一种重组大肠杆菌固定化细胞及其应用

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一种重组大肠杆菌固定化细胞及其应用

文档序号：3247 发布日期：2021-09-17 浏览：56次英文

一种重组大肠杆菌固定化细胞及其应用

技术领域

本发明属于生物工程

技术领域

，具体而言，涉及一种重组大肠杆菌固定化细胞及在微分子透明质酸或其盐制备上的应用。

背景技术

透明质酸是由N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸组成的双糖单位重复构成的无分支糖胺聚糖，存在于动物细胞间质和某些细菌荚膜中，在化妆品、食品、医药领域具有广泛的应用。按照分子量大小，可将透明质酸或其盐分为大分子（1800～3000 kDa）、中分子（1000～1800 kDa）、小分子（10～1000 kDa）、微分子（10 kDa以下），不同分子量的透明质酸具有不同的锁水、渗透、生物活性功能。中、小分子量透明质酸有助于蛋白和多肽类物质的运输，应用于慢性伤口愈合，微分子透明质酸可以渗透至皮肤基底层，有效抑制炎症因子释放，缓解各种因素引起的皮肤敏感状态，清除自由基，修复紫外线或化学物质刺激造成的皮肤细胞损伤，实现深层保湿和修复受损细胞，还可以通过破坏受体和透明质酸的结合杀死许多种类的癌细胞。

随着低分子透明质酸的应用推广，其降解及制备技术成为研究的热点。常见的降解方法有物理降解，如加热、超声破碎法、辐射等；化学降解，如氧化水解、酸水解、碱水解等，但是这两种降解方法存在寡糖分子量分布范围广、纯化程序复杂、寡糖结构易被破坏、对设备要求高等缺点，降低了特定分子量寡糖的制备效率，难以在工业规模大量生产。而生物酶法制备低分子透明质酸的反应条件温和、制备效率较高。

专利CN 103255187 B公开了一种制备低分子透明质酸的方法，由保藏号为CGMCCNo.5744的芽孢杆菌发酵生产的透明质酸酶，对分子量大于1000 kDa的透明质酸或其盐进行降解，每1 kg透明质酸或其盐中加酶量10⁶～10⁷ IU，其制备步骤包括芽孢杆菌种子培养、芽孢杆菌发酵产酶、酶液提取、酶解、灭活、过滤、沉淀、脱水、干燥。

专利CN 109897876 B公开了一种小分子透明质酸或其盐的制备方法，使用由菌种保藏号CGMCC No.16836的植物乳杆菌发酵生产的透明质酸酶，酶解分子量500 KDa～700KDa透明质酸或其盐，每1 kg透明质酸或其盐中加酶量10⁵～10⁸ IU，其制备步骤包括植物乳杆菌种子培养、发酵产酶、酶液提取、酶解、灭活、活性炭吸附除杂、过滤微孔滤膜、低温喷雾干燥得到小分子透明质酸或其盐。

专利CN 110331178 B公开了一种酶切法制备小分子透明质酸的方法，使用保藏号CCTCC NO：M 2018452的球形节杆菌HL6发酵生产的透明质酸酶，酶解分子量大于600 KDa透明质酸或其盐，每1 kg透明质酸或其盐中加酶量10⁵～5*10⁸ U，其制备步骤包括球形节杆菌种子培养、发酵产酶、酶液提取、酶解、灭活、过滤、沉淀、脱水、干燥。

专利CN 104263666 B公开了一种产小分子透明质酸的重组毕赤酵母及其构建方法，采用兽疫链球菌来源的透明质酸合酶has A和枯草芽孢杆菌来源的UDP-葡萄糖脱氢酶tuaD，在重组毕赤酵母宿主中实现透明质酸的生产，同时，采用水蛭来源的透明质酸酶整合至毕赤酵母基因组上，分别置于不同强度的组成型启动子下分泌表达，通过控制透明质酸酶的分泌量来制备不同分子量大小的小分子透明质酸。以甘油、甲醇、山梨醇或葡萄糖为碳源，20～30℃下发酵48～96 h。

专利CN 103255187 B、专利CN 109897876 B和专利CN 110331178 B均使用野生型菌株发酵产生透明质酸酶，其步骤包括种子培养、发酵培养、发酵液离心、超滤浓缩得到酶液，将酶液加入高分子透明质酸或盐溶液中，恒温孵育降解，然后进行高温灭酶，接着提取寡聚透明质酸或盐。

以上工艺技术，制备每1 kg透明质酸或其盐中加酶量10⁵-5*10⁸ U，而且酶液不能重复使用，无形中增加了制备成本；而且在降解完成后需要高温灭酶，这个过程易导致透明质酸寡糖溶液的褐变或者结构的破坏，导致产品质量不稳定；同时，酶解完成后使用乙醇沉淀工艺提取，提取步骤较为繁琐，其存在着乙醇用量大的问题。

专利CN 104263666 B构建的重组毕赤酵母发酵一步法产生低分子量的透明质酸，发酵周期较长，最长可达到96 h，发酵过程能耗成本较高，发酵过程控制要求较高，不易在产业化规模实现。

提供一种更高效的透明质酸酶，简化微分子透明质酸钠的提取工艺是降低微分子透明质酸钠生产成本、实现工业化生产的关键因素之一。

发明内容

发明目的：提供一种重组大肠杆菌固定化细胞及制备方法，简化微分子透明质酸或其盐的制备工艺，降低其生产制备成本。

技术方案：

为实现上述目的，本发明提供了一种含有透明质酸酶的重组大肠杆菌固定化细胞。

本发明的技术方案是：一种含有透明质酸酶的重组大肠杆菌固定化细胞，先构建含有天然透明质酸酶编码基因的重组质粒，然后导入大肠杆菌感受态细胞，经过筛选得到重组大肠杆菌，并对重组大肠杆菌进行固定化而得到该固定化细胞。

为提高透明质酸酶的酶活单位，本发明还利用一种基于易错PCR技术的酶体外进化技术，以重组质粒pET28(a+)-PF为模板，使用易错PCR技术，获得含有碱基突变的线性基因片段，将PCR产物和pET28a(+)表达质粒分别进行双酶切（EcoRI、Not I）、纯化、连接和转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，然后进行PCR验证和诱导表达，经过大量筛选获得酶活单位明显提高的突变株。

本发明所述含透明质酸酶的重组大肠杆菌固定化细胞的制备方法如下：

第一步合成Penicillium funiculosum天然透明质酸酶编码基因（GenBank:AB355480），通过EcoR I和Not I酶切位点连接至质粒pET28(a+)得到重组质粒pET28(a+)-PF。

第二步采用热激转化法（42 ℃处理90秒后冰浴5分钟）将重组质粒pET28(a+)-PF转化感受态大肠杆菌细胞E.coli DH5α，经过卡那霉素抗性筛选获得含有透明质酸酶的重组大肠杆菌E.coli DH5α-pET28(a+)-PF。

第三步挑取E.coli DH5α-pET28(a+)-PF单菌落接入Luria-Bertani培养基（LB培养基），37℃，220 r/m活化培养15 h左右，应用质粒小量提取试剂盒提取重组质粒pET28(a+)-PF。

第四步采用热激转化法（42 ℃处理90秒后冰浴5分钟）将重组质粒pET28(a+)-PF转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，经过卡那霉素抗性筛选获得含有透明质酸酶的重组大肠杆菌E.coli BL21-pET28(a+)-PF。

第五步E.coli BL21-pET28(a+)-PF发酵培养，具体如下：

（一）培养基制备：配制Luria-Bertani培养基（LB培养基），卡那霉素终浓度为50～100 mg/L。

（二）种子培养：挑取重组大肠杆菌单菌落接种至步骤（一）培养基，37 ℃，220 r/m震荡培养8～15 h。

（三）发酵培养：以2～6 %接种量接种至步骤（一）培养基，37 ℃，220 r/m震荡培养至发酵液在600 nm处吸光度值（OD₆₀₀）达到0.6～1.0。

（四）诱导表达：加入终浓度为0.05～0.1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），18～25 ℃下诱导表达8～12 h。

（五）后处理：首先，将发酵液在8000～12000 r/m离心10～20 min，弃掉上层清液；然后，将下层菌体用0.85 %氯化钠溶液震荡悬浮，8000～12000 r/m离心10～20 min一次，弃掉上层清液；接着，再用0.85 %氯化钠溶液重复洗涤、离心一次；最后，用1/20～1/10原始发酵液体积的0.85%氯化钠溶液悬浮菌体，得到湿菌体细胞。

第六步制备固定化细胞，具体如下：

（一）制备固定化载体：分别称取海藻酸钠0.5～6 g，聚乙烯醇1～10 g，用100～150 mL热水溶解，115℃灭菌20 min，冷却至室温；

（二）制备固定化细胞：将第五步（五）得到的湿菌体细胞与上一步骤的固定化载体，按照1:1～1：10体积比充分混合，将该混合液逐滴加入0～4℃ 0.1～4 %氯化钙和1～5%硼酸溶液中进行固化，然后置于0～4℃下冷却成型12～24 h，控制固定化颗粒粒度2～10mm。

（三）过滤洗涤：用200～300目筛网过滤固定化细胞，无菌水冲洗2～3次。

本发明所述透明质酸酶的重组大肠杆菌固定化细胞在制备微分子（5000-10000Da）透明质酸或其盐中的应用，其特征在于，含有如下步骤：

第一步配制浓度为2～5%（m/V）的高分子量（1000 KDa～2000 KDa）透明质酸或其盐溶液。

第二步加入10～30 %（m/V）比例的第六步所得固定化细胞，在30～40 ℃、100～150 r/m条件下反应4～10 h，反应完全后，将反应液用200～300目筛网过滤，分别得到微分子透明质酸或其盐溶液和固定化细胞颗粒。

第三步用无菌0.85%氯化钠溶液洗涤固定化细胞后，置于4℃冰箱保存，使用截留分子量为3 KDa的超滤膜浓缩低分子量透明质酸或其盐溶液，然后将浓缩液进行减压干燥，待水分＜5%后，粉碎、过100目筛得到微分子透明质酸钠。

有益效果：

本发明提供了一种重组大肠杆菌固定化细胞及在微分子透明质酸或其盐制备上的应用，本发明所述固定化细胞是指首先将透明质酸酶基因导入宿主大肠杆菌，其次将重组大肠杆菌发酵培养、诱导表达，最后对发酵液处理得到湿菌体细胞，对湿菌体细胞进行固定化，得到重组大肠杆菌固定化细胞，利用该固定化细胞催化水解高分子量透明质酸或其盐制备微分子透明质酸或其盐。本技术方案简单易行，固定化颗粒性能优异，可以重复使用30次，仍能保持90%左右的催化活力，其制备成本降低幅度30%以上，具有很高的工业化应用价值。

【

附图说明

】

图1 重组大肠杆菌野生型酶菌株与突变酶菌株的活力单位。

图2重组大肠杆菌固定化细胞相对酶活随使用次数的变化。

【

具体实施方式

】

下面结合具体实施实例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施实例1：含野生型透明质酸酶重组大肠杆菌的构建

（1）从NCBI基因库中获得Penicillium funiculosum天然透明质酸酶编码基因（GenBank: AB355480）；

（2）根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化得到优化后的基因序列，全基因合成并在5’端引入EcoR I酶切位点，3’端引入Not I酶切位点，并整合至质粒pET28(a+)获得重组质粒，将重组质粒转化大肠杆菌DH5α宿主菌，得到E.coli DH5α-pET28(a+)-PF。

（3）将E.coli DH5α-pET28(a+)-PF接入LB液体培养基，37℃，220 r/m活化培养15h，应用质粒小量提取试剂盒提取重组质粒pET28(a+)-PF。

（4）利用热激法将重组质粒pET28(a+)-PF转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有50 mg/L硫酸卡那霉素的LB固体培养基中，37℃培养15 h。挑选数个单菌落至LB培养基（含50 mg/L硫酸卡那霉素），37℃培养过夜，以菌液为模板进行PCR扩增，将扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳验证，PCR验证正确的菌株即为含野生型透明质酸酶重组大肠杆菌，命名为E.coli-BL21-pET28(a+)-PF。

实施实例2：含突变型高表达量透明质酸酶大肠杆菌的构建、筛选

根据实施例1所述内容，以含野生型透明质酸酶母本编码基因的重组质粒pET28(a+)-PF为模板，并用Primer 5.0设计并合成两端引物（表1），使用易错PCR技术（物料及浓度见表2，反应条件见表3），经过PCR反应后，获得含有线性基因片段的PCR产物，将这些PCR产物和pET28a(+)表达质粒分别进行双酶切（EcoRI、Not I）、纯化、连接和转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有50 mg/L 硫酸卡那霉素的LB琼脂平皿中，37℃培养过夜。

表1 随机突变引物序列

。

表2 50 μL易错PCR物料体系

。

表3 易错PCR反应条件

。

挑取上述培养皿上长出的单菌落接种于含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB 液体培养基中，37℃振荡培养15 h，离心收集菌体进行质粒提取、PCR 鉴定和双酶切鉴定（使用琼脂糖凝胶电泳进行检测），将正确的重组质粒命名为pET28a(+)-A-Z，并将含有正确的重组质粒的大肠杆菌进行诱导表达，具体操作为：将上述菌液转接于100 mL含50 μg/ml 硫酸卡那霉素的LB 液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度分别为0.05 mmol/L，在18 ℃下进行诱导表达12 h后，取出菌液，10000 r/m离心15 min收集菌体，用1/50-1/10原始发酵液体积的0.85%氯化钠溶液将菌体进行重悬，得到全细胞酶液。该全细胞酶液用于透明质酸酶酶活的测定，获得酶活力明显提高的菌株。

实施实例3：透明质酸酶的酶活测定

酶活定义：在38℃下、pH 5.5条件下，每小时从浓度为2 mg/mL的透明质酸钠溶液中，降解释放1 μg还原糖所需要的酶量为一个酶活单位。

标准空白：取200 μL纯水，加入到具塞试管中，加入800 μL 透明质酸钠底物溶液（2 mg/mL），震荡混匀，38 ℃水浴准确反应20 min，然后迅速放入沸水浴准确反应2 min，以终止酶反应，迅速冷却至室温，加入2 mL DNS显色剂，沸水浴准确反应5 min，迅速冷却至室温，加入7 mL纯水，震荡混匀；

酶空白：取200 μL预热后实施例2的全细胞酶液，加入到具塞试管中，加入2 mLDNS显色剂，加入800 μL 透明质酸钠底物溶液（2 mg/mL），震荡混匀，38 ℃水浴准确反应20min，然后迅速放入沸水浴准确反应5 min，迅速冷却至室温，加入7 mL纯水，震荡混匀，以标准空白样为对照，在540 nm处测定吸光值(A_B)；

样品：取200 μL预热后实施例2的全细胞酶液，加入到具塞试管中，加入800 μL 透明质酸钠底物溶液（2 mg/mL），震荡混匀，38 ℃水浴准确反应20 min，然后迅速放入沸水浴准确反应2 min，以终止酶反应，迅速冷却至室温，加入2 mL DNS显色剂，沸水浴准确反应5min，迅速冷却至室温，加入7 mL纯水，震荡混匀，以标准空白为对照，在540 nm处测定吸光值(A_E)；

酶活计算公式：

X_D----样品中透明质酸酶的活力，U/mL

A_E----酶反应液的吸光度

A_B----酶空白样的吸光度

C₀----标准曲线的截距

K----标准曲线的斜率

t----反应时间，20 min

V----加入酶液的体积，200 μL

1000----转化因子，1 mg=1000 μg

N----样品稀释倍数

选取酶活优于母本的正突变体重复实施例2操作，经过多次筛选，得到一株酶活力有明显提高的突变型菌株，命名为E.coli BL21-pET28a(+)-B93，酶活单位结果见表4，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

表4酶活有明显提高的突变菌株

。

实施实例4：高产酶菌株的发酵培养

将E.coli BL21-pET28a(+)-B93单菌落接种至含卡那霉素终浓度为50 mg/L的LB液体培养基，37 ℃，220 r/m培养15 h；以2 %接种量接种于新的含卡那霉素终浓度为50mg/L的LB液体培养基，37 ℃，220 r/m培养至OD₆₀₀达到0.8；加入终浓度为0.05 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），16 ℃下诱导表达8 h；取发酵液10000 r/m离心10 min，弃掉上清，使用0.85 %氯化钠溶液震荡悬浮菌体沉淀，离心弃上清，再重复洗涤沉淀、离心一次，最后用0.85%氯化钠溶液悬浮菌体，得到湿菌体细胞。

实施实例5：高产酶重组大肠杆菌细胞的固定化

制备固定化载体：分别称取海藻酸钠3 g，聚乙烯醇2 g，用100 mL热水溶解，115℃灭菌20 min，冷却至室温；

制备固定化细胞：取实施例4得到的湿菌体细胞20 g，与固定化载体充分混合，将该混合液逐滴加入4℃ 100-500 mL含4 %氯化钙和5 %硼酸溶液中进行固化，然后置于4-8℃下冷却成型24 h，控制固定化颗粒粒度5mm。

过滤洗涤：用200目筛网过滤固定化细胞，无菌水冲洗2次，得到固定化重组大肠杆菌细胞。

实施实例6-10：应用重组大肠杆菌固定化细胞制备微分子透明质酸钠

称取分子量为1000-2000 KDa的高分子量透明质酸钠2-5 g，加入100 mL纯化水，开启搅拌后，加入实施例5制备的固定化大肠杆菌细胞10-30 g，控制搅拌转速100-150 r/m，38±0.5℃下孵育5-6 h，将反应液用200 目的筛网过滤，得到固定化细胞和滤液，固定化细胞用无菌0.85%氯化钠溶液洗涤后，置于4℃冰箱保存，使用截留分子量为3 KDa的超滤膜浓缩滤液，浓缩5-10倍后，取浓缩液进行减压干燥，待物料水分＜5%后，停止干燥，取物料粉碎、过100目筛子得到微分子透明质酸钠，使用乌氏粘度计法测得其分子量4000-10000 Da。相关实验结果见表5。

表5 实施例6-10投料及产品情况

说明：1. 表中所述高分子量透明质酸钠为分子量1000-2000 KDa的透明质酸钠。

2. 表中所述固定化重组大肠杆菌细胞为实施例5所得固定化重组大肠杆菌细胞。

3. 表中所述“产品”指高分子量的透明质酸钠降解后得到的微分子量透明质酸钠。

核苷酸序列表

<110> 迪嘉药业集团有限公司迪沙（济南）药物研究有限公司

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<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 315

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Lys Thr Ser Thr Leu Ala Ala Ala Val Cys Gln Val Phe Leu Gly

1 5 10 15

Thr Arg Ala Val Ala Tyr Thr Leu His Trp Asp Val Asn Ser Ser Asn

20 25 30

Phe Leu Asp Tyr Phe Val Phe Asp Thr Glu Ala Asp Pro Thr Ala Gly

35 40 45

Phe Val Lys Tyr Val Asp Gln Ser Thr Ala Ser Asn Asp Gly Leu Tyr

50 55 60

Ser Thr Ser Asn Asn Gln Ile Tyr Leu Gly Val Asp Lys Thr Thr Val

65 70 75 80

Leu Asp Ser Ser Ser Thr Gly Arg Asn Ser Val Arg Val Tyr Ser Gln

85 90 95

Asn Thr Phe Ser Ser Gly Ile Leu Ile Thr Asp Phe Ala His Leu Pro

100 105 110

Val Ser Val Cys Gly Ile Trp Pro Ala Tyr Trp Thr Ile Asn Asn Gln

115 120 125

Ala Asn Pro Tyr Gly Glu Ile Asp Ile Tyr Glu Ala Tyr Asp Asp Val

130 135 140

Ala Gly Ala Tyr Val Ser Leu His Thr Ser Asn Thr His Thr Leu Ser

145 150 155 160

Asn Arg Asn Phe Thr Gly Thr Asp Thr Arg Thr Asp Cys Thr Leu Ser

165 170 175

Ser Gly Gly Gly Cys Gly Val Gln Ser Thr Ser Ser Gln Phe Gly Ala

180 185 190

Gly Phe Asn Ala Ala Gly Gly Gly Val Trp Val Leu Ser Leu Glu Asn

195 200 205

Ser Leu Gln Leu Trp Val Phe Pro Arg Asn Gln Ile Pro Ala Asp Ile

210 215 220

Thr Asn Gly Ser Pro Asn Pro Ser Ser Trp Gly Thr Pro Leu Phe Glu

225 230 235 240

Phe Asp Ser Asn Asn Gly Cys Asp Val Ser Ser Asn Phe Ile Asp Gln

245 250 255

Thr Val Ile Phe Asn Leu Asp Phe Cys Gly Gln Asn Gly Ala Gly Gly

260 265 270

Gln Glu Trp Ser Asp Trp Thr Asp Cys Ala Thr Thr Thr Gly Gln Ser

275 280 285

Thr Cys Asn Ala Tyr Val Ala Ala Asn Ser Ser Ala Tyr Ser Glu Thr

290 295 300

Tyr Phe Ser Ile Asn Ser Ile Lys Leu Tyr Gln

305 310 315

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<213> Artificial Sequence

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atgaaaacca gcaccttggc ggcggcggtg tgccaagttt tcttgggcac ccgcgcggtt 60

gcgtatacct tgcattggga tgtgaatagc agcaattttc tggattattt tgtgttcgac 120

accgaggcgg atccgaccgc gggttttgtt aaatatgtgg atcagagcac cgcgagcaat 180

gatggcctgt atagcaccag caataatcag atttatctgg gcgtggataa aaccaccgtg 240

ctggatagca gcagcaccgg ccgtaatagc gtgcgcgttt atagccagaa tacctttagc 300

agcggcattc tgattaccga ttttgcgcat ctgccggtga gcgtgtgcgg catttggccg 360

gcgtattgga ccattaataa tcaggcgaat ccgtatggcg aaattgatat ttatgaagcg 420

tatgacgatg tggcgggcgc gtatgtgagc ctgcatacca gtaataccca caccctgagc 480

aatcgcaatt ttaccggcac cgatacccgc accgattgca ccttaagcag cggcggtggt 540

tgcggcgttc agagcaccag tagtcaattt ggcgcgggct ttaatgcggc gggcggcggt 600

gtttgggttt tgagcttaga aaatagcctg cagctgtggg tgtttccgcg caatcagatt 660

ccggcggata ttaccaatgg cagcccgaat ccgagcagct ggggcacccc attatttgaa 720

tttgatagca ataatggctg cgacgtgagc agcaatttta ttgatcagac cgtgattttt 780

aacctggact tctgcggcca gaatggcgcg ggcggtcaag aatggagcga ttggaccgat 840

tgcgcgacca ccaccggcca aagcacttgt aatgcgtatg tggcggcgaa tagcagcgcg 900

tatagcgaaa cctattttag cattaatagc atcaagctgt atcagtga 948

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<110> 迪嘉药业集团有限公司迪沙（济南）药物研究有限公司

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<130> 20210619

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<170> SIPOSequenceListing 1.0