一株植物乳杆菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于植物乳杆菌
技术领域
，具体涉及一株植物乳杆菌及其制备方法和应用。背景技术
20世纪以来，随着抗生素的发现，促进了人类医学、畜禽养殖业的巨大进步，从而抗生素类药品成为了抗菌治病的首选。大量抗生素使用，虽然使养殖业不断受益，但是随着抗生素的不规范使用，导致大量耐药菌株的出现，因此寻求抗生素替代品已是我们迫切需要解决的问题。
益生菌可直接饲喂动物，具有安全、可靠、性能优良等特点。益生菌在疾病预防、治疗等方面发挥着重要作用，主要定值于动物口腔、肠道、生殖道内，有改善肠道微生态环境、平衡菌群动态、纠正肠内菌群紊乱、增强免疫功能、促进禽畜肠道有益菌的增殖、阻止或抑制有害菌的繁殖等作用。其与宿主互利共生、协同进化，一旦破坏其平衡，动物健康就会受到危害。而植物乳杆菌，是人和动物肠道内主要的益生菌群，可作为食品辅料，制备功能性食品，调节人和动物肠道菌群。此外，植物乳杆菌用于动物养殖，还具有无残留、无毒副作用，可改善养殖生态环境，达到生态防治的目的，作为饲料添加剂，可以增强动物免疫活性及肉质品质，使动物养殖生产实现良性发展，取得更好的生态效益和经济效益。
目前国内微生态制剂的生产主要采用普通的发酵技术，其生产效率相对低下，培养基的营养成分得不到完全利用，植物乳杆菌目前仍难以实现高密度发酵，难以实现的主要问题是发酵的培养基和发酵方法，发酵后期营养不足和代谢产物积累抑制菌体生长，且植物乳杆菌通常都是厌氧发酵，填补料不方便导致高密度发酵难以实现。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）Kmust-Li01，其于于2020年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21266，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明植物乳杆菌是从健康猪肠道黏膜中分离到的革兰氏阳性菌，在MRS液体培养基中培养，细胞为短杆状，在MRS琼脂培养基平板上培养，菌落呈乳白色，表面光滑，凸起明显，边缘整齐，不透明，有光泽；提取菌株的总DNA，用细菌16SrDNA通用引物扩增目的片段，对片段进行回收、克隆、测序；对细菌16SrDNA基因片段序列使用NCBI的BLAST进行16SrDNA的相似性比对，结果显示与植物乳杆菌已知序列同源性为99.82%，认定它是植物乳杆菌。
本发明另一目的是提供上述植物乳杆菌Kmust-Li01的高密度发酵方法，具体为按体积比2%～5%的接种量将植物乳杆菌Kmust-Li01种子液接种到MRS液体培养基中，在35～38℃、pH6.2～6.4、搅拌、溶氧量小于1%条件下发酵，发酵过程中，当发酵培养至7～8h，葡萄糖残留量为0 .04～0 .06％时，以5～8mL/L·h的速率开始补充葡萄糖，发酵培养至11～12h后，葡萄糖残留量为0 .10～0 .15％时，以10～15mL/L·h速率补充葡萄糖，继续发酵至17～18h后，葡萄糖残留量为0 .12～0 .15％时，以9～12mL/min速率补充葡萄糖，继续发酵1～2 h，完成发酵，通过本发明方法发酵，发酵液中活菌数能达到1011量级，较普通发酵活菌数明显提高30倍。
本发明植物乳杆菌Kmust-Li01发酵液经5000～12000g离心去除上清后，在菌体中添加其质量3～5倍的冻干保护剂，混匀后冷冻干燥制得冻干菌粉，其中冻干保护剂组成为8～12%脱脂乳粉、3～7%海藻糖、3～7%葡萄糖、维生素C 0.5～1.5%，蒸馏水1000mL，在115℃灭菌20min制得。
所述种子液是将植物乳杆菌Kmust-Li01接种至MRS液体培养基37℃培养12～18h制得。
本发明另一目的是将上述植物乳杆菌Kmust-Li01应用在抑制病原微生物中，可以作为食品辅料、环境消杀剂或饲料添加剂，该菌株对大肠杆菌（Escherichia coli）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志贺氏菌（Shigella Castellani）6株菌均具有较好的抑菌活性，敏感性均表现为高敏感或极敏感；
本发明的优点和技术效果：本发明从健康猪肠道中获得一株新的植物乳杆菌，其能有效抑制病原微生物；本发明为畜禽养殖业的生态养殖提供了一条新的途径；本发明提供的发酵方法较普通的发酵技术更高效，普通发酵技术发酵植物乳杆菌的活菌数通常只能达到109cfu/mL左右，而本发明发酵方法制得的发酵液中活菌数能达到1011量级以上；且本发明方法简单，易操作，适于工业化生产和市场推广应用。
附图说明
图1为植物乳杆菌Kmust-Li01菌落示意图；
图2为植物乳杆菌Kmust-Li01显微镜下形态图；
图3为植物乳杆菌Kmust-Li01生长曲线图；
图4为植物乳杆菌Kmust-Li01耐酸碱实验结果；
图5为植物乳杆菌Kmust-Li01耐盐性实验结果；
图6植物乳杆菌Kmust-Li01系统发育树。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配置的试剂，培养基均为市售产品，按使用说明使用。
实施例1：植物乳杆菌的分离及鉴定
1、取健康猪肠道黏膜匀浆，然后用无菌生理盐水采用10倍稀释法进行稀释后，取10-6～10-8稀释范围的稀释液涂布于MRS固体平板培养基上，37℃恒温培养24h；挑取典型单菌落，反复划线分离至获得纯菌株；其中MRS液体培养基组成为蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、吐温80 1mL/L，1000mL蒸馏水，调节pH为6.2~6.4 ，115℃灭菌20min。
该菌株在MRS液体培养基中培养，细胞为短杆状，见图2，在MRS琼脂培养基平板上培养，菌落呈乳白色，表面光滑，凸起明显，边缘整齐，不透明，有光泽，见图1。
2、生长曲线测定
将纯化后菌株接种至MRS液体培养基中，在37℃、150rpm的恒温摇床中振荡培养12h，在培养过程中，从0h开始，每隔2h取一次培养液，在600nm波长下测定菌液浓度（OD值），以未接入菌液的培养液作为对照来校正分光光度计的零点，来消除仪器所引入的误差，根据菌液浓度绘制地衣芽孢杆菌生长曲线图，该菌对数生长期为12h，生长曲线见图3。
3、生理生化鉴定
按乳杆菌属的生理生化鉴定试验要求，分别进行革兰氏染色、运动性、耐盐（0、5%、7%、10%、12%和15%NaCl）、耐酸碱（3、5、6、7、8、9、10）、耐热（35℃、45℃、55℃）、硝酸盐还原试验、糖发酵产酸、糖发酵产气、接触酶、淀粉水解试验、明胶液化试验、VP试验、MR试验、过氧化氢酶试验、产硫化氢试验、精氨酸双水解实验，对照《伯杰氏细菌鉴定手册（第八版）》中的植物乳杆菌模式菌株生理生化指标，植物乳杆菌Kmust-Li01在pH7-10范围内耐受性较强，见图4；Kmust-Li01在盐浓度为5%时具有较好的耐盐性，见图5；其余实验结果见表1；
表1植物乳杆菌Kmust-Li01生理生化实验结果
注：“-”代表阴性反应，“+”代表阳性反应，“W”代表反应较弱；
4、16S rRNA基因序列分析
对最终筛选出的菌株进行16S rDNA分子生物学鉴定；用细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司北京）提取菌株的总DNA，采用通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTAGGACTT- 3′）扩增其16S rDNA片段；PCR的反应程序如下：94℃预变性4min；94℃ 30s ，50℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温；PCR产物大小经过琼脂糖凝胶电泳检测验证后，将目标条带进行纯化，交由上海生工生物工程股份有限公司进行Sanger测序；得到测序序列在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Informmion）网站GenBank数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中进行Blast比对，通过得分最高的已知种类确定种名；PCR扩增得到16S rDNA片段经测序为1095bp，见序列表1；应用BLAST比对，MEGA构建Neighbor-Joining树（图6），菌株与已知的植物乳杆菌聚集在一个分支上，与Lactobacillus plantarum 7029和Lactobacillus plantarum 6694的同源性较高，综合形态学观察、生理生化实验和分子生物学检测测序结果，确定从健康猪肠道分离的菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
5、抑菌活性实验
采用双层平板法进行抑菌实验，准备LB固体平板和LB半固体培养基，将Kmust-Li01培养到对数生长期，8000r/min离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，备用；准备致病菌大肠杆菌、嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌的菌液。将100µL致病菌菌液和4mL半固体培养基混匀倒入LB固体平板，用镊子将已灭菌牛津杯放置在双层平板上，加入200μL Kmust-Li01上清液到牛津杯中，分别以添加50 μg/mL的卡那霉素和已灭菌PBS缓冲液作为阳性对照和阴性对照，每组病原菌设置3个平行，将上述平板置于4℃冰箱中扩散4h，后转入37℃恒温培养箱培养24h，测量抑菌圈直径，以抑菌圈平均直径作为最终的抑菌圈直径，实验结果见表2，Kmust-Li01对六种病原菌均具有敏感性，阳性对照对病原菌极敏感，阴性对照对病原菌均不敏感。
表2 植物乳杆菌Kmust-Li01抑菌活性
注：>20为极敏感；15-20为高敏感；10-14为中敏感；<10为低敏感；0-8为不敏感。
实施例2：三阶段差异化补料高密度发酵培养植物乳杆菌Kmust-Li01
（1）植物乳杆菌高密度发酵MRS液体培养基组分及含量
蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠 5g/L、硫酸镁 0.58g/L、硫酸锰 0.25g/L、吐温80 1mL/L；配制发酵培养基，使培养基降到培养所需温度；
（2）以接种量为5.0%将植物乳杆菌Kmust-Li01接种至MRS液体培养基37℃培养15h制得种子液；
（3）以5.0%的接种量将步骤（2）种子液接种于步骤（1）的发酵培养基中在37℃、pH6.2～6.4、转速150rpm搅拌、溶氧量小于1%条件下发酵，发酵过程维持pH值为6.2~6.4，当pH低于过6.2时，自动流加碱性中和剂氨水或氢氧化钠；当pH高于6.4时补加50%葡萄糖液；发酵过程中通过添加葡萄糖溶液进行补料，葡萄糖溶液浓度为1000g/L，当发酵培养7h，葡萄糖残留量为0.05％时，以5mL/L·h的速率开始补充葡萄糖溶液，发酵培养至12h后，葡萄糖残留量为0.10％时，以12mL/L·h速率补充葡萄糖溶液，继续发酵至17h后，葡萄糖残留量为0.12％时，以10mL/L·h速率补充葡萄糖溶液，继续发酵2 h结束，完成发酵，发酵液中植物乳杆菌Kmust-Li01活菌数为1.3×1011cfu/mL；
（4）发酵液经5000～12000g离心去除上清后，在菌体中添加其质量4倍的冻干保护剂，混匀后冷冻干燥制得冻干菌粉，其中冻干保护剂组成为10%脱脂乳粉、5%海藻糖、5%葡萄糖、维生素C 1%，蒸馏水1000mL，在115℃灭菌20min制得。
实施例3：三阶段差异化补料高密度发酵培养植物乳杆菌Kmust-Li01
（1）植物乳杆菌高密度发酵MRS液体培养基组分及含量
蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠 5g/L、硫酸镁 0.58g/L、硫酸锰 0.25g/L、吐温80 1mL/L；配制发酵培养基，使培养基降到培养所需温度；
（2）将已冷冻保存的植物乳杆菌Kmust-Li01在MRS琼脂平板培养基上活化三次，挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37℃培养18h后，以接种量为5.0%转接于MRS液体培养基，37℃培养12h后作为种子液；
（3）以5.0%的接种量将步骤（2）种子液接种于步骤（1）的发酵培养基中在37℃、pH6.2～6.4、转速150rpm搅拌、溶氧量小于1%条件下发酵，发酵过程维持pH值为6.2~6.4，当pH超过6.2时，补加葡萄糖液；当pH低于6.4时补加碱性中和剂氨水或氢氧化钠；发酵过程不通气，发酵过程中通过添加葡萄糖溶液进行补料，葡萄糖溶液浓度为1000g/L，葡萄糖补料方式为：当发酵培养8h，葡萄糖残留量为0.04％时，以8mL/L·h的速率开始补充葡萄糖溶液，发酵培养至12h后，葡萄糖残留量为0.12％时，以15mL/L·h速率补充葡萄糖溶液，继续发酵至18h后，葡萄糖残留量为0.13％时，以10mL/L·h速率补充葡萄糖溶液，继续发酵1 h结束，完成发酵，发酵液中植物乳杆菌Kmust-Li01活菌数为1.2×1011cfu/mL。
实施例4：四阶段差异化补料高密度发酵培养植物乳杆菌
（1）植物乳杆菌高密度发酵MRS液体培养基组分及含量
蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠 5g/L、硫酸镁 0.58g/L、硫酸锰 0.25g/L、吐温80 1mL/L；配制发酵培养基，使培养基降到培养所需温度；
（2）将已冷冻保存的植物乳杆菌Kmust-Li01在MRS琼脂平板培养基上活化三次，挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37℃培养18h后，以接种量为5.0%转接于MRS液体培养基，37℃培养12h后作为种子液；
（3）以5.0%的接种量将步骤（2）种子液接种于步骤（1）的发酵培养基中在37℃、pH6.2～6.4、转速150rpm搅拌、溶氧量小于1%条件下发酵，发酵过程维持pH值为6.2~6.4，当pH超过6.2时，补加葡萄糖液；当pH低于6.4时补加碱性中和剂氨水或氢氧化钠；发酵过程不通气，发酵过程中通过添加葡萄糖溶液进行补料，葡萄糖溶液浓度为1000g/L，葡萄糖补料方式为：发酵培养7h，葡萄糖残留量为0.05％时，以6mL/L·h的速率开始补料，发酵培养至12h，葡萄糖残留量为0.13％时，以12mL/L·h速率补料，发酵至15h后，葡萄糖残留量为0.05％时，以18mL/L·h速率补料，继续发酵至17h后，葡萄糖残留量为0 .12％时，以10mL/min速率补料，继续发酵1.5h结束，发酵液中植物乳杆菌Kmust-Li01活菌数为1.9×1011cfu/mL。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 一株植物乳杆菌及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1095
<212> DNA
<213> 猪(Sus)
<400> 1
gcgggggcgg gcgtgctata catgcaagtc gaacgaactc tggtattgat tggtgcttgc 60
atcatgattt acatttgagt gagtggcgaa ctggtgagta acacgtggga aacctgccca 120
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
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<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
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