具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pET28a(+)载体：Novagen公司。

小肠结肠炎耶尔森氏菌52212记载于文献：张昕,张惠媛,汪琦,et al.小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测[J].检验检疫科学,2008,18(6):23-26.；公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。小肠结肠炎耶尔森氏菌52212经检测为O:9血清群小肠结肠炎耶尔森氏菌。

牛种布鲁氏菌疫苗株A19记载于文献：谭鹏飞[1],南文龙[1],彭大新[2],et al.中国牛种布鲁氏菌疫苗株A19SNP位点的研究[J].中国兽药杂志,2014,48(7):1-5.；公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。

实施例1、表达载体构建

一、表达载体pET28-tacpglL-tacCTB4573的构建

1、人工合成SEQ ID No.1所示的DNA分子。SEQ ID No.1中，自5’端第1-6位核苷酸为XbaI识别位点，第105-2240位核苷酸为脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶PglL表达盒的序列，其中，第105-133位核苷酸为tac启动子的序列，第180-1994位核苷酸为脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶PglL的编码序列(编码SEQ ID No.2所示的蛋白质)，第2475-2480位核苷酸为SacI识别序列，第2486-2491位核苷酸为XhoI识别位点。

2、用XbaI和XhoI酶切SEQ ID No.1所示的DNA分子，得到基因片段；用XbaI和XhoI酶切pET28a(+)载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组载体pET28-tacpglL。根据测序结果，对重组载体pET28-tacpglL描述如下：将pET28a(+)载体的XbaI和XhoI酶切位点间的片段替换为了SEQ ID No.1自5’端第7-2485位所示的DNA分子。

3、人工合成SEQ ID No.3所示的DNA分子。SEQ ID No.3中，自5’端第1-6位核苷酸为Sac I识别位点，103-131位核苷酸为tac启动子的序列，178-645位为重组蛋白rCTB4573的编码序列(编码SEQ ID No.4所示的蛋白质)，第1069-1074位为XhoI识别序列。

SEQ ID No.4中，自N端起第1位至第19位为DsbA信号肽序列，第20至第122位CTB(霍乱毒素B亚单位)的氨基酸序列，第123至第127位为柔性linker，第128至第156位为脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的第45至73位氨基酸。所述脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE第63位的丝氨酸(即SEQ ID No.4第146位)为脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶PglL识别的糖基化位点。

4、利用引物SacI-UP和引物XhoI-Down组成的引物对扩增SEQ ID No.3所示的DNA分子，然后用SacI和XhoI分别双酶切扩增产物得到DNA片段；用SacI和XhoI双酶切重组载体pET28-tacpglL，得到载体大片段；将各基因片段分别与载体大片段连接，得到重组质粒，命名为pET28-tacpglL-tacCTB4573。

SacI-UP：5’-gagctctgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactc-3’；

XhoI-Down:5’-ctcgagcggccatcgatggaaaactgcagggcagtt-3’。

根据测序结果，对重组质粒pET28-tacpglL-tacCTB4573描述如下：将重组载体pET28-tacpglL的SacI和XhoI酶切位点间的片段替换为了SEQ ID No.3自5’端第7-1068位所示的DNA分子。

二、表达载体pET28-tacCTB4573的构建

利用引物XbaI-UP和引物XhoI-Down组成的引物对扩增SEQ ID No.3所示的DNA分子，然后用XbaI和XhoI分别双酶切扩增产物得到DNA片段(SEQ ID No.5)；该片段与SEQ IDNo.3唯一的不同在于其5，端第1-6位核苷酸为Xba I识别位点，其他均相同，编码重组蛋白rCTB4573，作为对照。用XbaI和XhoI酶切pET28a(+)载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组载体pET28-tacCTB4573。

XbaI-UP：5’-tctagatgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactc-3’；

XhoI-Down:5’-ctcgagcggccatcgatggaaaactgcagggcagtt-3’。

根据测序结果，对重组质粒pET28-tacCTB4573描述如下：将pET28a(+)载体的XbaI和XhoI酶切位点间的片段替换为了SEQ ID No.5自5’端第7-1068位所示的DNA分子。

实施例2、重组菌的构建

一、小肠结肠炎耶尔森氏菌52212的感受态细胞的制备

将小肠结肠炎耶尔森氏菌52212划线于BHI固体培养基平板，于25℃恒温箱培养24h，挑单克隆接种于5mL BHI液体培养基，于25℃摇床，220rpm/min过夜培养。将菌液1:100接种于50mL液体BHI培养基，25℃，220rpm/min培养4-5h，使菌液OD₆₀₀达到0.5-0.6左右，将菌液置于冰上冰浴20min。于4℃，5000×g/min，10min离心收集菌体，用预冷灭菌10％甘油重悬菌体，再次离心，弃去上清，再重复此步骤三遍。最后一次弃去上清后，用500μL的10％甘油将菌体重悬，50μL/管分装感受态，可于-80℃保存。

二、重组菌的构建

将重组质粒pET28-tacpglL-tacCTB4573通过电转化法导入步骤一构建的感受态细胞中，加入800μL BHI液体培养基，于25℃摇床，220rpm/min培养4h，全部涂布终浓度为50μg/mL的Kan(卡那霉素)抗性BHI固体培养平板。于25℃恒温箱培养24h。长出的单克隆即为52212/pET28-tacpglL-tacCTB4573。

将重组质粒pET28-tacCTB4573通过电转化法导入步骤一构建的感受态细胞中，加入800μL BHI液体培养基，于25℃摇床，220rpm/min培养4h，全部涂布终浓度为50μg/mL的Kan(卡那霉素)抗性BHI固体培养平板。于25℃恒温箱培养24h。长出的单克隆即为52212/pET28-tacCTB4573。

实施例3、蛋白质的表达、纯化及检测

一、蛋白表达

待测菌株：52212/pET28-tacpglL-tacCTB4573、52212/pET28-tacCTB4573、小肠结肠炎耶尔森氏菌52212。

1、将待测菌株52212/pET28-tacpglL-tacCTB4573、52212/pET28-tacCTB4573接种于5mL终浓度为50μg/mL的Kan液体BHI培养基中，小肠结肠炎耶尔森氏菌52212接种于无抗性的液体BHI培养基中，25℃、220rpm/min过夜培养，次日按照1:100的体积比分别转接于5mL终浓度为50μg/mL的Kan液体BHI培养基和无抗性的液体BHI培养基，25℃、220rpm/min培养4-5h，使菌液OD₆₀₀达到0.6-0.8左右。

2、完成步骤1后，向培养体系中加入5μL IPTG，继续于25℃过夜培养，然后取1.5ml细菌培养液5000×g/min离心10min收集菌体，用100μL ddH₂O重悬菌体。

3、向步骤2重悬得到的菌液中加入100μL 2×SDS Loading Buffer(32g SDS，6.17g DTT，0.4g溴酚蓝，160mL甘油，100mL 1mol/LpH6.8 Tris-HCl，ddH2O定容至1L)，充分混匀，沸水浴10min。然后8000×g/min，10min离心，取上清液。

4、取10μL步骤3得到的上清液作为待测样品，用12％SDS-PAGE胶进行电泳，待溴酚蓝出胶后，经考马斯亮蓝染色液(1.2g G-250，510mL 40％硫酸铵，408mL无水甲醇，36mL磷酸，ddH2O定容至1L)染色24h，再用脱色液(体积浓度为0.5％的冰醋酸溶液)脱色24h。同样的样品经12％SDS-PAGE胶电泳后，用Bio-RadWB转膜仪经15V，1h转至PVDF膜，用鼠源HRP-Anti-His tag单克隆抗体(抗体为Abmart产品，货号：M20020)检测。

结果如图1所示。结果表明，全菌样品经SDS-PAGE后进行WB检测，在共表达PglL和CTB4573时，细菌的O-抗原多糖在糖基转移酶PglL催化下转移到载体蛋白CTB4573(多糖和载体蛋白CTB4573通过共价键连接于糖基化位点上)，因此WB图中可以看到条带可以看到分子量大小的向上迁移，另外，由于细菌多糖为串联重复结构，且O:9血清群小产结肠炎耶尔森氏菌的O-抗原多糖为同聚物，因此呈现出35-40kDa处的条带，表明蛋白被糖基化，结合了细菌多糖，而在对照组无PglL的载体作为对照时只有载体蛋白表达，大小约为15kDa，略低于糖基化蛋白，说明表达PglL时，底物蛋白已经被完全糖基化；不表达任何载体的小肠结肠炎耶尔森氏菌52212则无任何条带。

二、糖蛋白纯化

1、将52212/pET28-tacpglL-tacCTB4573接种7L液体BHI培养基，25℃、220rpm/min培养至菌液OD₆₀₀达到0.6-0.8左右。

2、完成步骤1后，按照每1L培养体系中加入1mL 1M/L IPTG的浓度进行诱导，继续于25℃过夜培养，然后5000×g/min离心10min收集菌体。

3、用约200mL的BufferA1(100mL 5mol/LNaCl，20mL 1mol/LpH7.5 Tris-HCl，10mL1mol/L咪唑，蒸馏水定容至1L，用浓HCI调pH至7.0)重悬步骤2得到的菌体，冰水浴中超声破菌(超5s，停5s，超声时间为3小时)，之后，8,000×g/min，4℃离心10min收取上清液，并重复一次。上清液即为样品。

4、取步骤3获得的样品进行纯化，具体方法如下：

(1)安装镍柱(镍柱填料为GE Healthcare产品，货号：42068700)，打开液相色谱仪，设置流速为4mL/min，首先用0.5M NaOH溶液冲洗4-5个柱体积；再用蒸馏水冲洗柱床至pH为中性，并稳定5个柱体积左右；用0.5M NiSO₄冲洗3个柱体积左右，再次重复用蒸馏水冲洗柱床至pH为中性，并稳定5个柱体积左右；用Buffer B1(100mL 5mol/L NaCl，20mL 1mol/L pH7.5 Tris-HCl，500mL 1mol/L咪唑，蒸馏水定容至1L，用浓HCl调pH至7.0)冲洗柱床，约1-2个柱体积，最后用Buffer A1平衡柱床，约5个柱体积。将样品上样，至完全通过镍柱。继续用Buffer A1冲洗柱床至紫外吸收值和和离子强度值降低至稳定后，继续洗脱5-6个柱体积。之后用Buffer B1进行洗脱，收集洗脱液进行验证并用截留分子量为10kDa的超滤管(超滤管为Merk公司产品，货号为：UFC901096)于4000×g离心进行浓缩，终体积为10mL以内。

(2)将步骤(1)浓缩后的洗脱液经分子筛(填料为Superdex^TM200 prep grade，为GEHealthcare产品，货号：10270287)进一步分离，流动相为1×PBS(8g NaCl，1.44g Na₂HPO₄，0.2g KCI，0.24g KH₂PO₄，用蒸馏水定容至1L)。收集紫外吸收值明显升高时的流出液，经SDS-PAGE分离并进行考马斯亮蓝染色验证。

结果如图2所示。图2中，左图为分子筛出峰时间，右图为出峰时收取样品的考马斯亮蓝染色结果。结果显示，糖蛋白在上样后100mL左右时出峰，峰值处为120mL左右，纯化后可收取得到较纯的糖蛋白。收集纯度较高的样品进行浓缩并糖定量，将纯化的糖蛋白命名为C-OPS_Ba。

对纯化的糖蛋白C-OPS_B进行定量，定量方式如下：用蒸馏水配置100mg/mL的葡萄糖溶液，用蒸馏水1：1000稀释为100μg/mL的葡萄糖溶液作为母液。用移液枪吸取50、100、200、300、400、600和800μL葡萄糖母液加入小试管，依次加入950、900、800、700、600、400和200μL蒸馏水，即为浓度为5、10、20、30、40、60和80μg/mL的葡萄糖标准溶液，并用移液枪吸取1mL蒸馏水加入小试管，即为浓度为0的标准品。将糖蛋白等样品用蒸馏水适当稀释，终体积为1mL加入小试管。快速加入4mL 2mg/mL的蒽酮-硫酸溶液，之后马上插入冰中冰浴，直至液体完全冷却。盖上试管帽，将试管置于沸水浴10min，拿出后再次冰浴，直至液体降至室温。200μL/孔将标准品和样品加入96孔板，用分光光度计(酶标仪)于620nm处读数，根据结果绘制标准品浓度-吸光值曲线，根据标准曲线计算样品浓度，其中标准曲线R2﹥0.99时方可用于样品浓度计算。

糖蛋白纯化后糖定量结果为44.74μg/mL。平均收率约为150μg糖/L培养基。

三、糖蛋白特异性及大小表征

将步骤二制备的糖蛋白与2×SDS Loading Buffer 1:1混合并沸水浴10min，经SDS-PAGE后，分别进行考马斯亮蓝染色和WB，使用鼠源HRP-Anti-His tag单克隆抗体(抗体为Abmart产品，货号：M20020)检测。同时为了证明糖蛋白中的多糖对牛种布鲁氏菌和O:9血清群小肠结肠炎耶尔森氏菌的血清均有交叉，使用牛种布鲁氏菌单克隆抗体(抗体为Thermo Fisher产品，货号：TD2548562)和O:9血清群小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体(抗体为Fitzgerald产品，货号：10R-Y100a)进行WB。

结果如图3A所示，结果显示，纯化后的糖蛋白可以清晰地看出较大的糖基化条带，除去了大部分杂蛋白，且该糖蛋白可以与牛种布鲁氏菌(Anti B.a)和O:9血清群小肠结肠炎耶尔森氏菌(Anti Y.e)的血清交叉反应，表现出35-40kDa处糖基化条带，较低的糖蛋白条带没有显示，这可能是因为低分子量的糖蛋白中多糖结合较少。

由于SDS-PAGE胶会使聚体蛋白解聚，而CTB在天然状态下呈五聚体形式，为了验证糖基化后的CTB是否也以聚体形式存在，使用非还原电泳进行验证，并进行考马斯亮蓝染色。

结果如图3B所示。结果显示，糖蛋白的大小约为242kDa左右，单体大小为35-40kDa左右，这说明底物蛋白CTB经糖基化后，仍然以聚体形式存在。

四、LPS和OPS提取

1、将小肠结肠炎耶尔森氏菌52212划线于BHI平板，25℃培养24h，挑取单克隆接种于5mLBHI液体培养基，25℃、220rpm/min过夜培养。

2、完成步骤1后，将菌液1:100接种于1L BHI液体培养基，25℃、220rpm/min培养16-18h，6000×g/min，4℃离心10min收取菌体。

3、完成步骤2后，用冰上预冷的蒸馏水重悬菌体，再次于6000×g/min，4℃离心10min，弃去上清，重复此步骤三次。最后一次弃去上清后称量菌体湿重(g)，用3倍于菌体湿重的蒸馏水重悬菌体，冰浴3min，立刻置于68℃水浴3min，重复此步骤三次。

4、完成步骤3后，加入相同体积的90％苯酚，于68℃水浴锅，220rpm/min震荡30min，10000×g/min，4℃离心15min，吸取上层水相。在剩余的沉淀和酚相部分中加入与吸取的水相体积相同的蒸馏水，剧烈震荡混匀，重复上一步骤，将两次收取的水相混合，加入截留分子量为3500Da的透析袋，用蒸馏水透析三天去除苯酚，每8h换一次水。所得即为粗提的LPS。在LPS中加入终浓度为5μg/mL的DNase和1μg/mL的RNase，37℃孵育3h，再加入终浓度为10μg/mL的Proteinase K，68℃孵育1h，最后沸水浴10min，所得即为较纯的LPS。

5、向步骤4得到的LPS中加入终浓度为1％(体积百分含量)的冰醋酸，沸水浴90min，用NaOH溶液调pH为7.0，然后40000×g/min离心5h，收取上清，即为OPS。

6、对步骤4和步骤5所得的LPS和OPS进行糖定量。

小肠结肠炎耶尔森氏菌52212的LPS定量结果为447.30μg/mL，OPS定量约为204.31μg/mL，并命名为OPS_Ba。

实施例4、动物免疫实验

实验动物：SPF级雌性5-6周龄BALB/c小鼠，购自维通利华公司。

1、将实施例3制备的C-OPS_Ba和OPS_Ba分别用1×PBS稀释至浓度为2.5μg/100μL，得到C-OPS_Ba溶液和OPS溶液。

2、分别向步骤1得到的C-OPS_Ba溶液和OPS_Ba溶液中加入氢氧化铝佐剂(Invivo Gen产品，货号：5569)，得到C-OPS_Ba+Al溶液和OPS_Ba+Al溶液。氢氧化铝佐剂在到C-OPS_Ba+Al溶液和OPS_Ba+Al溶液中的体积百分含量为10％。

3、将实验动物10只/笼分笼饲养，在第1天(一免)、第15天(二免)、第29天(三免)通过腹腔注射的方式，对小鼠按照如下分组给药，每组20只小鼠。

PBS组：每只小鼠100μL 1×PBS。

OPS_Ba组：每只小鼠100μL OPS_Ba溶液。

OPS_Ba+Al组：每只小鼠100μL OPS_Ba+Al溶液。

C-OPS_Ba组：每只小鼠100μL C-OPS_Ba溶液。

C-OPS_Ba+Al组：每只小鼠100μL C-OPS_Ba+Al溶液。

4、血清效价检测

于步骤3中三免后的第10天，每组取10只小鼠尾血分离血清。以牛种布鲁氏菌疫苗株A19的LPS(LPS制备方法同实施例3中LPS的制备方法)包被96孔板，HRP标记的驴抗鼠IgG为二抗(抗体为Abcam产品，货号为GR160830-14)，进行ELISA测定小鼠血清效价。

结果如图4所示。结果显示，与PBS组相比，OPS_Ba组与C-OPS_Ba(有佐剂和无佐剂)免疫组血清中针对A19株LPS的IgG效价均有显著升高，C-OPS_Ba组升高更为显著，且与OPS_Ba组有一定的差异，但有无佐剂对血清效价基本无影响。

5、非致死剂量A19感染后血清炎症因子测定

将牛种布鲁氏菌疫苗株A19划线于TSA平板，37℃恒温箱培养2-3天，挑取单克隆接种于5mL TSB液体培养基，37℃、220rpm/min培养24h，然后1：100转接于5mLTSB液体培养基，37℃、220rpm/min培养9-10h，至OD₆₀₀为2.0，将菌液梯度稀释涂布TSA固体培养基，于37℃恒温箱培养3天后计数，推算菌液浓度。根据菌液浓度，准备雌性7-8周龄BALB/c小鼠分组进行攻毒实验，摸索A19对小鼠的致死剂量和最大非致死剂量，具体方法如下：将15只BALB/c小鼠分为3只/笼(组)，根据测定的菌液浓度，将菌液稀释为10⁵、10⁶、10⁷、10⁸和10⁹CFU/200μL，分组经小鼠腹腔注射不同浓度的菌液，每只200μL，观察7天内小鼠的存活情况。

结果显示10⁷CFU/每只小鼠是对小鼠不致死的最大剂量，10⁹CFU/每只小鼠为对小鼠致死的最小剂量。在此范围内对剂量进一步平均细分为5个浓度(10⁷、5×10⁷、10⁸、5×10⁸、10⁹CFU/200μL)，将40只8周龄的BALB/c小鼠分为8只/笼(组)，按照细分的浓度稀释菌液经腹腔攻毒，每只小鼠200μL，观察7天内小鼠的存活情况。得到小鼠半数致死量(LD₅₀)约为5×10⁷CFU/每只小鼠，致死量约为1×10⁸CFU/每只小鼠。

于步骤3中三免后的第14天，对每组10只的小鼠经腹腔注射非致死剂量(1.03×10⁷CFU/每只小鼠)的牛种布鲁氏菌疫苗株A19，于感染后第0、1、3、5和7天，每天取3只小鼠尾血，用小鼠TNF-α预包被ELISA试剂盒(达科为公司，货号：1217202)测定血清中TNF-α的表达水平。

结果如图5所示。结果显示，感染后第0天和第1天，各组TNF-α表达水平均无明显变化，第三天开始，PBS、OPS_Ba(加佐剂和不加佐剂)及C-OPS_Ba加佐剂组TNF-α表达水平均升高，且与C-OPS_Ba无佐剂组有显著性差异，至第五天达到最高值，这一差异持续到第7天。在这一过程中，C-OPS_Ba无佐剂组的TNF-α表达水平一直稳定基本无明显升高，说明感染A19后，C-OPS_Ba无佐剂组的小鼠可以迅速清除细菌，减少炎症因子的表达。

6、非致死剂量A19感染后脾脏载菌量测定

在步骤5中感染A19后的第7天，每组取5只小鼠解剖，取小鼠脾脏进行称量，并浸泡于1mL生理盐水，用细胞筛网研磨匀浆。6000×g/min，10min离心弃上清，收集脾脏沉淀，加入1mL生理盐水重悬沉淀，重复此步骤一次，最后用无菌的质量浓度为0.1％的去氧胆酸钠溶液重悬沉淀，梯度稀释后涂布TSA固体培养基，于37℃恒温箱培养3天后计数，计算每只小鼠的脾脏载菌量。

结果如图6所示。图6中，左图为小鼠脾脏重量，Control组为正常小鼠脾脏重量，与正常小鼠的脾脏相比，感染A19后各组小鼠的脾脏重量均有增加，但C-OPS_Ba(有佐剂和无佐剂)组重量增加最少，与其他组有显著性差异，OPS_Ba(有佐剂和无佐剂)组重量增加最多。右图为小鼠脾脏载菌量的结果，C-OPS_Ba(有佐剂和无佐剂)组脾脏载菌量为10^3.0-10^3.5/脾左右，其他组均为10^4.0-10^4.5/脾左右，有显著性的差异。因此可以说明用C-OPS_Ba免疫小鼠后，小鼠可以在感染后有效地清除体内的牛种布鲁氏菌，降低细菌对机体的损害。

7、致死剂量A19攻毒后小鼠保护性评价

于步骤3中三免后的第14天，对每组10只小鼠腹腔注射致死剂量(实际攻毒剂量为1.54×10⁸CFU/每只小鼠，3×LD₅₀)的A19，观察每组小鼠的存活情况。

结果如图7所示，当用致死剂量的A19攻毒后，PBS组小鼠在两天内全部死亡，OPS_Ba不加佐剂和加佐剂组存活率分别为60％和30％，C-OPS_Ba(有佐剂和无佐剂)组存活率均为100％，说明C-OPS_Ba确实可以在免疫小鼠体内产生针对牛种布鲁氏菌的保护性，且不需要佐剂。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 牛种布氏杆菌病多糖结合疫苗及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2491

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctagaactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc gttctggata atgttttttg 60

cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc 120

ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagaattca 180

tgcccgctga aacgaccgta tccggcgcgc accccgccgc caaactgccg atttacatcc 240

tgccctgctt cctttggata ggcatcgtcc cctttacctt cgcgctcaaa ctgaaaccgt 300

cgcccgactt ttaccacgat gccgccgccg cagccggcct gattgtcctg ttgttcctca 360

cggcaggaaa aaaactgttt gatgtcaaaa tccccgccat cagcttcctt ctgtttgcaa 420

tggcggcgtt ttggtatctt caggcacgcc tgatgaacct gatttacccc ggtatgaacg 480

acatcgtctc ttggattttc atcttgctcg ccgtcagcgc gtgggcctgc cggagcttgg 540

tcgcacactt cggacaagaa cgcatcgtga ccctgtttgc ctggtcgctg cttatcggct 600

ccctgcttca atcctgcatc gtcgtcatcc agtttgccgg ctgggaagac acccctctgt 660

ttcaaaacat catcgtttac agcgggcaag gcgtaatcgg acacatcggg cagcgcaaca 720

acctcggaca ctacctcatg tggggcatac tcgccgccgc ctacctcaac ggacaacgaa 780

aaatccccgc cgccctcggc gtaatctgcc tgattatgca gaccgccgtt ttaggtttgg 840

tcaactcgcg caccatcttg acctacatag ccgccatcgc cctcatcctt cccttctggt 900

atttccgttc ggacaaatcc aacaggcgga cgatgctcgg catagccgca gccgtattcc 960

ttaccgcgct gttccaattt tccatgaaca ccattctgga aacctttact ggcatccgct 1020

acgaaactgc cgtcgaacgc gtcgccaacg gcggtttcac agacttgccg cgccaaatcg 1080

aatggaataa agcccttgcc gccttccagt ccgccccgat attcgggcac ggctggaaca 1140

gttttgccca acaaaccttc ctcatcaatg ccgaacagca caacatatac gacaacctcc 1200

tcagcaactt gttcacccat tcccacaaca tcgtcctcca actccttgca gagatgggaa 1260

tcagcggcac gcttctggtt gccgcaaccc tgctgacggg cattgccggg ctgcttaaac 1320

gccccctgac ccccgcatcg cttttcctaa tctgcacgct tgccgtcagt atgtgccaca 1380

gtatgctcga atatcctttg tggtatgtct atttcctcat ccctttcgga ctgatgctct 1440

tcctgtcccc cgcagaggct tcagacggca tcgccttcaa aaaagccgcc aatctcggca 1500

tactgaccgc ctccgccgcc atattcgcag gattgctgca cttggactgg acatacaccc 1560

ggctggttaa cgccttttcc cccgccactg acgacagtgc caaaaccctc aaccggaaaa 1620

tcaacgagtt gcgctatatt tccgcaaaca gtccgatgct gtccttttat gccgacttct 1680

ccctcgtaaa cttcgccctg ccggaatacc ccgaaaccca gacttgggcg gaagaagcaa 1740

ccctcaaatc actaaaatac cgcccccact ccgccaccta ccgcatcgcc ctctacctga 1800

tgcggcaagg caaagttgca gaagcaaaac aatggatgcg ggcgacacag tcctattacc 1860

cctacctgat gccccgatac gccgacgaaa tccgcaaact gcccgtatgg gcgccgctgc 1920

tacccgaact gctcaaagac tgcaaagcct tcgccgccgc gcccggtcat ccggaagcaa 1980

aaccctgcaa atgaaagctt ggctgttttg gcggatgaga gaagattttc agcctgatac 2040

agattaaatc agaacgcaga agcggtctga taaaacagaa tttgcctggc ggcagtagcg 2100

cggtggtccc acctgacccc atgccgaact cagaagtgaa acgccgtagc gccgatggta 2160

gtgtggggtc tccccatgcg agagtaggga actgccaggc atcaaataaa acgaaaggct 2220

cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt 2280

aggacaaatc cgccgggagc ggatttgaac gttgcgaagc aacggcccgg agggtggcgg 2340

gcaggacgcc cgccataaac tgccaggcat caaattaagc agaaggccat cctgacggat 2400

ggcctttttg cgtttctaca aactcttttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 2460

tccgctcatg agacgagctc ggccgctcga g 2491

<210> 2

<211> 604

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Pro Ala Glu Thr Thr Val Ser Gly Ala His Pro Ala Ala Lys Leu

1 5 10 15

Pro Ile Tyr Ile Leu Pro Cys Phe Leu Trp Ile Gly Ile Val Pro Phe

20 25 30

Thr Phe Ala Leu Lys Leu Lys Pro Ser Pro Asp Phe Tyr His Asp Ala

35 40 45

Ala Ala Ala Ala Gly Leu Ile Val Leu Leu Phe Leu Thr Ala Gly Lys

50 55 60

Lys Leu Phe Asp Val Lys Ile Pro Ala Ile Ser Phe Leu Leu Phe Ala

65 70 75 80

Met Ala Ala Phe Trp Tyr Leu Gln Ala Arg Leu Met Asn Leu Ile Tyr

85 90 95

Pro Gly Met Asn Asp Ile Val Ser Trp Ile Phe Ile Leu Leu Ala Val

100 105 110

Ser Ala Trp Ala Cys Arg Ser Leu Val Ala His Phe Gly Gln Glu Arg

115 120 125

Ile Val Thr Leu Phe Ala Trp Ser Leu Leu Ile Gly Ser Leu Leu Gln

130 135 140

Ser Cys Ile Val Val Ile Gln Phe Ala Gly Trp Glu Asp Thr Pro Leu

145 150 155 160

Phe Gln Asn Ile Ile Val Tyr Ser Gly Gln Gly Val Ile Gly His Ile

165 170 175

Gly Gln Arg Asn Asn Leu Gly His Tyr Leu Met Trp Gly Ile Leu Ala

180 185 190

Ala Ala Tyr Leu Asn Gly Gln Arg Lys Ile Pro Ala Ala Leu Gly Val

195 200 205

Ile Cys Leu Ile Met Gln Thr Ala Val Leu Gly Leu Val Asn Ser Arg

210 215 220

Thr Ile Leu Thr Tyr Ile Ala Ala Ile Ala Leu Ile Leu Pro Phe Trp

225 230 235 240

Tyr Phe Arg Ser Asp Lys Ser Asn Arg Arg Thr Met Leu Gly Ile Ala

245 250 255

Ala Ala Val Phe Leu Thr Ala Leu Phe Gln Phe Ser Met Asn Thr Ile

260 265 270

Leu Glu Thr Phe Thr Gly Ile Arg Tyr Glu Thr Ala Val Glu Arg Val

275 280 285

Ala Asn Gly Gly Phe Thr Asp Leu Pro Arg Gln Ile Glu Trp Asn Lys

290 295 300

Ala Leu Ala Ala Phe Gln Ser Ala Pro Ile Phe Gly His Gly Trp Asn

305 310 315 320

Ser Phe Ala Gln Gln Thr Phe Leu Ile Asn Ala Glu Gln His Asn Ile

325 330 335

Tyr Asp Asn Leu Leu Ser Asn Leu Phe Thr His Ser His Asn Ile Val

340 345 350

Leu Gln Leu Leu Ala Glu Met Gly Ile Ser Gly Thr Leu Leu Val Ala

355 360 365

Ala Thr Leu Leu Thr Gly Ile Ala Gly Leu Leu Lys Arg Pro Leu Thr

370 375 380

Pro Ala Ser Leu Phe Leu Ile Cys Thr Leu Ala Val Ser Met Cys His

385 390 395 400

Ser Met Leu Glu Tyr Pro Leu Trp Tyr Val Tyr Phe Leu Ile Pro Phe

405 410 415

Gly Leu Met Leu Phe Leu Ser Pro Ala Glu Ala Ser Asp Gly Ile Ala

420 425 430

Phe Lys Lys Ala Ala Asn Leu Gly Ile Leu Thr Ala Ser Ala Ala Ile

435 440 445

Phe Ala Gly Leu Leu His Leu Asp Trp Thr Tyr Thr Arg Leu Val Asn

450 455 460

Ala Phe Ser Pro Ala Thr Asp Asp Ser Ala Lys Thr Leu Asn Arg Lys

465 470 475 480

Ile Asn Glu Leu Arg Tyr Ile Ser Ala Asn Ser Pro Met Leu Ser Phe

485 490 495

Tyr Ala Asp Phe Ser Leu Val Asn Phe Ala Leu Pro Glu Tyr Pro Glu

500 505 510

Thr Gln Thr Trp Ala Glu Glu Ala Thr Leu Lys Ser Leu Lys Tyr Arg

515 520 525

Pro His Ser Ala Thr Tyr Arg Ile Ala Leu Tyr Leu Met Arg Gln Gly

530 535 540

Lys Val Ala Glu Ala Lys Gln Trp Met Arg Ala Thr Gln Ser Tyr Tyr

545 550 555 560

Pro Tyr Leu Met Pro Arg Tyr Ala Asp Glu Ile Arg Lys Leu Pro Val

565 570 575

Trp Ala Pro Leu Leu Pro Glu Leu Leu Lys Asp Cys Lys Ala Phe Ala

580 585 590

Ala Ala Pro Gly His Pro Glu Ala Lys Pro Cys Lys

595 600

<210> 3

<211> 1074

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagctctgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat gttttttgcg 60

ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat taatcatcgg 120

ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaattcatg 180

aagaaaattt ggctggcctt agccggcctg gttctggcat tcagcgccag cgcaaccccg 240

cagaacatca ccgacctgtg cgccgagtac cacaacaccc aaatttatac cctgaacgac 300

aaaattttta gctacaccga gagcctggca ggcaagcgcg agatggccat catcaccttc 360

aagaacggcg ccattttcca ggtggaggtg ccgggcagcc agcacatcga cagtcagaag 420

aaggccatcg agcgcatgaa ggacaccctg cgcatcgcct acctgaccga ggccaaggtg 480

gagaagctgt gcgtgtggaa caacaagacc ccgcacgcca tcgccgcaat cagcatggcc 540

aacgaccaga acgccaccag cgccgtgacc gagtactatc tgaaccatgg cgagtggccg 600

ggtaataaca ccagcgccgg cgtggccaca agcagtgaga tcaagggcgg cggccaccat 660

caccaccacc attaaaagct tggctgtttt ggcggatgag agaagatttt cagcctgata 720

cagattaaat cagaacgcag aagcggtctg ataaaacaga atttgcctgg cggcagtagc 780

gcggtggtcc cacctgaccc catgccgaac tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt 840

agtgtggggt ctccccatgc gagagtaggg aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc 900

tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag 960

taggacaaat ccgccgggag cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg 1020

ggcaggacgc ccgccataaa ctgccctgca gttttccatc gatggccgct cgag 1074

<210> 4

<211> 156

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ala Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His

20 25 30

Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu

35 40 45

Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly

50 55 60

Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln

65 70 75 80

Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu

85 90 95

Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro

100 105 110

His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Asp Gln Asn Ala Thr Ser

115 120 125

Ala Val Thr Glu Tyr Tyr Leu Asn His Gly Glu Trp Pro Gly Asn Asn

130 135 140

Thr Ser Ala Gly Val Ala Thr Ser Ser Glu Ile Lys

145 150 155

<210> 5

<211> 1074

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctagatgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat gttttttgcg 60

ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat taatcatcgg 120

ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaattcatg 180

aagaaaattt ggctggcctt agccggcctg gttctggcat tcagcgccag cgcaaccccg 240

cagaacatca ccgacctgtg cgccgagtac cacaacaccc aaatttatac cctgaacgac 300

aaaattttta gctacaccga gagcctggca ggcaagcgcg agatggccat catcaccttc 360

aagaacggcg ccattttcca ggtggaggtg ccgggcagcc agcacatcga cagtcagaag 420

aaggccatcg agcgcatgaa ggacaccctg cgcatcgcct acctgaccga ggccaaggtg 480

gagaagctgt gcgtgtggaa caacaagacc ccgcacgcca tcgccgcaat cagcatggcc 540

aacgaccaga acgccaccag cgccgtgacc gagtactatc tgaaccatgg cgagtggccg 600

ggtaataaca ccagcgccgg cgtggccaca agcagtgaga tcaagggcgg cggccaccat 660

caccaccacc attaaaagct tggctgtttt ggcggatgag agaagatttt cagcctgata 720

cagattaaat cagaacgcag aagcggtctg ataaaacaga atttgcctgg cggcagtagc 780

gcggtggtcc cacctgaccc catgccgaac tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt 840

agtgtggggt ctccccatgc gagagtaggg aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc 900

tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag 960

taggacaaat ccgccgggag cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg 1020

ggcaggacgc ccgccataaa ctgccctgca gttttccatc gatggccgct cgag 1074