一种使用imac层析纯化非标签化crm197蛋白的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种使用IMAC层析纯化非标签化CRM197蛋白的方法。
背景技术
白喉毒素（DT）是白喉杆菌β噬菌体溶源化后，由β噬菌体tox基因编码合成的外毒素。DT分子全长533aa，分子量为58330D，Cys186与Cys201形成二硫键，其间的柄状环TL1（187-200aa）富含Arg，易被胰蛋白酶切开，使DT成为由二硫键链接的A片段（1-193aa）与B片段（194-533aa）。
白喉毒素突变体（Cross reacting material, CRM197）是白喉毒素丧失了毒性的一种突变体，它是野生型DT的核苷酸序列中由一个碱基G突变为A，从而导致了第52位氨基酸Gly变为Glu。从结构上看，CRM197具有完整的DT功能结构。但试验表明，DT的A片段能与NAD结合而CRM197不能，这表明NAD结合位点的变化影响了DT的酶活性及毒性。这就证明了52位的Gly在DT的NAD结合位点起重要作用，该位点氨基酸的改变，导致了DT酶活性位点同NAD：EF2ADP核糖酶结合区发生改变，导致CRM197片段A不能与EF2结合，不能对细胞产生毒性作用。
CRM197不具有酶活性及毒性，但具有DT的免疫原性。因此，CRM197作为一种蛋白载体与多糖耦联制备成多糖结合疫苗，已有相应的产品上市。
目前CRM197一般采用溶原化的白喉杆菌分泌产生，该菌株经由β噬菌体感染含有编码DT的tox突变基因。该系统的优点是目的蛋白以分泌形式表达于胞外，杂蛋白含量低有利于纯化生产。缺点是白喉杆菌发酵条件严苛，且培养基成分复杂，价格昂贵。
采用大肠杆菌表达系统，具有生产周期短、成本低、外源DNA易于导入、外援蛋白表达简易和能很快产生大量的目的蛋白等优点，是表达重组蛋白优先选用的系统。但目前采用该系统表达CRM197存在缺陷，即目的蛋白以包涵体的形式存在，需经过变性、复性的阶段，不利于产量的提高和生产放大，且携带标签需要后续处理步骤，增加了产品质控风险。
IMAC又称金属螯合亲和层析，是近20年来发展起来的一种新型亲和层析技术。与其他亲和层析技术相比，其优点在于配体稳定性高、吸附量大、洗脱条件温和、高通量、柱再生能力强以及成本低等。IMAC不仅可用于蛋白质或肽的分离纯化，也可用于寡核苷酸的分离、病毒的灭活以及从蛋白制备物中去除内毒素等，应用十分广泛。
金属螯合层析是利用固定相偶联的配基——亚氨基二乙酸(IDA)与金属离子发生螯合作用，该金属离子又与蛋白分子中的某些氨基酸侧链（主要是His和较小程度的Cys和Trp）结合。固定化金属离子的相互作用强度取决于氨基酸侧链的类型、数量和空间分布，通常在设计的时候会在蛋白的C端或N端添加6个His，以此增强和金属离子的结合能力，但这样设计不可避免的会改变蛋白的空间结构，对蛋白的活性和免疫原性产生影响。
本发明不需要添加His标签，只需要对蛋白进行变性处理，从而打开蛋白结构使蛋白结构内部的His暴露出来，从而增加与金属离子的结合能力，然后根据适当的洗脱步骤将目的蛋白与杂质分离，该技术方案特别适用于包涵体的纯化，一步层析就能得到纯度大于90%的样品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种高效纯化CRM197包涵体的方法。
本发明的技术方案为：一种使用IMAC层析纯化非标签化CRM197蛋白的方法，包括如下步骤：
（1）将大肠杆菌表达系统得到非标签化的CRM197蛋白包涵体用变性剂处理，
（2）过滤后上样IMAC层析柱，使用洗脱液洗脱，收集洗脱峰，
（3）用复性液复性及超滤浓缩，
（4）然后进行分子筛层析或疏水层析，获得CRM197蛋白。
进一步地，步骤（1）中，变性剂处理的方法为：使用6M盐酸胍溶解包涵体，然后离心收集上清，向上清中加入终浓度为5mM的咪唑，调节pH至8.5。
进一步地，步骤（1）中，变性剂处理的具体方法为：使用6M盐酸胍按10倍体积溶解包涵体，37℃下溶解2~4小时，然后10000g，4℃离心收集上清，向上清中加入终浓度为5mM的咪唑，调节pH至8.5。
进一步地，步骤（2）中，IMAC层析柱为Ni层析柱或Cu层析柱。
进一步地，步骤（2）中，洗脱液组成为：20mM Tris-HCl，6M盐酸胍，100mM咪唑，pH=8.5。
进一步地，步骤（2）具体方法为：IMAC层析，使用平衡液20mM Tris-HCl，6M盐酸胍，10mM 咪唑 pH=8.5平衡层析柱至基线稳定，然后上样2CV的上清液，再平衡5CV，使用洗脱液20mM Tris-HCl，6M盐酸胍，100mM 咪唑 pH=8.5洗脱，收集洗脱峰。
进一步地，步骤（3）中，用复性液复性及超滤浓缩的方法为：将IMAC收集的洗脱液用复性液20mM Tris-HCl，5mMEDTA，5mM DTT，pH=8.5稀释10倍进行复性，4℃复性24~96小时；复性后蛋白使用30KD超滤浓缩5倍，同时将缓冲液置换为20mM Tris-HCl，0.15M NaCl ，pH=7.0。
进一步地，步骤（4）中，分子筛层析方法为：用平衡缓冲液20mM Tris-HCl ，0.15M氯化钠，pH=7.0平衡Sephacryl S300层析柱，上样超滤浓缩的样品，使用平衡液洗脱，收集洗脱峰1。
进一步地，步骤（4）中，疏水层析方法为：用平衡缓冲液20mM Tris-HCl ，0.5M硫酸铵， 3M NaCl ，pH=7.0平衡Capto Phenyl FF层析柱，上样超滤浓缩的样品，再平衡5CV，然后使用洗脱液，20mM Tris-HCl pH7.0洗脱，收集目的蛋白峰。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明不需要添加His标签，只需要对蛋白进行变性处理，从而打开蛋白结构使蛋白结构内部的His暴露出来，从而增加与金属离子的结合能力，然后根据适当的洗脱步骤将目的蛋白与杂质分离，该技术方案特别适用于包涵体的纯化，一步层析就能得到纯度大于90%的样品。
附图说明
图1 pET28a(+)-CRM197重组表达质粒的诱导表达；
图2 重组表达的CRM197蛋白Western blotting 检测结果；
图3 CRM197蛋白经IMAC纯化的结果；
图4 CRM197经Q柱阴离子层析纯化的结果；
图5 CRM197纯化蛋白进行SEC-HPLC的检测结果。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
实施例1
（1）本发明对CRM197序列进行分析优化，采用大肠杆菌常用密码子代替稀有密码子，并平衡A、T、C、G四种碱基的比例和分布。在CRM197序列的两端分别插入BamHI和NcoI酶切位点。
（2）将优化合成后的CRM197基因用BamHI和NcoI双酶切后，连入同样用BamHI和NcoI双酶切后的表达载体pET28a(+)上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，37℃培养过夜。次日挑取单克隆于5mL LB（Kana）液体培养基中，37℃，220 r/min培养12小时，提取质粒，BamHI和NcoI双酶切鉴定目的基因的插入，并送测序。测序正确的质粒命名为pET28a(+)-CRM197。
（3）pET28a(+)-CRM197质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中，37℃培养过夜。次日挑取单克隆于5mL LB（Kana）液体培养基中，37℃，220r/min培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为5mM的IPTG，25℃，220r/min继续培养8小时。10000g，4℃离心收集菌体，用50mM Tris-HCl+50mM NaCl（pH=8.5）重悬后，超声破碎菌体。12000g，4℃离心取上清和沉淀，沉淀用6M盐酸胍等体积复溶，进行SDS-PAGE电泳，以空载体表达产物为对照，鉴定CRM197蛋白的表达。
（4）将含有CRM197蛋白的超声破菌上清和沉淀及空载体上清和沉淀进行SDS-PAGE蛋白电泳后，蛋白转移至硝酸纤维素膜上。用含3%BSA的PBS室温封闭1h后，加入1:5000稀释的白喉毒素单克隆抗体，4℃孵育过夜。将膜用PBST洗涤5遍后，加入1:5000稀释的辣根酶标记的抗小鼠IgG二抗。室温孵育2小时后PBST洗涤5遍，采用化学发光法显色。从试验结果可以看出，表达出来的蛋白可以和白喉毒素抗体特异性结合。证明目的蛋白有表达，且主要以包涵体的形式表达。
（5）表达CRM197蛋白的种子液500mL，转接入50L发酵罐中，培养至OD600约为6时，加入终浓度为5mM的IPTG，25℃~30℃诱导表达8小时后收获菌体。
（6）10000g，4℃离心收集菌体。用20mM Tris-HCl（pH=8.5）重悬后均质破碎菌体。10000g，4℃离心收集沉淀。用含1.5M尿素的20mM Tris-HCl（pH=8.5）洗涤包涵体2次，收集沉淀，得到较纯的包涵体。
（7）使用6M盐酸胍按10倍体积溶解包涵体，37℃下溶解2小时，然后10000g，4℃离心收集上清，向上清中加入终浓度为5mM的咪唑，调节pH至8.5，然后0.45μm过滤。
（8）IMAC层析（Ni+），使用平衡液（20mM Tris-HCl，6M盐酸胍，10mM 咪唑 pH=8.5）平衡层析柱至基线稳定，然后上样2CV的溶解上清液，再平衡5CV，使用洗脱液（20mM Tris-HCl，6M盐酸胍，100mM 咪唑 pH=8.5），收集洗脱峰。通过灰度分析软件Image J计算得出的纯度为100%。
（9）复性及超滤，将IMAC收集的洗脱液用复性液（20mM Tris-HCl，5mMEDTA，5mMDTT，pH=8.5）稀释10倍进行复性，4℃复性96小时。复性后蛋白使用30KD超滤浓缩5倍，同时将缓冲液置换为20mM Tris-HCl ，0.15M NaCl（pH=7.0）。
（10）分子筛层析：用平衡缓冲液20mM Tris-HCl ，0.15M氯化钠，pH=7.0平衡Sephacryl S300层析柱，上样超滤浓缩的样品，使用平衡液洗脱，收集洗脱峰1。
实施例2
（1）本发明对CRM197序列进行分析优化，采用大肠杆菌常用密码子代替稀有密码子，并平衡A、T、C、G四种碱基的比例和分布。在CRM197序列的两端分别插入BamHI和NcoI酶切位点。
（2）将优化合成后的CRM197基因用BamHI和NcoI双酶切后，连入同样用BamHI和NcoI双酶切后的表达载体pET28a(+)上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，37℃培养过夜。次日挑取单克隆于5mL LB（Kana）液体培养基中，37℃，220 r/min培养12小时，提取质粒，BamHI和NcoI双酶切鉴定目的基因的插入，并送测序。测序正确的质粒命名为pET28a(+)-CRM197。
（3）pET28a(+)-CRM197质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中，37℃培养过夜。次日挑取单克隆于5mL LB（Kana）液体培养基中，37℃，220r/min培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为5mM的IPTG，25℃，220r/min继续培养8小时。10000g，4℃离心收集菌体，用50mM Tris-HCl+50mM NaCl（pH=8.5）重悬后，超声破碎菌体。12000g，4℃离心取上清和沉淀，沉淀用6M盐酸胍等体积复溶，进行SDS-PAGE电泳，以空载体表达产物为对照，鉴定CRM197蛋白的表达。
（4）将含有CRM197蛋白的超声破菌上清和沉淀及空载体上清和沉淀进行SDS-PAGE蛋白电泳后，蛋白转移至硝酸纤维素膜上。用含3%BSA的PBS室温封闭1h后，加入1:5000稀释的白喉毒素单克隆抗体，4℃孵育过夜。将膜用PBST洗涤5遍后，加入1:5000稀释的辣根酶标记的抗小鼠IgG二抗。室温孵育2小时后PBST洗涤5遍，采用化学发光法显色。从试验结果可以看出，表达出来的蛋白可以和白喉毒素抗体特异性结合。证明目的蛋白有表达，且主要以包涵体的形式表达。
（5）表达CRM197蛋白的种子液500mL，转接入50L发酵罐中，培养至OD600约为6时，加入终浓度为5mM的IPTG，25℃~30℃诱导表达8小时后收获菌体。
（6）10000g，4℃离心收集菌体。用20mM Tris-HCl（pH=8.5）重悬后均质破碎菌体。10000g，4℃离心收集沉淀。用含1.5M尿素的20mM Tris-HCl（pH=8.5）洗涤包涵体2次，收集沉淀，得到较纯的包涵体。
（7）使用8M尿素按10倍体积溶解包涵体，37℃下溶解2小时，然后10000g，4℃离心收集上清，向上清中加入终浓度为5mM的咪唑，调节pH至8.5，然后0.45μm过滤。
（8）IMAC层析（Cu2+），使用平衡液（20mM Tris-HCl，8M尿素，10mM 咪唑 pH=8.5）平衡层析柱至基线稳定，然后上样2CV的溶解上清液，再平衡5CV，使用洗脱液（20mM Tris-HCl，8M尿素，100mM 咪唑 pH=8.5），收集洗脱峰。通过灰度分析软件Image J计算得出的纯度为100%。
（9）复性及超滤，将IMAC收集的洗脱液用复性液（20mM Tris-HCl，5mMEDTA，5mMDTT，pH=8.5）稀释10倍进行复性，4℃复性96小时。复性后蛋白使用30KD超滤浓缩5倍，同时将缓冲液置换为20mM Tris-HCl ， 0.15M NaCl（pH=7.0）。
（10）疏水层析，用平衡缓冲液20mM Tris-HCl ，0.5M硫酸铵， 3M NaCl（pH=7.0）平衡Capto Phenyl FF（H=10cm，CV=20ml）层析柱，上样超滤浓缩的样品，再平衡5CV，然后使用洗脱液，20mM Tris-HCl pH7.0洗脱，收集目的蛋白峰。再通过SEC-HPLC和灰度分析，纯度为100%。
本发明通过IMAC亲和层析技术纯化非标签蛋白，避免蛋白标签对蛋白的活性和免疫原性产生影响，解决了包涵体通过常规的离子交换层析、疏水层析难以纯化的问题，且给难以纯化的可溶性蛋白提供了一种高效的解决思路。
通过本发明得到的CRM197蛋白纯度较高，纯度≥90%，工艺简单、生产成本低，且可线性放大。
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