使用的缩合试剂为DIC/HOBt、HATU/HOBT/DIEA、HBTU/HOBT/DIEA和PyBOP/HOBT/DIEA中的两种，溶剂为DMF、DCM和NMP中的一种或两种的混合物；具体地，Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH的偶联如下进行：使用缩合试剂DIC/HOBt偶联20-60min，溶剂为DMF，之后抽滤，用DMF洗涤树脂之后使用缩合试剂HATU/HOBT/DIEA再次偶联20-60min，溶剂为体积比为3:1-5:1的DMF:DCM。优选地，Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH的偶联如下进行：使用缩合试剂DIC/HOBt偶联40min，溶剂为DMF，之后抽滤，用DMF洗涤树脂之后使用缩合试剂HATU/HOBT/DIEA再次偶联40min，溶剂为体积比为4:1的DMF:DCM。
在本发明的一些实施方案中，偶联Gln23使用的缩合试剂为DIC/HOBt、HATU/HOBT/DIEA、HBTU/HOBT/DIEA和PyBOP/HOBT/DIEA中的两种，溶剂为DMF、DCM和NMP中的一种或两种的混合物；具体地，Gln23的偶联如下进行：使用缩合试剂DIC/HOBt偶联20-60min，溶剂为DMF，之后抽滤，用DMF洗涤树脂之后使用缩合试剂HATU/HOBT/DIEA再次偶联20-60min，溶剂为体积比为3:1-5:1的DMF:DCM。优选地，步骤2中Gln23的偶联如下进行：使用缩合试剂DIC/HOBt偶联40min，溶剂为DMF，之后抽滤，用DMF洗涤树脂之后使用缩合试剂HATU/HOBT/DIEA再次偶联40min，溶剂为体积比为4:1的DMF:DCM。
在本发明的一些实施方案中，Lys26的侧链保护基Ivdde使用2％水合肼/DMF进行脱除，脱除3-6次，每次5-30min，基本无副反应发生。在本发明的一些实施方案中，Lys26的侧链保护基Ivdde使用2％水合肼/DMF进行脱除，脱除4次，每次10min，基本无副反应发生；优选地，可以取检测量的树脂进行裂解，通过MS检测无amu+206.26后再进行下一步反应。
在本发明的一些实施方案中，在脱除侧链保护基的Lys26上依次偶联Fmoc-NH-PEG2-CH2COOH、Fmoc-NH-PEG2-CH2COOH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯，其中偶联Fmoc-NH-PEG2-CH2COOH、Fmoc-NH-PEG2-CH2COOH和Fmoc-Glu(OH)-OtBu使用的缩合试剂独立地为HATU/HOBT/DIEA、HBTU/HOBT/DIEA和PyBOP/HOBT/DIEA中的一种，溶剂为DMF；偶联十八烷二酸单叔丁酯使用的缩合试剂为DIC，溶剂为体积比为1:1-2:1的DMF:DCM。优选地，其中偶联Fmoc-NH-PEG2-CH2COOH、Fmoc-NH-PEG2-CH2COOH和Fmoc-Glu(OH)-OtBu使用的缩合试剂HATU/HOBT/DIEA，溶剂为DMF；偶联十八烷二酸单叔丁酯使用的缩合试剂为DIC，溶剂为体积比为1:1的DMF:DCM。本发明的一些实施方案中，Fmoc-NH-PEG2-CH2COOH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯原料的投料当量为3当量，反应浓度均为0.3mmol/mL。
在本发明的一些实施方案中，偶联多肽的树脂裂解前用DCM或者甲醇抽干。
在本发明的一些实施方案中，用于将合成的索马鲁肽从固相合成载体上裂解下来的裂解试剂是TFA、苯甲硫醚、苯酚、EDT和水的混合物，优选地，TFA、苯甲硫醚、苯酚、EDT和水的体积比为85～90:2.5～7.5:1～4:2.5～7.5，更优选地，TFA、苯甲硫醚、苯酚、EDT和水的体积比为87.5:5:2.5:5。
在固相合成索马鲁肽的过程中，连续2个疏水Ala(即Ala24-Ala25)之后的Gln23有可能丢失。因此，在本发明的一些优选实施方案中，在Gln23偶联之后，可以取检测量的树脂脱除Fmoc之后裂解，质谱检测确保Gln23接上后再进行下一步。
索马鲁肽盐与索马鲁肽相比更稳定，在自然条件下不易发生分解、氧化、变性等现象，便于贮存和使用。因此，本发明还提供了一种索马鲁肽盐的制备方法，其包括如下步骤：
步骤1：根据本发明所述的方法制得索马鲁肽；和
步骤2：对步骤1中制得的索马鲁肽进行转盐，即得索马鲁肽盐。
本发明的一些实施方案中，步骤2中溶解步骤1制得的索马鲁肽的溶剂为水和乙腈，优选地，所述水和乙腈的体积比约为3:1。
在本发明的一些实施例中，在索马鲁肽转盐生成索马鲁肽盐后，对索马鲁肽盐进行冷冻干燥。本发明的一些优选实施方案中，所述索马鲁肽盐为索马鲁肽TFA盐。
本发明还提供了一种化合物，其特征在于，所述化合物的结构式为R-Ala-(Dmb)Ala-OH，其中所述R为氨基保护基，所述化合物用于固相合成含两个相邻丙氨酸残基的多肽。
本发明的一些实施例中，所述R为Fmoc或Boc，优选为Fmoc。在一个具体实施方案中，所述化合物为Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH。
本发明的一些实施例中，所述多肽为索马鲁肽。
本发明中的化合物R-Ala-(Dmb)Ala-OH在固相合成索马鲁肽中的应用，特别是用于偶联索马鲁肽的Ala24-Ala25。
本发明提供了化合物Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：丙氨酸、2,4-二甲氧基苯甲醛和氰基硼氢化钠溶于甲醇和水反应制得(S)-2-(2,4-二甲氧基苯二胺)丙酸；
步骤2：Fmoc-Ala-OH与草酰氯在DCM中反应制得Fmoc-Ala-Cl；
步骤3：将步骤1制得的Fmoc-Ala-Cl、三乙胺及步骤2制得的(S)-2-(2,4-二甲氧基苯二胺)丙酸在DCM中反应得到Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH。
本文所使用的术语“固相合成”是指将将反应物连接在不溶性的固相载体上的合成方法。多肽的固相合成是指先将一个氨基酸连接在该不溶性的固相载体上，再将其它氨基酸依次连接在已接在固相载体上的氨基酸上。在多肽的固相合成中，通常使用树脂作为固相载体。多肽固相合成的过程通常是目的肽的第一个氨基酸C端通过共价键与固相载体连接，再以该氨基酸N端为合成起点，经过脱去氨基保护基和过量的已活化的第二个氨基酸进行反应，接长肽链，重复操作，达到理想的合成肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，分离纯化，获得目标多肽。如本领域所公知的，用于固相合成多肽的树脂包括但不限于聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺树脂、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物，这些树脂导入反应基团后可以直接连上(第一个)氨基酸。根据所导入反应基团的不同，这些树脂及树脂衍生物又可以分为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。目前本领域中常用的树脂包括但不限于PAM树脂、MBHA树脂、Wang树脂、2-CTC树脂、Rink-Amide树脂等。在本发明的一些实施方案中，所使用的树脂是Wang树脂或2-CTC树脂，其含义及结构式参见下表1。
本文所使用的术语“缩合试剂”是指在多肽固相合成中用于氨基酸偶联的试剂。在多肽固相合成中，依据不同的树脂、不同的氨基酸序列和/或不同的保护基，可以选择不同的偶联方法和/或不同的缩合试剂。缩合试剂包括但不限于碳二亚胺型和鎓盐型。碳二亚胺型主要包括DCC、DIC、EDC.HCl等。碳二亚胺型缩合试剂可以单独使用，也可以与其它缩合试剂组合使用。当碳二亚胺型缩合试剂与与HOBt、HOAt等组合使用时，可以将副反应控制在很低的范围。鎓盐型缩合试剂主要包括HBTU、HATU、PyBOP等。鎓盐型缩合试剂在使用过程中可以添加用于活化氨基酸的有机碱，如DIEA等。根据树脂、氨基酸序列和保护基选择合适的缩合试剂属于本领域的常规技术手段。
在本发明中，当使用多种缩合试剂时，这些缩合试剂可以组合使用。在本发明中，缩合试剂可以为DIC、DIC/HOBt、HATU/DIEA、HATU/HOBT/DIEA、HBTU/HOBT/DIEA或PyBOP/HOBT/DIEA。其中，“DIC/HOBt”表示DIC和HOBt的组合，“HATU/DIEA”表示HATU和DIEA的组合，“HATU/HOBT/DIEA”表示HATU、HOBT和DIEA的组合，“HBTU/HOBT/DIEA”表示HBTU、HOBT和DIEA的组合，“PyBOP/HOBT/DIEA”表示PyBOP、HOBT和DIEA的组合。本领域技术人员应当理解，两个或更多个缩合试剂组合使用是指在一次偶联反应中加入所述的两个或更多个缩合试剂。两个或更多个缩合试剂如何组合使用在本领技术人员的知识范围内，本领域技术人员知晓在一次偶联反应中如何加入所述的两个或更多个缩合试剂，例如其用量、加入的时机和顺序等。在本发明中，在用某一种原料进行偶联(可以是偶联一个氨基酸、偶联两个或多个氨基酸的短肽、或者是偶联侧链的部分或全部)的过程中，还可以使用缩合试剂的多种组合。例如，本发明中，所使用的缩合试剂可以为DIC、DIC/HOBt、HATU/DIEA、HATU/HOBT/DIEA、HBTU/HOBT/DIEA和PyBOP/HOBT/DIEA这些组合中的两种或更多种组合。当使用缩合试剂使用两种或更多种组合时，如本领域技术人员所知，可以先后进行多次偶联反应，每次偶联反应使用缩合试剂组合中的一种。
本发明中，每个氨基酸的偶联反应所使用的试剂和反应条件可以是彼此相同或不同。例如，可以是全部氨基酸的偶联反应所使用的试剂和反应条件彼此相同，或者可以是部分氨基酸的偶联反应所使用的试剂和反应条件彼此相同。每个氨基酸的偶联反应所使用的试剂和反应条件可以独立地选择。
本发明中，当提及偶联索马鲁肽序列中的特定氨基酸或侧链时，其含义与偶联该特定氨基酸或侧链的原料相同，本领域技术人员应当理解，其是指将用于合成将该氨基酸或侧链的原料连接到树脂上或连接到已接在树脂上的氨基酸上。所述的原料通常含有所述氨基酸或侧链，还含有保护基团等。例如，在本发明中，当使用Fmoc-Lys(Ivdde)-OH作为原料偶联Lys26时，“偶联Lys26”可以与“偶联Fmoc-Lys(Ivdde)-OH”具有相同含义。
本发明中，索马鲁肽的侧链是指与Lys26相连的侧链部分。在本发明中，索马鲁肽的侧链的结构式为当通过固相合成方法合成索马鲁肽时，可以在脱除主链上Lys26的侧链保护基后，在Lys26上偶联索马鲁肽的侧链。在Lys26上偶联索马鲁肽的侧链时，可以将所述侧链分成多个部分，逐步偶联各个部分，也可以先合成整个侧链，再将整个侧链偶联到Lys26上。
本发明中，当使用在右上角有数字标识的氨基酸描述索马鲁肽氨基酸序列中的氨基酸时，氨基酸右上角的数字表示该氨基酸在索马鲁肽氨基酸序列中从N端到C端的位置序号。例如，“Arg36”表示索马鲁肽氨基酸序列从N端到C端第36位的Arg；类似地，“Lys26”、“Ala24-Ala25”、“Gln23”和“His7”分别表示索马鲁肽氨基酸序列从N端到C端第26位的Lys，第24至25位的Ala-Ala，第23位的Gln，和第7位的His。其他类似表达方式的含义以此类推。
如本领域技术人员所知，在多肽的固相合成过程中，通常需要对偶联的氨基酸原料进行保护。在固相合成多肽时，如果多肽含有两个相邻丙氨酸，则易于形成β-折叠的二级结构，使肽聚集。本发明人发现，当合成两个相邻丙氨酸时，可以使用R-Ala-(Dmb)Ala-OH代替两个R-Ala-OH作为原料，由于在Ala的N上引入Dmb(即，2,4-二甲氧基苄基)，破坏了肽链间氢键的形成，使得合成的肽之间不易形成β-折叠的二级结构，大大减少了肽的聚集，从而有效提高缩合效率，其中R可以是任何适当的保护基，例如Fmoc或Boc。因此，本发明中，在固相合成索马鲁肽序列从N端到C端第24-25位的两个氨基酸时用Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH替代Fmoc-Ala-OH。
本发明中，对Lys26通过Ivdde进行保护，Ivdde可以被2％肼/DMF溶液脱除并且在TFA和哌啶溶液中相对稳定。本发明中，对His7使用Trt进行保护。Trt和Dmb都可在最终的裂解索马鲁肽-树脂的步骤中通过切割试剂一并除去，无需额外加入其他试剂进行脱除，因此在合成过程中，不会额外引入其他杂质。
在本发明中固相合成索马鲁肽的过程中，其它氨基酸可以根据情况选择适合的保护基团，对不同的氨基酸使用何种保护基团是本领域技术人员熟知的，带有保护基团的氨基酸可以通过商购获得，也可以自行合成。例如，氨基酸的保护可以包括α-氨基保护和侧链保护。如本领域技术人员所知，α-氨基可通过Boc、Fmoc等进行保护；丝氨酸和苏氨酸侧链羟基可通过苄基、叔丁基等进行保护；天冬氨酸和谷氨酸侧链羧基可通过叔丁基等进行保护；赖氨酸侧链可通过叔丁氧羰基、1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙氧羰基(Adpoc)、Alloc等进行保护；色氨酸可通过叔丁氧羰基等进行保护。
本发明中，在接上索马鲁肽的主链和侧链全部氨基酸以后，需要将索马鲁肽从固相载体(例如树脂)上裂解下来，这一过程使用裂解试剂完成。在多肽固相合成中，依据不同的固相载体(例如树脂)、不同的氨基酸序列和/或不同的保护基，可以选择不同的裂解方法和/或不同的裂解试剂。例如，可以选择酸性条件下裂解的条件，对于PAM、MBHA树脂，可以使用HF裂解，裂解过程中可以添加对甲苯酚、对巯基苯酚和/或苯甲醚等试剂。对于Wang树脂、Rink-Amide树脂、2-CTC树脂和Trt树脂，可以使用TFA进行裂解，裂解过程中还可以加入乙二硫醇、苯甲硫醚、水、三异丙基硅烷和/或苯酚等。这些添加试剂可作为碳正离子俘获试剂，用于俘获裂解反应过程中生成的碳正离子，减少这些碳正离子对部分氨基酸(例如Trp、Tyr等)侧链的进攻导致的副反应。此外，2-CTC树脂还可以用弱酸AcOH/TFE/DCM或0.5％TFA来切割，可以得到侧链活泼基团全保护的多肽。根据树脂、氨基酸序列和保护基选择合适的裂解试剂属于本领域的常规技术手段。在本发明中，所使用的裂解试剂可以是TFA、苯甲硫醚、苯酚、EDT和水的混合物，优选地，TFA、苯甲硫醚、苯酚、EDT和水的体积比为85～90:2.5～7.5:1～4:2.5～7.5，更优选地，TFA、苯甲硫醚、苯酚、EDT和水的体积比为87.5:5:2.5:5。
在本发明中，“索马鲁肽盐”包括但不限于索马鲁肽与无机酸或与有机酸形成的酸加成的盐，所述的无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；所述的有机酸诸如乙酸、三氟乙酸、丙酸、己酸、环戊丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、萘磺酸、樟脑磺酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等；或索马鲁肽上存在的酸性质子被金属离子，例如碱金属离子或碱土金属离子取代时形成的盐；或索马鲁肽与有机碱形成的配位化合物，所述的有机碱诸如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺等。在本发明的一些优选实施方案中，索马鲁肽盐为索马鲁肽TFA盐。
在本发明中，“转盐”是指将合成的多肽通过离子交换反应生成所需要的盐的过程，其可以通过离子交换法和HPLC法利用色谱柱来进行。在本发明的一些实施方案中，采用HPLC法，使用C18反相柱来对索马鲁肽进行转盐。
在本发明中，“检测量”是指足以实现所需检测目的的量，其可以由本领域技术人员根据具体的检测方法通过常规技术手段进行确定。
除非另有说明，本文所使用的所有技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
本发明中一些常用缩写的含义及其结构式如下表1所示。
表1
本发明通过固相合成法合成索马鲁肽，其包括在固相载体上逐步偶联索马鲁肽主链上的氨基酸，然后脱除Lys26的侧链保护基后再偶联索马鲁肽侧链上的氨基酸。本发明的方法可以降低固相合成中困难肽序的合成、提高了合成效率、降低了纯化的难度。具体地，本发明的方法包括：(1)将Gly与Wang树脂或2-CTC树脂偶联，得到Fmoc-Gly-树脂；(2)使用Fmoc-Gly-树脂，得到索马鲁肽主链-树脂，其中，如果选择的是2-CTC树脂，偶联Arg36时选用HATU/DIEA为缩合试剂，可以避免Gly37的双缩合现象，减低了插入肽产生的几率，减少了纯化的难度；在偶联Ala24-Ala25时选用Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH为原料，可以有效避免多肽的聚集和缺失肽的产生，提高样品的纯度；在偶联His7时选用Boc-His(Trt)-OH为原料，既可以避免水合肼脱除Ivdde的时候对Fmoc造成的影响，又可以有效避免组氨酸的消旋；(3)脱除索马鲁肽主链中Lys26的侧链保护基，然后在Lys26上偶联索马鲁肽的侧链，得到索马鲁肽-树脂；和(4)索马鲁肽的树脂肽经裂解，纯化即得。本发明的这些措施能有效避免插入肽和缺失肽的产生，提高偶联的效率和粗肽的纯度。此外，本发明的方法只需要通过抽滤和洗涤可以除去过量的氨基酸和缩合试剂，避免了液相反应中繁琐的过硅胶柱分离纯化的步骤，效率大大提升。
附图说明
图1：索马鲁肽的固相合成示意图。
图2：实施例14终产物的HPLC图谱。
图3：未使用Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH为原料时，15个氨基酸偶联的分子量检测质谱图。
图4：未使用Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH为原料时，19个氨基酸偶联的分子量检测质谱图。
图5：使用Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH为原料时，16个氨基酸偶联的分子量检测质谱图。
图6：使用Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH为原料时，22个氨基酸偶联的分子量检测质谱图。
具体实施方式
本发明通过以下实施例作进一步举例说明，这些实施例不应解释为对本发明的限制。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明所使用的氨基酸原料、缩合试剂和树脂等均为市售；树脂购自西安蓝晓，氨基酸原料购自吉尔生化。
本发明中所用到的氨基酸原料如下表2所示。
表2
下面通过具体实施例，对本发明的内容作具体的阐述。
实施例1 Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH的合成
在2L三口瓶中加入丙氨酸(20g，225mmol),2,4-二甲氧基苯甲醛(44.82g，270mmol)，氰基硼氢化钠(28g，450mmol)溶于甲醇(800mL)和水(400mL)中，常温搅拌反应48h，反应完全后，反应液用旋转蒸发仪在45℃下旋蒸除去甲醇，水相用DCM洗涤3次，水相冻干后用甲醇溶解上柱用DCM/MeOH＝10:1洗脱，得(S)-2-(2,4-二甲氧基苯二胺)丙酸(27g)，产率50％。
在250mL三口瓶中加入Fmoc-Ala-OH(5.0g，16.1mmol)，加入150mL干燥的DCM溶解，反应液呈浑浊态，滴加2-3滴DMF后搅拌5分钟，冰浴下冷却至0℃，滴加草酰氯(6.13g，48.2mmol)，滴加完毕后常温搅拌2小时，反应结束后将反应液用旋转蒸发仪在45度下旋蒸旋干得到白色固体化合物Fmoc-Ala-Cl(5.0g)产率94.3％。
在500mL三口瓶中加入Fmoc-Ala-Cl(6.45g，27.4mmol)，三乙胺(9.2g，91.2mmol)于DCM(200mL)中，冰浴下冷却至0℃，将(S)-2-(2,4-二甲氧基苯二胺)丙酸(10.0g，30.4mmol)溶于100mL DCM中，缓慢滴加入上述反应体系中，温度控制在5℃以下，滴加完毕后自然升温反应3小时，反应完全后，用1mol/L盐酸调节pH至酸性，搅拌30分钟后分层，水相用DCM萃取2次，有机相合并用饱和食盐水洗涤，干燥，过滤蒸干。用柱层析分离得到纯品3.9g，产率：24.3％。
实施例2取代度为0.20mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂的合成
称取取代度为0.98mmol/g的2-CTC树脂1g，加入到杯状反应柱中，用DCM溶胀树脂30分钟后，抽滤除去DCM；称取0.3mmol Fmoc-Gly-OH，加入10mL DCM和0.15mL DIEA于反应杯中，氮气鼓泡反应90min之后；加入0.2mL甲醇和0.2mL DIEA封端反应30min，工业DMF洗涤4次，DCM洗涤1次之后用甲醇抽干，可得到Fmoc-Gly-CTC树脂；取少量树脂用紫外分光光度计测得取代度为0.16mmol/g(三次平均值)。
实施例3取代度为0.25mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂的合成
称取取代度为0.79mmol/g的Wang树脂1g，加入到杯状反应柱中，用DCM溶胀树脂30min后，抽滤除去DCM；称取0.35mmol Fmoc-Gly-OH，加入HOBT/DIC/DMAP(与氨基酸的当量比为1/1/0.1)于反应杯中，溶剂为DCM/DMF＝1:1，氮气鼓泡反应120min之后；工业DMF洗涤5次之后加入0.2mL醋酸酐/吡啶(体积比为1/1)，溶剂依旧是DCM，封端反应60min；工业DMF洗涤4次，DCM洗涤1次之后用甲醇抽干，可得到Fmoc-Gly-Wang树脂。取少量树脂用紫外分光光度计测得取代度为0.24mmol/g(三次平均值)。
实施例4 2-CTC树脂Arg36的偶联
将实施例2制备的取代度为0.20mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂于杯状反应柱中，用DCM溶胀树脂30分钟后，抽滤除去DCM；加入体积比为1：4的Pip/DMF脱除Fmoc保护基团，脱除时间为25min，再加入工业DMF洗涤5次，DCM洗1次，国药DMF洗涤1次，茚三酮检测树脂显色，同时需要保证哌啶洗涤干净无残留。称取0.31g Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.48mmol)，0.19gHATU(0.5mmol)，溶解于5mL DMF中，加入0.16mL DIEA(1mmol)反应2min之后，倒入杯状反应柱中，氮气鼓泡反应90min。
所有偶联反应中，需要预活化的过程均在冰水浴中进行，避免活化过程中产生消旋等其他副产物。偶联反应均需用茚三酮检测树脂，如果树脂没有颜色，则表示偶联完全；如果树脂显色，则表示偶联不完全，需再延长反应时间直至偶联完全；在此条件下，延长的反应时间不能超过3h，如果3h之后树脂检测依旧显色，需要抽滤除去反应液，并加入国药DMF洗涤1次之后，重新投料偶联，直至茚三酮检测树脂没有颜色。
所有脱除Fmoc保护基团所用试剂为体积比为1:4的Pip/DMF，脱除时间为25min再加入工业DMF洗涤5次，DCM洗1次，国药DMF润洗1次，茚三酮检测树脂显色。为了保证哌啶洗涤干净无残留，必要的时候，需要用四氯苯醌检测最后一次洗涤之后的滤液，滤液颜色不会变成深紫色，说明洗涤干净，树脂无残留哌啶，否则需要加洗涤次数。
除了裂解之外的搅拌模式均为氮气鼓泡。
实施例5 Wang树脂Arg36的偶联
将实施例3制备的取代度为0.24mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂于杯状反应柱中，用DCM溶胀树脂30分钟后，抽滤除去DCM；加入体积比为1:4的Pip/DMF脱除Fmoc，脱除5min之后抽滤，再次加入体积比为1:4的Pip/DMF反应5min抽滤，加入工业DMF洗涤5次，DCM洗1次，国药DMF洗涤1次，茚三酮检测树脂显色。称取0.37g Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.57mmol)，65mgHOBT(0.48mmol)，溶解于4mL DMF中，加入0.075mL DIC(0.45mmol)于冰水浴中预活化之后，倒入杯状反应柱中，氮气鼓泡反应70min。
所有偶联反应中，需要预活化的过程均在冰水浴中进行，避免活化过程中产生消旋等其他副产物。偶联反应均需用茚三酮检测树脂，如果树脂没有颜色，则表示偶联完全；如果树脂显色，则表示偶联不完全，需再延长反应时间直至偶联完全；在此条件下，延长的反应时间不能超过3h，如果3h之后树脂检测依旧显色，需要抽滤除去反应液，并加入国药DMF洗涤1次之后，重新投料偶联，直至茚三酮检测树脂没有颜色。
所有脱除Fmoc保护基团所用试剂为体积比为1:4的Pip/DMF，脱除时间为25min再加入工业DMF洗涤5次，DCM洗1次，国药DMF润洗1次，茚三酮检测树脂显色。为了保证哌啶洗涤干净无残留，必要的时候，需要用四氯苯醌检测最后一次洗涤之后的滤液，滤液颜色不会变成深紫色，说明洗涤干净，树脂无残留哌啶，否则需要加洗涤次数。
除了裂解之外的搅拌模式均为氮气鼓泡。
实施例6 2-CTC树脂索马鲁肽主链树脂肽的制备
取实施例4中已经偶联Arg36的树脂，加入体积比为1:4的Pip/DMF脱除Fmoc保护基团，之后加入工业DMF洗涤5次，DCM洗1次，国药DMF洗涤1次，茚三酮检测树脂显色。之后按照索马鲁肽的氨基酸序列依次偶联，其中氨基酸原料投料当量为3当量，反应浓度为0.15mmol/mL，缩合试剂可为DIC/HOBt，溶剂为DMF。
其中Fmoc-Lys(Ivdde)-OH，Boc-His(Trt)-OH，Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH的偶联方法为氨基酸原料投料当量为3当量，反应浓度为0.3mmol/mL，DIC/HOBt为缩合试剂，溶剂为DMF偶联40min之后抽滤，DMF洗涤树脂1次之后再使用HATU/HOBT/DIEA再次偶联40min，溶剂为体积比为4:1的DMF:DCM。
除此之外，连续2个疏水Ala之后的Gln23极易丢失，偶联方法为氨基酸原料投料当量为3当量，反应浓度为0.3mmol/mL，DIC/HOBt为缩合试剂，溶剂为DMF偶联40min之后抽滤，DMF洗涤树脂1次之后再使用HATU/HOBT/DIEA再次偶联40min，溶剂为体积比为4:1的DMF:DCM。取少量树脂脱除Fmoc之后裂解，确保Gln23接上方可进行下一步。
实施例7 Wang树脂索马鲁肽主链树脂肽的制备
取实施例5中已经偶联Arg36的树脂，加入体积比为1:4的Pip/DMF脱除Fmoc保护基团，之后加入工业DMF洗涤5次，DCM洗1次，国药DMF洗涤1次，茚三酮检测树脂显色。之后按照索马鲁肽的氨基酸序列依次偶联，其中氨基酸原料投料当量为3当量，反应浓度为0.15mmol/mL，缩合试剂可为DIC/HOBt，溶剂为DMF。
其中Fmoc-Lys(Ivdde)-OH，Boc-His(Trt)-OH，Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH的偶联方法为氨基酸原料投料当量为3当量，反应浓度为0.3mmol/mL，DIC/HOBt为缩合试剂，溶剂为DMF偶联40min之后抽滤，DMF洗涤树脂1次之后再使用HATU/HOBT/DIEA再次偶联40min，溶剂为体积比为4:1的DMF:DCM。
除此之外，连续2个疏水Ala之后的Gln23极易丢失，偶联方法为氨基酸原料投料当量为3当量，反应浓度为0.3mmol/mL，DIC/HOBt为缩合试剂，溶剂为DMF偶联40min之后抽滤，DMF洗涤树脂1次之后再使用HATU/HOBT/DIEA再次偶联40min，溶剂为体积比为4:1的DMF:DCM为4:1。取检测量的树脂脱除Fmoc之后裂解，确保Gln23接上方可进行下一步。
实施例8 2-CTC树脂索马鲁肽主链树脂肽脱除Ivdde
取实施例6中索马鲁肽主链树脂肽，加入体积为树脂体积的2-3倍的2％水合肼/DMF溶液，氮气鼓泡反应10min之后，抽滤除去反应液；再次加入树脂体积的2-3倍的2％水合肼/DMF溶液，重复操作4次；取检测量的树脂裂解，MS检测无amu+206.26的方可进行下一步。
实施例9 Wang树脂索马鲁肽主链树脂肽脱除Ivdde
取实施例7中索马鲁肽主链树脂肽，加入体积为树脂体积的2-3倍的2％水合肼的DMF溶液，氮气鼓泡反应10min之后，抽滤除去反应液；再次加入树脂体积的2-3倍的2％水合肼的DMF溶液，重复操作4次；取少量树脂裂解，MS检测无amu+206.26的方可进行下一步。
实施例10 2-CTC树脂索马鲁肽主链树脂肽修饰侧链
取实施例8中脱完Ivdde的索马鲁肽主链树脂肽，按照索马鲁肽侧链片段的顺序，依次偶联Fmoc-NH-PEG2-CH2COOH、Fmoc-NH-PEG2-CH2COOH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯得索马鲁肽的树脂肽。
其中Fmoc-NH-PEG2-CH2COOH和Fmoc-Glu(OH)-OtBu投料当量为3当量，反应浓度为0.3mmol/mL，缩合试剂为HATU/HOBT/DIEA，溶剂为DMF。室温反应90min。
十八烷二酸单叔丁酯的缩合试剂为DIC且预活化5min，投料当量为3当量，反应浓度为0.3mmol/mL，溶剂为体积比为1:1的DMF:DCM，室温反应70min，用DMF洗涤5次之后，用DCM洗涤2次之后用甲醇或二氯甲烷抽干树脂。
实施例11 Wang树脂索马鲁肽主链树脂肽修饰侧链
取实施例9中脱完Ivdde的索马鲁肽主链树脂肽，按照索马鲁肽侧链基团顺序，依次偶联Fmoc-NH-PEG2-CH2COOH、Fmoc-NH-PEG2-CH2COOH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯得索马鲁肽的树脂肽。
其中Fmoc-NH-PEG2-CH2COOH和Fmoc-Glu(OH)-OtBu投料当量为3当量，反应浓度为0.3mmol/mL，缩合试剂为HATU/HOBT/DIEA，溶剂为DMF。室温反应90min。
十八烷二酸单叔丁酯的缩合试剂为DIC且预活化5min，投料当量为3当量，反应浓度为0.3mmol/mL，溶剂为体积比为1:1的DMF:DCM，室温反应70min，DMF洗涤5次之后，用DCM洗涤2次之后用甲醇或二氯甲烷抽干树脂。
实施例12 2-CTC索马鲁肽树脂肽的裂解
裂解试剂为TFA、苯甲硫醚、苯酚、EDT和水的比例为87.5:5:2.5:5:2.5。放入2-8℃的展示柜待用，乙醚也放入2-8℃的展示柜待用。将树裂解试剂倒入大烧杯，烧杯置于冰水浴中，边搅拌边加入抽干的树脂，于冰水浴下反应30min之后，在逐渐升至室温继续反应2.5h。MS检测无保护基切除不干净，如果MS显示有保护基切割不掉，则补加该保护基相应的捕获剂。裂解结束后，抽滤得滤液，加入20倍滤液体积的冰乙醚离心沉淀；沉淀加入水和乙腈溶解过滤冻干待制备。冻干之后得粗肽0.49g，收率为74.4％，粗肽纯度57.8％。
实施例13 Wang索马鲁肽树脂肽的裂解
裂解试剂为TFA、苯甲硫醚、苯酚、EDT和水的比例为85：2.5：2.5：5：2.5。放入2-8℃的展示柜待用，乙醚也放入2-8℃的展示柜待用。将树裂解试剂倒入大烧杯，烧杯置于冰水浴中，边搅拌边加入抽干的树脂，于冰水浴下反应30min之后，在逐渐升至室温继续反应2.5h。MS检测无保护基切除不干净，如果MS显示有保护基切割不掉，则补加该保护基相应的捕获剂。裂解结束后，抽滤得滤液，加入20倍滤液体积的冰乙醚离心沉淀；沉淀加入水和乙腈溶解过滤冻干待制备。冻干之后得粗肽0.76g，收率为77.0％，粗肽纯度62.0％。
实施例14索马鲁肽TFA盐的制备
粗肽称取0.49g索马鲁肽粗肽，加入总体积约为50mL的水和乙腈(约3:1)溶解样品，用LC20-AP(岛津公司，型号为20-AP)进行制备，色谱柱为50×250mm C18反相柱，波长220nm和254nm，柱温为40℃，流动相为1‰TFA/水和1‰TFA/乙腈，收集目标组分，冷冻干燥得到纯度大于98.5％产品肽。得到固体0.16g，纯化收率32％，总收率为23.8％。
实施例15索马鲁肽TFA盐的制备
粗肽称取0.5g索马鲁肽粗肽，加入总体积约30mL的甲酸水/乙腈溶解样品，用LC20-AP进行制备，色谱柱为50×250mm C18反相柱，波长220nm和254nm，柱温为40℃，流动相为1‰TFA/水和1‰TFA/乙腈，收集目标组分，冷冻干燥得到纯度大于98.5％产品肽。得到固体0.12g，收率24％，总收率为18.5％。
实施例16对比实验
为验证利用Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH原料合成Ala24-Ala25，是否能避免合成索马鲁肽过程中Gln23的丢失，采用了对比实验进行说明。取实施例4中已经偶联Arg36的树脂，加入20％Pip/DMF脱除Fmoc保护基团，之后加入工业DMF洗涤5次，DCM洗1次，国药DMF洗涤1次，茚三酮检测树脂显色。之后按照索马鲁肽的C端到N端的氨基酸序列依次偶联，Ala24-Ala25不采用Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH为原料，均采用Fmoc-Ala-OH为原料，其中氨基酸原料投料当量为3当量，反应浓度为0.2mmol/mL，偶联试剂为DIC/HOBt，溶剂为DMF。其中Fmoc-Lys(Ivdde)-OH偶联方法为氨基酸原料投料当量为3当量，反应浓度为0.3mmol/mL，DIC/HOBt为偶联试剂，溶剂为DMF偶联40min之后抽滤，DMF洗涤树脂1次之后再选用HATU/HOBT/DIEA再次偶联40min，溶剂为体积比为4:1的DMF：DCM。Gln23的偶联方法为氨基酸原料投料当量为3当量，反应浓度为0.3mmol/mL，DIC/HOBt为偶联试剂，溶剂为DMF偶联40min之后抽滤，DMF洗涤树脂1次之后再选HATU/HOBT/DIEA再次偶联40min，溶剂为体积比为4:1的DMF：DCM。取中间树脂肽做质谱检测，根据质谱的数据计算分子量的公式为：M＝二价质谱值*2-2或者M＝三价质谱值*3-3。肽链长度为15个氨基酸偶联时，目标分子量1907.26，检测分子量为1908和1779.8，后者为丢失Q的分子量，见图3；肽链长度为19个氨基酸偶联时，目标分子量2370.73，检测分子量为2370.6和2242.2，后者为丢失Q的分子量，见图4。
同样地，取实施例6中间树脂肽做质谱检测，肽链长度为16个氨基酸偶联时，目标分子量1964.3，检测分子量为1965，未发现丢失Q的分子量1836.3(见图5)；肽链长度为22个氨基酸偶联时，目标分子量2644.01，检测分子量为2643.8，未发现丢失Q的分子量2515.8，见图6。可见，以Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH为原料能够有效避免Gln23的缺失，可能是由于Dmb保护基能够避免形成氢键而造成多肽聚集，使得Gln23可以被充分缩合；同时，Dmb保护基替换了可以形成氢键的氮原子上的H，使得氢键无法形成也能避免多肽的聚集。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，不能认定本发明的具体工作仅限于此，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以进行简单的改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
