本发明提供了高效鉴定米曲霉CRISPR/Cas9突变体的方法,包括:1)构建基于AMA1自主复制质粒的米曲霉基因编辑系统;2)利用米曲霉曲酸合成基因评估步骤1)构建的米曲霉基因编辑系统,所述米曲霉曲酸合成基因选自kojA、kojR和kojT;3)将kojA的sgRNA和PAM序列置于DsRed的起始密码子后面,构建含有kojA的sgRNA和PAM序列的非功能性DsRed,以此评估非功能性DsRed作为报告基因用于筛选米曲霉CRISPR/Cas9突变体。本发明实现了从米曲霉CRISPR/Cas9突变株中批量的初步筛选突变体,避免了大量提取DNA的繁琐,无需进行批量的米曲霉转化子测序筛选。