具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现靶向下调多个目标基因、更佳地进一步过表达调控因子EsrB和/或下调毒力抑制因子RpoS可致杀鱼爱德华氏菌较早、过量表达分泌系统组件，使疫苗株在感染宿主鱼体的早期就被识别并清除，对于预防爱德华氏菌感染宿主、降低感染致死率具有极其显著的效果。所述的效应物下调后降低杀鱼爱德华氏菌对宿主的杀伤能力，从而降低爱德华氏菌感染或定植宿主的能力。

效应物及分泌组件调控因子、其功能分析及应用

病原菌在与宿主相互作用时，可以通过分泌系统将多种效应蛋白转运至宿主体内。这些毒力蛋白能够干扰、调整甚至破坏宿主的各种途径和生理过程，从而协助病原菌的定植以及使宿主致病。

本发明人研究发现，下调EseG、EseJ、EseH、ETAE_1586、ETAE_1604、ETAE_2186、ETAE_2188、ETAE_3282、EvpJ基因，较佳地进一步上调esrB基因和/或下调RpoS基因的所得到的疫苗株，可使杀鱼爱德华氏菌因组件较早、过量表达但效应物不表达而被宿主识别及清除，从而起到免疫保护作用。能显著降低注射疫苗株的鱼类被杀鱼爱德华氏菌感染而造成的死亡率。在本发明的一个优选实施方式中，通过利用PrpsU启动子驱动esrB的表达，激活毒力系统的表达；更具体地，建立了pUTat-PrpsU-esrB质粒载体来进行esrB基因的表达。

在前期研究中，本发明人通过转录组分析发现响应调节子EsrB的功能不仅仅局限于对毒力的调控，更参与着E.piscicida中其他重要的生长代谢与环境适应相关的途径。前期研究发现，与环境压力应激密切相关的RNA聚合酶的σ亚基RpoS可以作为EsrB的阻遏因子，在EsrB的表达过程中起到阻遏的作用。后续研究发现下调RpoS并过表达EsrB，可使T3SS、T6SS分泌系统较早、过量表达，起到免疫效果，但又不会使鱼体死亡，与传统疫苗相比具有免疫保护效果更好的特点。

杀鱼爱德华氏菌共有3个T3SS效应蛋白被鉴定，这些效应蛋白分析如下：

EseG(ETAE_0866)，其定位于宿主细胞膜，通过保守区域142～192位氨基酸解聚微管；EseJ(ETAE_0888)抑制病原菌粘附并协助其胞内定植；EseH(ETAE_1757)定位于宿主细胞核，抑制宿主ERK1/2、p38a和JNK/MAPK途径的磷酸化。TEM-1和CyaA报告系统被用于验证上述效应蛋白转运至宿主细胞中。EseG(ETAE_0866)是已经鉴定了的爱德华氏菌T3SS蛋白，当直接在宿主细胞中表达时，EseG可以通过保守的142～192位氨基酸解聚微管结构。EIB202可以在巨噬细胞内形成一个包含细菌的囊泡(E.piscicida-containing vacuoles，ECVs)，从而在其中生存并增殖，而EseG被分泌并定位至囊泡膜上，协助囊泡这个有利环境的稳定产生。

EseJ(ETAE_0888)，其是第二个被鉴定的爱德华氏菌T3SS效应蛋白。EseJ抑制细菌对EPC细胞的粘附，但爱德华氏菌在EPC和J774A.1中的有效增殖依赖于EseJ。此外，EseJ还可以抑制巨噬细胞内活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的产生，以协助爱德华氏菌逃避宿主的杀伤。

EseH(ETAE_1757)，其是一个磷酸丝氨酸酶，与志贺氏菌OspF、沙门氏菌SpvC以及假单胞菌HopAI1高度同源。OspF是志贺氏菌T3SS的一个重要毒力因子，定位于宿主细胞核，介导染色质重排，减少炎性细胞因子的转录，从而抑制宿主的先天免疫应答(Innateimmune response)。OspF还可以调控宿主的MAPK途径以及多形核白细胞的跨上皮迁移，从而协助病原菌的侵染。

EseG、EseJ及EseH以外的其他6个蛋白的功能在现有技术中尚不够明确。

本发明人分析如下：

ETAE_1586，其含有一个木瓜蛋白酶折叠毒素的保守功能域；该蛋白由三型分泌系统分泌，可以将宿主细胞中E2泛素激活酶UBC13的第100位谷氨酰胺残基脱酰胺，本发明人经研究分析，推测其可能是一个抑制宿主炎症反应的T3SS效应蛋白。

ETAE_1604，其仅由49个氨基酸组成，含有一个胞外转肽酶(Exosortase)保守区域，本发明人经研究分析，推测其可能参与蛋白质和多肽的分泌、转运以及分选等。

ETAE_2186，其属于硫氧还蛋白(Thioredoxin，TRX)家族，可以通过巯基的可逆氧化改变靶蛋白的氧化还原状态，调控一些酶和转录因子的功能；本发明人经研究分析，推测其可能可以还原宿主细胞内过氧化物酶或者直接还原过氧化氢以及某些特定的自由基，以抵抗宿主过氧化物的氧化应激防御。

ETAE_2188，其含有一个功能未知的DUF1471功能域。

ETAE_3282，其仅由39个氨基酸组成，经鉴定分析，本发明人没有发现其存在保守功能域。

EvpJ(ETAE_2438)，其含有一个保守的PAAR结构域，即脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-精氨酸重复结构。本发明人经研究分析，推测该家族蛋白可以在六型分泌系统VgrG结构的顶端形成一个尖锐圆锥形结构，可能协助T6SS效应蛋白的分泌与转运。

本发明人分析发现，以上9个蛋白均表现出依赖于T3SS的特征。9个转运蛋白中，EseG、EseH和EseJ已经被鉴定。EseG特异性地定位于吞噬泡膜上，可能通过解聚微管来维持小泡膜的稳定形成，从而形成有利于病原菌生存的吞噬泡空间。EseH定位于宿主细胞核，减少细胞炎性因子和趋化因子的转录，抑制MAPK及ERK等途径，从而抑制宿主的炎症反应。EseJ对于病原菌在宿主体内的稳定增殖至关重要，其在宿主胞内的定位以及确切靶点尚未被发现。ETAE_1586尚未有同源效应蛋白被鉴定，含有的木管蛋白酶折叠毒素保守功能域表明其可能具有抑制宿主炎症反应的功能。ETAE_2186可能通过调控某些酶和或转录因子来抵抗宿主过氧化物的氧化应激防御。本发明人认为，这五个效应蛋白在协助病原菌抵抗宿主体内不利环境以及抑制宿主先天免疫应答的过程中起到了重要作用。当EIB202在体外培养时，9个候选效应蛋白基因受EsrB蛋白的正调控。EIB202在体外培养以及宿主体内时，EsrB均可以诱导9个效应蛋白基因的转录。本发明前期通过CI-seq实验发现，EseJ协助EIB202对宿主细胞定植，而病原菌多个效应蛋白可能具有协同毒力效应。随后进行的鱼实验发现多缺株9Δ显示出相对显著的定植缺陷以及非常弱的竞争能力。

在EIB202中，EsrB严格调控着T3SS/T6SS两套系统的表达。本发明研究表明，RpoS可以通过EsrB调控T3SS/T6SS相关蛋白的表达。通过RNA-seq实验和qRT-PCR技术发现rpoS基因的下调会导致T3SS和T6SS基因簇内基因的转录水平集体显著提高，说明RpoS可以通过调控EsrB的表达来调控T3SS/T6SS相关蛋白的表达。RpoS可阻遏EsrB及其所介导的T3SS/T6SS的表达，通过与esrB启动子结合的方式。

在本发明的实施例中，本发明人敲除了9个编码效应物的基因后，又敲除了RpoS的基因及过表达了esrB基因，成功构建10Δ8^OE疫苗株。结果证明，该10ΔesrB^OE株经基因工程改造，在进入宿主鱼体后可较早、过量激活T3/T6SS表达，并被宿主细胞清除，起到免疫保护作用。

在本发明的实施例中，本发明人直接对鱼类进行感染实验研究，明确了该疫苗株可以显著保护宿主免受爱德华氏菌的毒害，可以有效预防水产养殖过程中由爱德华氏菌引起的大规模流行病害。

基于本发明人的新发现，本发明提供了效应物及分泌组件突变活疫苗株的用途，用于制备防治爱德华氏菌感染的组合物，或，用于诱导爱德华氏菌宿主产生对抗爱德华氏菌的免疫保护力。较佳地，所述组合物为疫苗组合物。

与爱德华氏菌感染相关的宿主包括海水鱼类和淡水鱼类，所述的宿主包括任何作为爱德华氏菌宿主的鱼。例如包括但不限于：鲽形目(包括鲆科)，鲤形目(包括鲤科)。更具体地例如但不限于：鲽形目鲆科的大菱鲆，鲤形目鲤科的斑马鱼，鲇鱼，鳗鲡，比目鱼，大马哈鱼，罗非鱼等。

减毒菌株

本发明提供一种爱德华氏菌减毒株，该减毒株中目标基因基因不表达或基本上不表达。所述的目标基因包括：EseG、EseJ、EseH、ETAE_1586、ETAE_1604、ETAE_2186、ETAE_2188、ETAE_3282、EvpJ。较佳地，所述目标基因还包括rpoS；较佳地，还在所述爱德华氏菌减毒株中上调esrB基因的表达。

本发明中，所述的“基本上不表达”是指爱德华氏菌减毒株中目标基因不表达或低表达。其中，目标基因低表达是指该减毒株中目标基因的表达量低于野生型爱德华氏菌的30％或更低；较佳地低于野生型爱德华氏菌的20％或更低；更佳地于野生型爱德华氏菌的10％或更低，最佳地低于野生型爱德华氏菌的5％，2％或更低。所述目标基因基本上不表达的菌株可以通过各种基因敲除、基因抑制、基因沉默、基因编辑等技术来构建。

所述的目标基因存在于几乎所有爱德华氏菌种属中，其突变可导致爱德华氏菌在宿主体内生存能力的显著下降。鉴于该基因在所有爱德华氏菌种属中的保守性，针对该基因的调控适用于所有中枢的爱德华氏菌，具有普适性。

所述的目标基因也包含其部分碱基被替换的基因变体，也包含其同源物(也即来源于不同种属的爱德华氏菌但是高度同源的基因(如同源性高于80％，85％，90％，95％，98％，99％))。所述的目标基因也包括截短形式的变体，只要该基因片段在被下调(如敲除)后可导致相应的目标蛋白不表达或表达异常，或其表达的目标蛋白片段活性降低或没有活性。根据本发明的揭示，本领域人员非常容易获得所述的目标基因或其编码的蛋白片段。

在得知了所述的目标基因与爱德华氏菌的毒性表现的相关性后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节(下调)目标基因表达或其编码的蛋白的活性。包括但不限于：(a)在爱德华氏菌中敲除或沉默目标基因；(b)将下调目标基因或蛋白的下调剂转入爱德华氏菌中；或(c)调节爱德华氏菌中目标基因的上游信号通路或上游基因，以下调爱德华氏菌中目标基因表达或蛋白活性。

可以采用多种本领域已知的方法在爱德华氏菌株中下调目标基因表达或蛋白活性，包括但不限于：基因沉默、基因阻断、基因敲除、基因抑制等。这些方法均被包含在本发明中。

一种优选的下调目标基因的方法是基因阻断技术，在本发明的优选实施方式中，体外构建目标基因阻断质粒，基于同源重组的原理，通过无标记框内缺失突变法实施改造，从而使得染色体上的无标记框内缺失突变法不再能够编码活性的蛋白质。此外，也可通过在该基因中删除部分区域，或者插入无关序列来实施进行基因阻断时。无关序列的选择是本领域技术人员易于选择到的，例如应用一些抗性基因，此类基因可能有利于后续选择出发生基因被阻断或敲除的菌株。

此外，作为本发明的一种可选择的操作方式，可采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除目标基因。合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，先设计并找到合适的靶位点。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。

本发明还涉及目标基因或蛋白的其它下调剂(如反义的核酸，siRNA，miRNA，shRNA，反义核苷酸等)或下调方式。任何可抑制目标编码的蛋白(目标蛋白)的活性、下调目标蛋白的稳定性、抑制目标基因的表达、减少目标蛋白有效作用时间、或降低目标基因的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于使得爱德华氏菌减毒的试剂。

上调esrB基因的表达也是本领域已知的技术，可通过多种途径来进行表达的上调。例如，可以利用表达esrB的表达系统或表达构建物。所述的表达系统或表达构建物没有特别的限制，任何可表达出具有esrB或其类似物、模拟物相似活性的表达系统均可应用于本发明中。例如，所述的表达系统或表达构建物包括但不限于：表达载体、含有表达载体的宿主细胞或病毒。此外，也可以运用一些强启动子或诱导型启动子来进一步优化esrB的过表达，例如在本发明的优选方式中，所述的强启动子包括p_rpsU启动子。在本发明的优选方式中，所述重组表达载体是以pUTt为起始载体构建而成。

在本发明的优选方式中，提供一株爱德华氏菌的减毒疫苗株，为目标的无标记框内缺失株。相对于野生株，其具有显著降低的定植能力，以及对细胞的粘附能力。经验证，其免疫原性显著，体内清除率高，具有非常理想的安全性及免疫应答效果。

本发明的爱德华氏菌的减毒疫苗株进入宿主鱼体内后能够较早、过量表达T3SS、T6SS分泌系统的分泌元件，使其感染早期即可被宿主识别并清除，死亡率低，并且产生免疫保护作用。根据本发明实施例的大菱鲆毒力实验，相对于未注射疫苗株的大菱鲆，注射疫苗株的大菱鲆死亡率低于20％，说明疫苗株能够有效地保护大菱鲆免受爱德华氏菌引起的毒害。

施用本发明的爱德华氏菌的减毒疫苗株后，可以显著保护宿主免受爱德华氏菌的毒害，可以有效预防水产养殖过程中由爱德华氏菌引起的大规模流行病害。

组合物

如本文所用，术语“本发明的组合物”通常是药物组合物、食物组合物或饲料组合物，其含有本发明的爱德华氏菌减毒株(具体如效应物及分泌组件突变活疫苗株10ΔesrB^OE株)作为爱德华氏菌宿主防治爱德华氏菌感染的活性成分；以及药学上、食品学上或饲料学上可接受的载体或赋形剂。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明中，“食品学或药学上可接受的”成分是适用于动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。

如本发明所用，所述的“爱德华氏菌宿主”是指可由爱德华氏菌感染(也即具有爱德华氏菌易感性)的动物，包括鱼类。较佳地，所述的鱼类是以爱德华氏菌为宿主的鱼；更佳地，所述的鱼类包括但不限于：鲽形目的鱼，鲤形目的鱼，鲈形目的鱼；更佳地，包括但不限于：鲽形目鲆科的鱼如大菱鲆，鲤形目鲤科的鱼如斑马鱼、鲇鱼、鳗鲡、比目鱼、大马哈鱼、罗非鱼。

本发明还提供了制备防治爱德华氏菌感染的组合物的方法，包括使用可将有效量的与药学上可接受的载体混合获得本发明的组合物，其中菌体细胞浓度数量级为10²～10⁹CFU/ml，或者10⁶～10⁹CFU/ml。

本发明所述的组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达动物的剂型都是可以的。从易于制备和给药的立场看，优选的组合物是一种口服或注射的制剂。比如可选自：颗粒剂、片剂、胶囊剂、溶液、或悬浮液、粉末剂。本发明的组合物中可以加入制备不同剂型时所需要的各种常规载体或辅料，如填充剂、矫味剂、抗氧化剂、香料、色素、润滑剂、助流剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲物质等。这些添加剂都是本领域人员所熟知的。

在本发明的优选实施方式中，将所述的爱德华氏菌减毒株与PBS或生理盐水混合，来制备所述的组合物，在体内实现了优异的技术效果。

本发明还提供了一种防治爱德华氏菌感染的方法，包括步骤：给需要的对象(鱼类)施用有效量的疫苗株培养液稀释剂。活性成分的给药量是对于预防和治疗有效量的，该有效量通常约100μl每尾幼鱼。当然，具体剂量还应考虑施用途径等因素。

本发明的实施方式之一中，所述迟钝爱德华氏菌载体活疫苗株或所述疫苗组合物通过注射方式给药，其中菌体细胞浓度数量级为10²～10⁹CFU/ml，或者10⁶～10⁹CFU/ml。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

1、菌种和质粒

本实施例所用到的菌种和质粒列在表1中。所有菌株-80℃保存于含20％甘油的LB培养基中。杀鱼爱德华氏菌的培养温度为30℃，大肠杆菌的培养温度为37℃。无特殊说明时液体培养所采用摇床转速为200rpm。当需要时，在培养基中添加抗生素：多粘菌素(polymyxin，Col，16μg/ml)、羧苄青霉素(Carbenicilin，Carb，24μg/ml)、卡那霉素(kanamycin，Km，50μg/ml)。DMEM培养基购自Gibco公司。

表1、菌株和质粒

2、主要试剂及缓冲液的配制

抗生素溶液配制：抗生素粉末溶于去离子水中或者无水乙醇中，用0.22μm滤膜过滤除菌(Millipore，Germany)，分装于EP管中，-20℃储存备用。硫酸多粘菌素(PolymyxinB，Inalco)、卡那霉素(Kanamycin，Inalco)以及羧苄青霉素(Carbenicilin，Inalco)溶于水，储存液浓度16mg/ml、50mg/ml、50mg/ml，稀释1000倍后作为工作浓度使用。氯霉素(Chloromycetin，Inalco)75mg/ml母液浓度溶于无水乙醇，分装于EP管中，-20℃储存备用。氯霉素稀释3000倍作为工作浓度使用。注意氯霉素有剧毒。

LB：按酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，NaCl 10g/l称取各组分，加入去离子水后用10mol/l NaOH调pH至7.0，并用去离子水定容。混匀后121℃高压蒸气灭菌25min。

LB固体琼脂：按酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，NaCl 10g/l，琼脂15g/l称取各组分，加入去离子水后用10mol/l NaOH调pH至7.0，并用去离子水定容。混匀后121℃高压蒸气灭菌25min。

10×TAE缓冲液：将242g Tris碱溶于600ml双蒸水中，加入57.1ml冰乙酸和37.2g的Na₂EDTA·2H₂O，定容至1000ml。使用前稀释10倍。

1.0％琼脂糖凝胶：称取1.0g琼脂糖溶于100ml 1×TAE缓冲液中，在微波炉中加热2min左右，待琼脂糖完全溶解后迅速倒入制胶台，冷却15min后即可点样电泳。

5×TBE缓冲液：Tris碱54g，硼酸27.5g，EDTA4.12 g，溶于1000ml超纯水。

6％聚丙烯酰胺非变性凝胶：超纯水9.63ml，50％甘油0.75ml，5×TBE缓冲液1.5ml，30％AB液3ml，10％APS 0.11ml，TEMED 0.01ml。

PBS(1L)：8.0g NaCl，0.2g KCl，1.44gNa₂HPO4，0.24g KH₂PO4，加1L去离子水混匀。

PBST(1L)：8.0g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO4，0.24g KH₂PO4，加1L去离子水混匀，再加入500μl Tween-20，混匀。

封闭液：10％脱脂奶粉溶解于PBST。

电转缓冲液(1L)：3.03g Tris碱，14.4g甘氨酸，800ml去离子水，充分溶解后加入200ml无水甲醇再混匀。

3、菌株构建

(1)框内缺失株构建

本实施例中，采用pDMK质粒(由本实验室前期构建，为pDM4质粒插入Km抗性基因后构建)。基于同源重组原理构建框内无标记缺失株。分别扩增目标基因上下游500bp左右片段，将其连接到pDMK质粒上。自杀质粒pDMK的R6K复制子依赖于λpir蛋白，而EIB202中无编码该基因的蛋白，故只可通过整合到基因组上维持其存在。pDMK进入EIB202，通过目标基因上游或下游片段发生第一次同源交换，并整合到基因组上。pDMK上的sac^BR基因编码果聚糖蔗糖转移酶，可以催化蔗糖合成果聚糖，引起EIB202的死亡，因此蔗糖可以诱导第二次同源交换，质粒被交换下来。

抽提pDMK质粒，用SalI/XbaI于37℃水浴中进行酶切1～1.5小时。酶切后的质粒进行DNA琼脂凝胶电泳分离，选取8,700bp大小条带，割胶回收，回收后的线性DNA放置于-20℃备用。

粗提菌株E.piscicidaEIB202基因组，以之为模板，分别用靶向特定基因的相应引物对P1/P2引物对和相应P3/P4引物对扩增目的基因上下游片段，纯化回收。再用相应P1/P4引物对进行Overlap-PCR，将上下游片段连接在一起。将连接的上下游DNA和酶切后的pDMK按照摩尔数3:1混合后加入ITA Mix，于50℃水浴1小时，转入DH5αλpir，涂氯霉素LB琼脂板。平板放入37℃培养箱过夜培养。挑12-24个单克隆，接入LB，37℃，200rpm，2-5h，用通用引物对pDMK-F/pDMK-R验证。阳性克隆接种到新鲜LB中，37℃，200rpm，过夜。抽质粒，测序。测序正确的质粒转SM10λpir，保种。将SM10λpir和EIB202进行接合实验，接合后的菌液涂氯霉素和多粘菌素LB琼脂平板，30℃培养24h左右。取4个单克隆，用引物对pDMK-F/Out-R和引物对pDMK-R/Out-F验证单交换，挑选阳性，分别接种氯霉素和多粘菌素LB保种和12％蔗糖LB，诱导12h，sacB反向筛选。取诱导后的菌液稀释10³～10⁵，涂12％蔗糖LB琼脂板，30℃，24h。双交换后，挑取周围没有雾圈的单克隆24-48个，用Out-F/Out-R引物验证，选取条带大小正确的单克隆进行扩大培养。

表2、引物

依次缺失9个效应物基因(EseG、EseJ、EseH、ETAE_1586、ETAE_1604、ETAE_2186、ETAE_2188、ETAE_3282、EvpJ)后构建的缺失株为9Δ，在此基础上继续缺失rpoS基因，经测序验证，构建得到10Δ菌株。

(2)EsrB过表达菌株构建

本发明中，采用pUTt质粒构建过表达质粒。

质粒pUTt的图谱如图5。抽提pUTt质粒，用限制性核酸内切酶HindIII/XbaI于37℃水浴中进行酶切，1-1.5小时。酶切后的质粒进行DNA琼脂凝胶电泳分离，选取3584bp大小条带，割胶回收，回收后的线性pUTt质粒放置于-20℃备用。

prpsU基因为rpsU基因的启动子区域，rpsU为核糖体蛋白S21的亚单位，为常表达，该启动子为强启动子，本发明人将之用于过量表达esrB基因。扩增prpsU基因、esrB基因(扩增自杀鱼爱德华氏菌基因组；引物分别为：正向：pUTt-prpsU-F，反向pUTt-prpsU-R；正向：pUTt-esrB-F，反向：pUTt-esrB-R)，进行DNA凝胶电泳，将扩增得到的强启动子prpsU片段/esrB片段和酶切后线性化的pUTt载体按照摩尔数3:1混合后加入ITA Mix(Gibsonassembly，Gene Company Limited)，于50℃水浴1小时，转入DH5αλpir，涂羧苄青霉素LB琼脂板。平板放入37℃培养箱过夜培养。挑12～24个单克隆，接入LB，37℃，200rpm，2-5h，用通用引物pUTt-F/pUTt-R验证。阳性克隆接种到新鲜LB中，37℃，200rpm，过夜。抽质粒，测序。获得pUTt-p_rpsU-esrB质粒，抽提后通过电转化方法转入10Δ株中，得到10ΔesrB^OE株。

(3)荧光素酶检测

将含有pUTt-p_esrB-luxAB质粒的缺失株甘油菌接入新鲜LB液体培养基，37℃，200rpm，过夜培养。按照1％OD₆₀₀菌量将菌株接入DMEM培养基，于28℃静置培养。在不同时间点，取200μl菌液加入到底透黑边的96-孔板，每个样本做三组操作重复。先使用MicroplateReader(Bio-Tek)测定96-孔板OD₆₀₀吸光值，再用化学发光仪(Microplate Luminometer)，加入40μl1％癸醛(溶解于纯酒精)作为底物、测量荧光素酶表达量。

(4)大菱鲆体内毒力实验

EIB202野生株、前述制备的10Δ株以及10ΔesrB^OE株接LB培养基，过夜培养，二级种接DMEM，于28℃静止培养。5000g离心4min收集菌体，用无菌PBS洗涤菌体3次，并分别稀释到100CFU/μl。以肌肉注射方式向每尾鱼注射100μl稀释菌液，同时以每尾肌肉注射100μlPBS的斑马鱼作为对照。每组设15尾鱼。攻毒后每5h观察并且记录实验组和对照组的发病及死亡情况，及时清理死鱼并换水。最后统计每组鱼的存活及死亡情况，绘制存活曲线图。

(5)体内定植检测

取EIB202野生株(WT)、9Δ株、10Δ株以及10ΔesrB^OE株接LB培养基，过夜培养，二级种接DMEM，于28℃静止培养，培养液用于对30g左右大菱鲆进行攻毒实验。每组设15尾鱼，共3个平行。攻毒后分别在第4、7、11天取肝脏称重、研磨、涂板及计数，最终相对定植率计算公式如下：

相对定植率％＝(实验组实际活菌数CFU/实验组肝脏质量μg)/(对照组实际活菌数CFU/对照组肝脏质量μg)×100％。

(6)大菱鲆体内竞争性分析实验(CI)

取37℃下过夜震荡培养的相关爱德华氏菌株二级种1ml，5000×g离心2min收集菌体，用无菌PBS将菌体洗涤3次，然后分别稀释到5×10⁵CFU/ml，按照要求以1:1的比例对EIB202各菌株进行混合。以100μl的攻毒量向每尾鱼注射混合菌液，每组15尾鱼。攻毒后第五天(DPI＝5)，每组分别取5尾鱼的肝脏进行研磨，并进行稀释梯度滴板(分别滴至含有筛选抗性的DHL板和空白DHL板)。37℃培养过夜，进行菌落计数。

(7)相对免疫保护力(RPS)实验

将WT、10Δ、10ΔesrB^OE株的一二级培养液于5000rpm转速离心3min收集菌体，用无菌PBS洗涤菌体3次，并分别稀释到10⁶CFU/ml。以腹腔注射方式向每尾鱼注射100μl稀释菌液，同时以每尾肌肉注射100μlPBS的鱼作为对照，四组各120尾鱼。免疫后于系统中正常养殖。免疫35天后采集血液，注射器从背部尾部肌肉插入脊柱血管进行抽血，每组取3尾鱼，血液4℃放置过夜，次日收集血清，于-80℃保存，后续用于测定抗体滴度。

免疫35天后攻毒野生株，评估相对免疫保护力。5000r/min离心3min收集菌体，用无菌PBS洗涤菌体3次，并稀释到2×10⁴CFU/ml。以肌肉注射方式向PBS对照组和3个免疫组的每尾鱼注射100μl稀释菌液，每组3个平行，每个平行30尾鱼。攻毒后观察28天，每日记录实验组和对照组的发病及死亡情况，及时清理死鱼并换水。最后统计每组鱼的存活及死亡情况，绘制存活曲线，并按照下面公式计算相对免疫保护力：

RPS＝(1-％免疫组死亡率/PBS对照组死亡率)×100％。

实施例1、以大菱鲆为试验动物的毒力测试实验

分别以1×10⁴CFU/尾及1×10⁷CFU/尾剂量腹腔注射免疫健康大菱鲆，试验所用大菱鲆随机分为4组，每组3个平行水槽，15尾/槽。将制备的减毒活疫苗等采用腹腔注射方式免疫。实验组注射爱德华氏菌EIB202野生株(WT)、爱德华氏菌10个基因缺失株(10Δ)、爱德华氏菌10缺后过表达esrB株(10ΔesrB^OE)，对照组注射等体积无菌PBS缓冲液。免疫期为20天，每天观察实验动物健康状况并记录生存和死亡情况。

如图1所示，在注射14天时，1×10⁴CFU/尾的WT组接近70％死亡，10Δ和10ΔesrB^OE组无鱼死亡；同时，1×10⁷CFU/尾的WT组在第14天时全部死亡，10Δ和10ΔesrBOE组死亡率分别是40％和35％。在20天时，1×10⁴CFU/尾的WT组已全部死亡，10Δ和10ΔesrB^OE组死亡率分别是36％和42％；1×10⁷CFU/尾的10Δ和10ΔesrB^OE组死亡率分别是52％和42％。

因此，本发明的10Δ和10ΔesrB^OE组疫苗株对大菱鲆的毒力相对于野生型大幅下降。

实施例2、动物水平的有效性验证

1、大菱鲆体内竞争性分析实验(CI)

取37℃下过夜震荡培养的相关爱德华氏菌株二级种1ml，5000×g离心2min收集菌体，用无菌PBS将菌体洗涤3次，然后分别稀释到5×10⁵CFU/ml，按照要求以1:1的比例对EIB202各菌株进行混合。以100μl的攻毒量向每尾鱼注射混合菌液，每组15尾鱼。攻毒后第5天(DPI＝5)，每组分别取5尾鱼的肝脏进行研磨，并进行稀释梯度滴板(分别滴至含有筛选抗性的DHL板和空白DHL板)。37℃培养过夜，进行菌落计数。

结果如图2所示，以EIB202Δp菌株作为对照进行体内竞争实验，发现10Δ、10ΔesrB^OE株在大菱鲆体内的竞争力明显低于EIB202野生株(WT)，且过表达esrB基因说明缺失效应物并激活T3SS、T6SS组件的表达，可致使宿主在感染早期便能识别该菌株，随后将其清除，产生免疫保护效果。既降低疫苗株的致死性，又可提高免疫保护力。

(2)测试相对免疫保护力(RPS)实验

将EIB202野生株(WT)、9Δ株、10Δ株、10ΔesrB^OE株的一二级培养液于5000rpm转速离心3min收集菌体，用无菌PBS洗涤菌体3次，并分别稀释到10⁶CFU/ml。以腹腔注射方式向每尾鱼注射100μl稀释菌液，同时以每尾肌肉注射100μl PBS的鱼作为对照，四组各120尾鱼。免疫后于系统中正常养殖。免疫35天后采集血液，注射器从背部尾部肌肉插入脊柱血管进行抽血，每组取3尾鱼，血液4℃放置过夜，次日收集血清，于-80℃保存，后续用于测定抗体滴度。

免疫35天后攻毒野生株，评估相对免疫保护力。5000r/min离心3min收集菌体，用无菌PBS洗涤菌体3次，并稀释到2×10⁴CFU/ml。以肌肉注射方式向PBS对照组和3个免疫组的每尾鱼注射100μl稀释菌液，每组3个平行，每个平行30尾鱼。攻毒后观察28天，每日记录实验组和对照组的发病及死亡情况，及时清理死鱼并换水。

最后统计每组鱼的存活及死亡情况，绘制存活曲线，并按照下面公式计算相对免疫保护力：

RPS＝(1-％免疫组死亡率/PBS对照组死亡率)×100％。

如图3所示，9Δ株、10Δ株及10ΔesrB^OE株注射后免疫保护力较高，其中以10ΔesrB^OE为最高。说明本疫苗株接种后对宿主鱼体可以产生良好的免疫保护作用。

(3)体内定植检测实验

取EIB202野生株、9Δ株、10Δ株以及10ΔesrB^OE株接LB培养基，过夜培养，二级种接DMEM，于28℃静止培养，培养液用于对30g左右大菱鲆进行攻毒实验。每组设15尾鱼，共3个平行。攻毒后分别在第4、7、11天取肝脏称重、研磨、涂板及计数，最终相对定植率计算公式如下：

相对定植率％＝(实验组实际活菌数CFU/实验组肝脏质量μg)/(对照组实际活菌数CFU/对照组肝脏质量μg)×100％。

由图4结果可看出，第4天时9Δ株、10Δ株以及10ΔesrB^OE株定植率相较于野生株差距不大。但当第7天时，这三株相对于野生株的定植率明显下降，说明缺失株在宿主体内被识别并清除，且其中10ΔesrB^OE株被清除的情况最为明显。

因此，对宿主鱼类进行施用效应物及分泌组件突变活疫苗株极为显著地保护了鱼免受爱德华氏菌的伤害。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 新型爱德华氏菌减毒疫苗株、其制备方法及其应用

<130> 199940

<160> 72

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 1

ggaagatctt aacgacgatg ctaacctcag 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 2

ttacaactta cataatagag gctccaggtt 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 3

ctctattatg taagttgtaa tagccacccc 30

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

acatgcatgc cacctggatt gactcctgtt tg 32

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

tgcctgttaa gtgtagcccg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

ccgacctccg ccttatcaaa 20

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

ggaagatctg cctaacccgc agtttgat 28

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

gggcggatta catggcagcc tcgggagggt 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

ggctgccatg taatccgccc taaaccgagc 30

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

acatgcatgc gctttggtgg acctgttgc 29

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

cgtcaagttg tgcctggagt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

gcactggaac aggcagaaac 20

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

ggaagatctc cccgacaata actgcgacta 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

catcaaacgg tttaggctct cattcattgg 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

agagcctaaa ccgtttgatg acagagtaga 30

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

acatgcatgc gagccgctga acccagatta c 31

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 17

atccggcgca catcattttg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 18

cgtgatatcg caccctggaa 20

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 19

ggaagatctt gactcaactt gccaatacca t 31

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 20

gggtcagaaa tttcatgatg ctttctccgc 30

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 21

catcatgaaa tttctgaccc gctaaggacg 30

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 22

acatgcatgc ggctaaacac cagcatgacg ac 32

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 23

aacacctgct ccttactgcc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 24

cgatgagcca cttctccagg 20

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 25

ggaagatcta ttgaaccgcc ggatacagg 29

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 26

gagagcgcta ggcctgacgg gcatcgatct 30

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 27

ccgtcaggcc tagcgctctc tgcgacaggc 30

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 28

acatgcatgc acaccttcgc gtaccatgaa 30

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 29

ctgggggctg ttattcctgg 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 30

ttcgattcgg ctgtgcagat 20

<210> 31

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 31

ggaagatctg gggaaacagt ccattgcg 28

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 32

ctctccctta catggatagc ctccttattc 30

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 33

gctatccatg taagggagag gacgatatga 30

<210> 34

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 34

acatgcatgc ccgccagctg caggtctttg ct 32

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 35

gggtctataa cgcccaccag 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 36

gccatgccct taccctctac 20

<210> 37

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 37

ggaagatctc tttcttacgc agcaccagg 29

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 38

caataattca cacattccat taaccatttt 30

<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 39

atggaatgtg tgaattattg gttccgcgga 30

<210> 40

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 40

acatgcatgc ggcgacatcg ttaaggtga 29

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 41

gatcttggcg aaaaccgagc 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 42

tggttttccc tgagttgggg 20

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 43

ggaagatctc tggctgtcca agagattacg 30

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 44

gatccgccat catggagaga cctcccaatc 30

<210> 45

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 45

tctctccatg atggcggatc ctgagggcta 30

<210> 46

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 46

acatgcatgc acaatacctt ttccgctcaa t 31

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 47

gtcgcattcc cgatttgctg 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 48

agatcgcgtc gtagggtttc 20

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 49

ggaagatctg ctgcggtttt tctgttggtt 30

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 50

cagcgcgcta cagcacccca tgaagaggct 30

<210> 51

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 51

tggggtgctg tagcgcgctg gggatcgacc 30

<210> 52

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 52

acatgcatgc gatggcttcc gcaactggc 29

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 53

tgacggagct gggatttacc 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 54

cttctccaag atgtcgccgt 20

<210> 55

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 55

ggaagatctc gctattgctg ccgctaa 27

<210> 56

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 56

caaagctgta catcataggc tccttagggt 30

<210> 57

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 57

gcctatgatg tacagctttg cctgaccccc 30

<210> 58

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 58

acatgcatgc aaacccaccg cagagtaaga g 31

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 59

gccatcgtag tagggcaaca 20

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 60

gacgatggac aggccgttat 20

<210> 61

<211> 43

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 61

gagctcaggt tacccggatc tatgagctat aacggcgaag cct 43

<210> 62

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 62

gcatcgctca catagctgta ccctacccgt 30

<210> 63

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 63

tacagctatg tgagcgatgc ggtcaaaaaa 30

<210> 64

<211> 48

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 64

ccctcgagta cgcgtcacta gtggggccct ctgttcgcca cccctact 48

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 65

ataaccgcag ctaccagtcg 20

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 66

cccggtcgat cgcatcttta 20

<210> 67

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 67

aaagctctca tcaaccgtgg c 21

<210> 68

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 68

tgctccagtg gcttctgttt c 21

<210> 69

<211> 45

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 69

aagatggcgc agcagggcgt ggggaattcc tccttaattt ttaac 45

<210> 70

<211> 49

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 70

gtctccgttt tatctttatc agtacacgga gagtggagct atttttagc 49

<210> 71

<211> 49

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 71

cgatttttat cgaggtgaga ggcacatgac tatttctatt ttgcctctg 49

<210> 72

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 72

tctcatccgc caaaacagcc ttaaaactcc agaaccccca gg 42