具体实施方式

以下结合实施例进一步详述本发明。

本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell， David W.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor）。

各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

本发明中所用引物由江苏金唯智生物技术有限公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施案例1：谷氨酸棒杆菌Cgl-M19的筛选和鉴定

筛选样品取自天津汉沽根际土壤样品。

分离过程：称取2 g土壤样品，放入盛有30 mL无菌水的三角瓶中，于30℃，180rmp震荡30min, 取1mL土壤悬液进行梯度稀释10^-1-10^-7，然后取10^-5，10^-6，10^-7三个稀释度涂布至含有甘露糖的富集培养基M中（甘露糖：5g/L; 琼脂：15g/L; (NH₄)₂SO₄(5g/L),尿素 (5g/L), KH₂PO₄ (1g/L), K₂HPO₄ (1g/L), MgSO₄∙7H₂O (0.25g/L), CaCl₂ (10mg/L), FeSO₄∙7H₂O (10mg/L), MnSO₄∙H₂O (0.1mg/L), ZnSO₄∙7H₂O (1mg/L), CuSO₄∙5H₂O (0.2mg/L),NiCl₂∙6H₂O (20μg/L), 生物素 (0.4mg/L), MOPS (42g/L) ,pH调至7.4），于28℃倒置培养1-3天。

纯化过程：将在富集培养基M平板上生长起来的菌落，在另一含有甘露糖的富集培养基中进行划线培养。连续富集5次后，进行涂板画线。

菌株比较：经过连续富集获得了12株可利用甘露糖的菌株，将这12株菌株接种至以甘露糖为唯一碳源的基本盐培养基（甘露糖：10g/L; (NH₄)₂SO₄(5g/L),尿素 (5g/L),KH₂PO₄ (1g/L), K₂HPO₄ (1g/L), MgSO₄∙7H₂O (0.25g/L), CaCl₂ (10mg/L), FeSO₄∙7H₂O(10mg/L), MnSO₄∙H₂O (0.1mg/L), ZnSO₄∙7H₂O (1mg/L), CuSO₄∙5H₂O (0.2mg/L), NiCl₂∙6H₂O (20μg/L), 生物素 (0.4mg/L), MOPS (42g/L) ,pH调至7.4）中，发酵48h，比较不同菌株最终生物量。

最终，筛选获得了菌株M19，该菌株表现出比较优异的菌体生物量，对该菌株进行16S rDNA测序，依据基因序列分析，将该菌株鉴定为谷氨酸棒状杆菌属（Corynebacterium glutamicum），并将其命名为谷氨酸棒杆菌Cgl-M19。

谷氨酸棒杆菌Cgl-M19菌株已于2021年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.22679。

实施案例2：谷氨酸棒杆菌Cgl-M19发酵代谢甘露糖

（1）Cgl-M19活化

将保藏于甘油管中的菌株Cgl-M19在自制固体培养基平板上划线，培养48h进行活化。自制固体培养基按如下组成配制：CGXII培养基，甘露糖10g/L，琼脂15 g/L，pH=7.0，121℃高压蒸汽下灭菌20 min。

（2）Cgl-M19种子液获得

挑取自制固体培养基上的Cgl-M19单菌落，接种于装有10-30 mL 发酵培养基的100 mL三角瓶中，培养温度为30℃，置于转速为150-230 rpm的摇床上培养12-16 h至对数期后期即可（图1）。发酵培养基按如下组成配制：CGXII培养基，甘露糖10g/L，pH=7.0，121℃高压蒸汽下灭菌20 min。

（3）Cgl-M19发酵代谢甘露糖

在装有50-100 mL发酵培养基M的250 mL三角瓶中接入0.5%-3%种子液，培养温度为30℃，置于摇床转速为150-230 rpm的摇床上培养24-48 h，发酵过程中取不同时间样品，测定其菌体密度OD₆₀₀，并绘制生长曲线和甘露糖消耗曲线。

结果发现，Cgl-M19发酵甘露糖具有较高的利用效率。

实施案例3：构建谷氨酸棒杆菌重组菌株Cgl-GM

具体包括以下步骤：

（1）构建重组载体pEC-ManB-ManC

根据谷氨酸棒杆菌来源的甘露糖6-磷酸变位酶（ManB）和甘露糖1-磷酸糖基转移酶（ManC）的核苷酸序列设计引物，以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，PCR扩增获得manB和manC基因，通过限制性酶切连接方法，连接至载体pEC-XK99E中，得到重组质粒pEC-ManB-ManC。

（2）通过电转化方法向谷氨酸棒杆菌重组菌株Cgl-M19中导入重组载体pEC-ManB-ManC，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株Cgl-GM。

实施案例4：谷氨酸棒杆菌Cgl-GM发酵甘露糖合成GDP-甘露糖

选用培养基（CGXII），培养基中添加20g/L甘露糖，在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌重组菌株Cgl-20进行培养，发酵24h后，对样品进行收集，检测GDP-甘露糖含量。

HPLC检测方法：采用色谱柱Inertsil ODS-SP和紫外检测器，流动相为A: (20 mM三乙胺乙酸，pH 6.0)；B：乙腈；采用梯度洗脱方式：首先，采用100%的流动相A，10min；其次，流动相B采用线性梯度0-4%，10min；再次，流动相B线性梯度4%-0%；最后，100%流动相A，25min；流动相流速为0.6 毫升/分钟；紫外检测波长为254 nm。

经HPLC检测，GDP-甘露糖含量最高达到10.4±1.9毫克每克细胞干重。

实施案例5：构建谷氨酸棒杆菌重组菌株Cgl-GF

具体包括以下步骤：

（1）构建重组载体pXMJ19-Gmd-WcaG

根据大肠杆菌来源的GDP-甘露糖4,6-脱水酶（Gmd）和GDP-岩藻糖合成酶（WcaG）的核苷酸序列设计引物，以大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增获得gmd和wcaG基因，通过限制性酶切连接方法，连接至载体pXMJ19中，得到重组质粒pXMJ19-Gmd-WcaG。

（2）通过电转化方法向谷氨酸棒杆菌重组菌株Cgl-M19中导入重组载体pEC-ManB-ManC和pXMJ19-Gmd-WcaG，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株Cgl-GF。

实施案例6：谷氨酸棒杆菌Cgl-GF发酵甘露糖合成GDP-岩藻糖

选用培养基（CGXII），培养基中添加20g/L甘露糖，在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌重组菌株Cgl-GF进行培养，发酵24h后，对样品进行收集，检测GDP-岩藻糖含量。

HPLC检测方法：采用色谱柱Inertsil ODS-SP和紫外检测器，流动相为A: (20 mM三乙胺乙酸，pH 6.0)；B：乙腈；采用梯度洗脱方式：首先，采用100%的流动相A，10min；其次，流动相B采用线性梯度0-4%，10min；再次，流动相B线性梯度4%-0%；最后，100%流动相A，25min；流动相流速为0.6 毫升/分钟；紫外检测波长为254 nm。

经HPLC检测，GDP-岩藻糖含量达到6.3±1.2 毫克每克细胞干重。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一株谷氨酸棒杆菌株及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1377

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 1

atgcgtaccc gtgaatctgt cacagctgta attaaggcgt atgacgtccg tggtgttgtt 60

ggtgtcgata ttgatgctga tttcatttct gagactggcg ctgcctttgg tcggctcatg 120

cgtagtgagg gtgaaaccac cgttgctatt ggccatgaca tgcgtgattc ctcccctgaa 180

ttggccaagg cgtttgccga tggcgtgact gcacagggtt tggatgttgt tcatttggga 240

ctgacttcta ctgatgagct gtactttgcg tccggaacct tgaagtgtgc tggtgcgatg 300

tttactgcgt cgcataaccc cgctgagtac aacggcatca agttgtgtcg tgcgggtgct 360

cgtccggtcg gtcaggattc tggtttggcc aacatcattg atgatctggt tgagggtgtt 420

ccagcgtttg atggtgagtc aggttcggtt tctgagcagg atttgctgag cgcatatgcc 480

gagtacctca atgagcttgt tgatctgaag aacatccgcc cgttgaaggt tgctgtggat 540

gcggcaaacg gcatgggtgg gttcactgtc cctgaggtat tcaagggtct gccacttgat 600

gttgcgccac tgtattttga gcttgacggc aatttcccca accatgaggc caatcctctg 660

gagcctgcca acctggttga tttgcagaag tttaccgtag agaccggatc tgatatcggt 720

ttggcgttcg acggcgatgc ggatcgttgc ttcgtggtcg atgagaaggg ccagccagtc 780

agcccttcgg cgatctgtgc gatcgtagcg gagcgttact tggagaagct tccgggttcc 840

accatcatcc acaacctgat tacctctaag gctgtgcctg aggtgattgc tgaaaacggt 900

ggcactgcgg tgcgtactcg cgtgggtcac tccttcatca aggcgaagat ggcagagacc 960

ggtgcggcct ttggtggcga gcactctgcg cactactact tcactgagtt cttcaatgcg 1020

gactccggca ttttggctgc gatgcacgtg ctggctgcgc tgggaagcca ggaccagcca 1080

ctcagtgaga tgatggctag gtataaccgg tacgttgctt caggcgagtt gaactcccgt 1140

ttggctaatg cagaggcgca gcaagagcgc acccaggctg tgctcgatgc gttcgctgat 1200

cgcaccgagt ccgtggacac ccttgacggc gtgactgtgg aactcaagga cacctccgcg 1260

tggttcaacg tgcgtgcgtc caacaccgag ccgctgcttc gcctcaatgt tgaagctgca 1320

tcgaaggaag aagtcgatgc gttggtagcg gagattctag ggattatccg cgcataa 1377

<210> 2

<211> 1089

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 2

atgactttaa ctgacaacag caaaaacgtt gatgctgtca tcttggtcgg tggcaaaggt 60

acccgactgc gccccctgac cgtcaatact ccaaagccaa tgctgccaac tgctggccac 120

ccattcttga cccacctttt ggcccgcatc aaggccgcag gcatcacaca cgtcgtgctg 180

ggaacgtcat tcaaagctga agtcttcgag gaatacttcg gagatggctc cgaaatgggc 240

ttggaaattg aatatgtcgt cgaggatcag cctttgggca ctggtggtgg catccgaaac 300

gtctacgaca agctgcgtca cgatactgcg attgtgttca acggcgatgt gctctccggt 360

gcggatctca acagcattct ggacacccac cgcgaaaagg acgcagatct gaccatgcat 420

ctcgtgcgcg tagctaaccc tcgtgcgttt ggttgcgtcc ccaccgatga ggatggtcgc 480

gtcagcgaat tccttgaaaa gaccgaagat ccaccaaccg atcagatcaa cgccggctgc 540

tacgtgttca agaaggaact catcgagcag atcccggcag gccgagcagt ttccgtcgag 600

cgcgaaacct tccctcagct gttggaagaa ggcaagcgag tcttcggcca cgtcgacgct 660

tcctactggc gcgacatggg caccccaagc gacttcgtcc gcggctcggc tgacctggtc 720

cgcggcattg cgtactcccc attgctcgaa ggcaaaacag gagagtcgct tgtcgacgcc 780

tccgccggcg ttcgcgacgg cgtcctgctg ctcggcggaa ccgtagtcgg ccgcggcact 840

gagatcggtg ccggctgccg cgttgacaac actgttattt tcgacggcgt caccattgaa 900

ccaggtgcgg tcattgaaaa ttccatcatt tcctcgggag cacgcatcgg tgctaatgcg 960

cacatctccg gttgcatcat tggcgagggc gcacaggttg gtgctcggtg tgaactcaac 1020

gcagggatgc gcgtcttccc aggcgttgtg atcccagaca gcggaattcg tttttcgtct 1080

gatcagtag 1089

<210> 3

<211> 1122

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 3

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ggtgatgtga ttatcgctgt tgacccgcgt tacttccgtc cggctgaagt tgaaacgctg 960

ctcggcgacc cgaccaaagc gcacgaaaaa ctgggctgga aaccggaaat caccctcaga 1020

gagatggtgt ctgaaatggt ggctaatgac ctcgaagcgg cgaaaaaaca ctctctgctg 1080

aaatctcacg gctacgacgt ggcgatcgcg ctggagtcat aa 1122

<210> 4

<211> 966

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 4

atgagtaaac aacgagtttt tattgctggt catcgcggga tggtcggttc cgccatcagg 60

cggcagctcg aacagcgcgg tgatgtggaa ctggtattac gcacccgcga cgagctgaac 120

ctgctggaca gccgcgccgt gcatgatttc tttgccagcg aacgtattga ccaggtctat 180

ctggcggcgg cgaaagtggg cggcattgtt gccaacaaca cctatccggc ggatttcatc 240

taccagaaca tgatgattga gagcaacatc attcacgccg cgcatcagaa cgacgtgaac 300

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gaaagcgagt tgttgcaggg cacgctggag ccgactaacg agccttatgc tattgccaaa 420

atcgccggga tcaaactgtg cgaatcatac aaccgccagt acggacgcga ttaccgctca 480

gtcatgccga ccaacctgta cgggccacac gacaacttcc acccgagtaa ttcgcatgtg 540

atcccagcat tgctgcgtcg cttccacgag gcgacggcac agaatgcgcc ggacgtggtg 600

gtatggggca gcggtacacc gatgcgcgaa tttctgcacg tcgatgatat ggcggcggcg 660

agcattcatg tcatggagct ggcgcatgaa gtctggctgg agaacaccca gccgatgttg 720

tcgcacatta acgtcggcac gggcgttgac tgcactatcc gcgagctggc gcaaaccatc 780

gccaaagtgg tgggttacaa aggccgggtg gtttttgatg ccagcaaacc ggatggcacg 840

ccgcgcaaac tgctggatgt gacgcgcctg catcagcttg gctggtatca cgaaatctca 900

ctggaagcgg ggcttgccag cacttaccag tggttccttg agaatcaaga ccgctttcgg 960

gggtaa 966