具体实施方式

下面结合本发明的附图和实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明所提供的5-12-5三环二倍半萜骨架化合物Schultriene合成基因，是从Cytospora schulzeri 12565中克隆得到，命名为CcCS基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。CcCS基因含有3个内含子，其cDNA大小为2280bp，序列如SEQ ID NO.2所示。CcCS基因编码的蛋白，命名为CcCS蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

CcCS蛋白属于嵌合型萜类合成酶，其N端和C端分别负责萜类环化和异戊烯基转移功能。CcCS蛋白含有两个保守结构域，其中萜类环化酶结构域含有两个用来识别Mg²⁺和底物的特征性保守基序DDACE和NDYWSWPRE，E-IPPS结构域也含有两个具有相似功能的特征性保守基序DDIED和DDYMN(图9)。

实施例1：一种5-12-5三环二倍半萜骨架化合物Schultriene合成基因的异源表达及结构鉴定

利用异源表达的方法，将Cytospora schulzeri 12565菌体中的CcCS基因通过构建表达质粒转入宿主米曲霉中，检测异源表达菌株产物生产情况。所用到培养基配方如表1。

表1实施例所用到培养基配方

1.CcCS基因源表达载体的构建

(1)通过PCR技术，以C.schulzeri12565基因组为模板扩增得到含有CcCS的基因序列。扩增所用到的引物序列：

CcCS-F：cgGAATTCGAGCTCGATGCTTGAAGCAAACGAGCT(SEQ ID NO.4)；

CcCS-R：tactacaGATCCCCGGTCAAACTCGCAAGGTTTCCACCAG(SEQ ID NO.5)。

(2)将扩增得到的片段通过同源重组与pUARA2载体连接，构建pUARA2-CcCS表达质粒，该载体CcCS两侧与pUARA2载体具有一致的同源序列。

(3)连接产物转化到大肠杆菌DH10B中，通过氨苄青霉素筛选阳性转化子。液体培养阳性转化子，提取质粒PCR验证，获取pUARA2-CcCS质粒。

2.原生质体的转化

(1)将米曲霉Aspergillus oryzae NSAR1涂于PDA平板，30℃培养7d。

(2)收集孢子于10mL 0.1％Tween-80(一般需要收集1个平板的抱子)，用血球计数板计数。接种约10⁷个孢子于50mL DPY中，30℃、220rpm培养2-3d。

(3)称量100mg Yatalase，加入solution 0溶解，20ml用0.22μm滤膜过滤灭菌，加入到50ml离心管中。

(4)收集菌体。将培养好的100ml菌丝体倒入到P250玻璃过滤器中，去除培养基，用灭菌水清洗(或0.8M NaCl)3～5次，用灭菌药勺将水分挤干去除，然后将压干的菌体加入到Yatalase溶液中。30℃，200rpm震荡培养1-2小时，至球状菌丝体消失上清明显秽浊状为止。

(5)用Miracloth滤布过滤消化好的菌液，收集原生质体，转到新50ml离心管中，4℃，800g，5min离心。

(6)去除上清液，加入20ml，0.8M NaCl再悬浮清洗，4℃，800g，5min离心(清洗两次)。去除上清液，加10ml，0.8M NaCl。用细菌计数器在显微镜下数原生质体的数目。原生质体数目＝总计数/80×400ml×10⁴×稀释倍数。

(7)将原生质体浓度调成2×10⁸cell/ml。(sol 2/sol 3＝4/1)，依据菌体生长情况可收获0.5ml-2ml原生质体不等。

(8)取200μl的原生质体溶液移至新的50ml的离心管中，加入10μg表达质粒pUARA2-CcCS，轻轻地混匀。在冰上静置20min。期间将灭菌好的Top agar，在50℃水浴中保温。

(9)往(8)的混悬液中加入1ml的sol 3，用枪头轻轻的混匀。在室温下静置20min。加入10ml的sol 2，轻轻混匀。

(10)4℃，800g，10min离心，除去上清，加入1ml的sol 2，用移液枪轻轻地混悬，加入200μl到pUARA2质粒筛选固体培养基的中央(x3板)。在培养皿的周围迅速加入5ml 50℃保温的top agar，快速混匀。平板表面充分干燥后，用parafilm缠好，盖朝下，进行30℃培养3-7天。

(11)每平板挑2-3个克隆，共8个。将长出的转化子进行PCR验证，阳性转化子即为CcCS异源表达菌株AO-CcCS。

3、异源表达菌株AO-CcCS表达产物的检测

(1)接种异源表达菌株AO-CcCS于pUARA2质粒筛选液体培养基，30℃培养3d。

(2)8000rpm离心10min收发酵菌体，加入100ml等体积80％丙酮后超声破碎20min后，8000rpm离心10min,取上清。

(3)用2倍体积的乙酸乙酯萃取1次，用旋转蒸发仪旋干后用15mL甲醇(色谱级)溶解。

(4)取1mL甲醇溶液，经0.22μm滤膜过滤后置于色谱瓶中，即为GC-MS和LC-MS样品。

(5)将样品进行GC-MS检测：采用Agilent-HP-5MS色谱柱，起始温度60℃，以15℃/min的速度升至310℃，再以5℃/min的速度升至310℃，保持13min。GC-MS方法参数如下：Sample模块：进样前后洗针次数5次，样品洗针次数2次，粘度补偿时间0.2s，进样模式为normal。GC模块：柱温50℃，进样温度270℃，进样模式为不分流(splitness)，载气为氦气，流速控制模式为线性，总流速10mL/min，柱温控制程序如表3.5。MS模块：MS离子源温度230℃，界面温度270℃，溶剂切除时间2.5min采集时间3min-60min，采集模式为全扫描，eventtime设置为0.3s，扫描速度为2000，扫描核质比为40-600Da。

(7)将样品进行LC-MS检测：采用Cholester色谱柱，流动相A相-0.1％甲酸水，B相-乙腈，流速为1mL/min，30min内流动相乙腈的比例由5％上升到100％，然后维持6min，之后10s内流动相乙腈的比例降至5％，然后维持4min 50s。

4、异源表达重组菌株AO-CcCS二倍半萜骨架产物分离纯化及鉴定

AO-CcCS共发酵10L，得到约2g粗提物。对得到的发酵粗提物首先采用正向硅胶柱层析方法进行分离纯化。采用干法上柱，石油醚等度洗脱，每10mL流出液收集一管，共收集得到18个流份，TLC快速检测各流份，合并斑点相同流份，减压浓缩旋蒸至干并转至已称重样品瓶中，称量样品并记录重量。HPLC分析各流份组分，精确定位目标流份。优化制备条件，选用Cholester半制备色谱柱制备目标化合物，流动相：A相-0.1％甲酸水；B相-乙腈，流速为4mL/min，95％乙腈甲酸等度，初始进样10μL，在保证峰型不变的基础上，逐渐加大进样量至80μL，目标二倍半萜化合物峰会在20min左右出现，在峰出现的时候将流出溶液接到锥形瓶中即可。对制备到的化合物TLC及HPLC进行纯度检验。

分离的二倍半萜骨架化合物的NMR测试采用Bruker 600MHz(¹H 600MHz；¹³C150MHz)。二倍半萜骨架化合物的溶剂为Benzene-d₆，NMR谱仪器分辨率为600MHz，先进行¹HNMR和¹³C NMR的测定，将其与数据库中的数据做对比，若为新结构，则再补全HSQC，COSY，HMBC谱图解谱确定具体结构。

5、鉴定二倍半萜骨架化合物Schultriene。

将上述得到的二倍半萜骨架化合物Schultriene进行鉴定：

(1)外观：为透明油脂状。

(2)溶解性：易溶于甲醇，难溶于水。

(3)核磁共振谱：图1为本发明化合物Schultriene溶于Benzene-d₆中的¹H-NMR谱图。图2为本发明化合物Schultriene溶于Benzene-d₆中的¹³C-NMR谱图。图3为本发明化合物Schultriene溶于Benzene-d₆中¹³C-DEPT 135谱。图4为本发明化合物Schultriene溶于Benzene-d₆中的¹H-¹H COSY谱。图5为本发明化合物Schultriene溶于Benzene-d₆中的HSQC谱图。图6为本发明化合物Schultriene溶于Benzene-d₆中的HMBC谱图。图7为本发明化合物Schultriene溶于Benzene-d₆中的NOESY谱图。对本发明化合物Schultriene的核磁共振谱进行了研究并对1D和2D谱各信号进行了归属，见表2。并最终确定结构如下：

表2化合物fusaoxyspene A的1D和2D谱各峰归属

本发明背景技术中所涉及的参考文献如下：

[1]Guan,Z.et al.Metabolic engineering of Bacillus subtilis forterpenoid production.Applied Microbiology andbiotechnology 99,9395-9406(2015).

[2]Chang,M.C.&Keasling,J.D.Production of isoprenoid pharmaceuticalsby engineered microbes.Nature chemical biology 2,674-681(2006).

[3]Leung,P.C.,Taylor,W.A.,Wang,J.H.&Tipton,C.L.Role of calmodulininhibition in the mode ofaction ofophiobolinA.Plant physiology 77,303-308(1985).

[4]Nozoe,S.et al.The structure of ophiobolin,a C25 terpenoid having anovel skeleton.Journal ofthe American Chemical Society 87,4968-4970(1965).

[5]Peters,C.&Mayer,A.Ca 2+/calmodulin signals the completionofdocking and triggers a late step ofvacuole fusion.Nature 396,575-580(1998).

[6]Jiang,N.,Yang,Q.,Fan,X.-L.&Tian,C.-M.Identification of sixCytospora species on Chinese chestnut in China.MycoKeys 62,1(2020).

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一类5-12-5三环二倍半萜骨架化合物及其制备

<130> 权利要求书、说明书

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2483

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 1

atgcttgaag caaacgagct ctacccctat tcagttgctg ttgaccgaga tgaggtagta 60

cagtctggtg ctttgacatc tctccctgtg aggatacatc gatataacca ccttgccgac 120

gctggggcgc tgtgtttgac caacgactgg cgttgtacca tgaaagatgg acaagaccga 180

aagtccaatg gctcgccatg tgttgtaggg aattggggaa gttttatttg gccggagagg 240

taagtctaga tagttgtgaa aatgggacag cgctcatact acaatcgaca cggagatgta 300

cttcagtgca cgggtggcta actacagcgc tggtagtcga ccagaaagac ttgggctcct 360

ctgctacctg ttagatgcag gttgttttca cgatggtatg taagaacact caccctcgtg 420

agtagacagc cgctgacagc tttggataga tgcttgtgag gagatgccca tcgccgcagc 480

tcaccaagaa cacttggact tggacgcagc tatggacgtt gaggaccggc gagagttgag 540

tagtgattca cggtccttgc ggacaaaaca actcatctcc aacgctgttc ttgaatgcat 600

caaggtcgac agagtgggcg ctatgcgtat gctggaagcc tacagaaaga aatggctgcg 660

tattatggag acatacaaca ccgaggagat caacactgtt gaagactatt tccttgcacg 720

agcaaacaat gggggaatgg ggtaagtaga gcttccacca tttcacgtgg acatgaactg 780

acgatggccc cagagcgtac tacgccatgc ttgagttctc tctgggcatt ttggtcaccg 840

acgaggaata cgagatgatg gctgaaccca ttgcacatgt ggaacggtgc atgcttctta 900

ccaacgatta ctggagctgg ccacgtgaac gcaagcaagc cgagtaccag gaggctggaa 960

aggtcttcaa catcgtgtgg ttcctgaaga aaattgagct ctgcaccgaa gaagaggcag 1020

tgtcaaaagt ccgtgatatg gttcatgcag aagagcggaa ctggactgct gccaaaactc 1080

gcctgtacag tcagttcggt aacctgcggc aggacttggt caagttcttg gagaatttgc 1140

acacggcact ggcgggcaac gactattgga gttcgcagtg ttaccgccac aatgactggg 1200

agcacatccc agatcttcct ggcgaggacg caccaaaact tcacgaactt gccaccctag 1260

gtcgacgatt attgctggac gaagatctac cgcccggggc ttcgacctat ggacaggata 1320

cggatgcgga cagcgcgagg ttcactgaat gcaagccatc cgtgggtacc gtctctggtg 1380

atgaaactca gtcactcccg ggcaggagca cgtccggcga agaatcggct tctgggtaca 1440

tgtactccat ctcatcagcc agtgccccac caagtccttc caaagagcac caatcctcat 1500

atccgagcat cccctaccag tcgtctgcgc acgtcgcggg tgatcttgac tctccagtct 1560

tgagggaacc gatcaagtac atcaggaaca tgccgtccaa gaaccttcga acacaactga 1620

tcgactgctt caacatctgg ctaaatgcct ctgggcctgc gatttcggtc atcaaagaag 1680

tcattgactg cctgcaccat tcctcactga tcctggatga catcgaggac ggttcacatc 1740

tacgacgcgg gtttccagcc actcatgtcg tctacggaac atgtcaggcc gtcaacagcg 1800

ccacgtttct ctacgtccaa gcagtggaga gcgtccacgc cgccgcccgg aacaaccccg 1860

agatgatgga cgtctttttg aaacacctga ggcagctgtt caacggccaa agctgggacc 1920

tgtactggac gtaccaccgc caatgcccta ccgaggagca atacctggac atggtagatc 1980

agaaaactgg cgccatgttg caattgttag tgggcttgat gcagacggcg cagccgcagc 2040

atccagggaa ggttggcggc gttgtccata gtgaggtcct cttcaggttc acacagttgt 2100

ttggccgatt cttccaggtc cgtgacgact atatgaacct cacgtcgaca gactacgctc 2160

ggcagaaggg ctttgctgag gacctcgacg agcagaagtt ctcgtacatg atagtacaca 2220

tgtaccagag ataccccgag gcgaaggaca aggtcgaggg tgtcttcagg gcgatgcaac 2280

agggtggcat ctcacaggtt gcagctgaca cgagcaagag gtacatcttg tccatccttg 2340

acgagacagg ctcaaccgca gctaccaagg cactgctatt aaagtggcat gacgagatta 2400

cggaggagat tggggctttg gagaggcatt ttggggttga taatgcctta cttcgcttgc 2460

tggtggaaac cttgcgagtt tga 2483

<210> 2

<211> 2280

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 2

atgcttgaag caaacgagct ctacccctat tcagttgctg ttgaccgaga tgaggtagta 60

cagtctggtg ctttgacatc tctccctgtg aggatacatc gatataacca ccttgccgac 120

gctggggcgc tgtgtttgac caacgactgg cgttgtacca tgaaagatgg acaagaccga 180

aagtccaatg gctcgccatg tgttgtaggg aattggggaa gttttatttg gccggagagt 240

cgaccagaaa gacttgggct cctctgctac ctgttagatg caggttgttt tcacgatgat 300

gcttgtgagg agatgcccat cgccgcagct caccaagaac acttggactt ggacgcagct 360

atggacgttg aggaccggcg agagttgagt agtgattcac ggtccttgcg gacaaaacaa 420

ctcatctcca acgctgttct tgaatgcatc aaggtcgaca gagtgggcgc tatgcgtatg 480

ctggaagcct acagaaagaa atggctgcgt attatggaga catacaacac cgaggagatc 540

aacactgttg aagactattt ccttgcacga gcaaacaatg ggggaatggg agcgtactac 600

gccatgcttg agttctctct gggcattttg gtcaccgacg aggaatacga gatgatggct 660

gaacccattg cacatgtgga acggtgcatg cttcttacca acgattactg gagctggcca 720

cgtgaacgca agcaagccga gtaccaggag gctggaaagg tcttcaacat cgtgtggttc 780

ctgaagaaaa ttgagctctg caccgaagaa gaggcagtgt caaaagtccg tgatatggtt 840

catgcagaag agcggaactg gactgctgcc aaaactcgcc tgtacagtca gttcggtaac 900

ctgcggcagg acttggtcaa gttcttggag aatttgcaca cggcactggc gggcaacgac 960

tattggagtt cgcagtgtta ccgccacaat gactgggagc acatcccaga tcttcctggc 1020

gaggacgcac caaaacttca cgaacttgcc accctaggtc gacgattatt gctggacgaa 1080

gatctaccgc ccggggcttc gacctatgga caggatacgg atgcggacag cgcgaggttc 1140

actgaatgca agccatccgt gggtaccgtc tctggtgatg aaactcagtc actcccgggc 1200

aggagcacgt ccggcgaaga atcggcttct gggtacatgt actccatctc atcagccagt 1260

gccccaccaa gtccttccaa agagcaccaa tcctcatatc cgagcatccc ctaccagtcg 1320

tctgcgcacg tcgcgggtga tcttgactct ccagtcttga gggaaccgat caagtacatc 1380

aggaacatgc cgtccaagaa ccttcgaaca caactgatcg actgcttcaa catctggcta 1440

aatgcctctg ggcctgcgat ttcggtcatc aaagaagtca ttgactgcct gcaccattcc 1500

tcactgatcc tggatgacat cgaggacggt tcacatctac gacgcgggtt tccagccact 1560

catgtcgtct acggaacatg tcaggccgtc aacagcgcca cgtttctcta cgtccaagca 1620

gtggagagcg tccacgccgc cgcccggaac aaccccgaga tgatggacgt ctttttgaaa 1680

cacctgaggc agctgttcaa cggccaaagc tgggacctgt actggacgta ccaccgccaa 1740

tgccctaccg aggagcaata cctggacatg gtagatcaga aaactggcgc catgttgcaa 1800

ttgttagtgg gcttgatgca gacggcgcag ccgcagcatc cagggaaggt tggcggcgtt 1860

gtccatagtg aggtcctctt caggttcaca cagttgtttg gccgattctt ccaggtccgt 1920

gacgactata tgaacctcac gtcgacagac tacgctcggc agaagggctt tgctgaggac 1980

ctcgacgagc agaagttctc gtacatgata gtacacatgt accagagata ccccgaggcg 2040

aaggacaagg tcgagggtgt cttcagggcg atgcaacagg gtggcatctc acaggttgca 2100

gctgacacga gcaagaggta catcttgtcc atccttgacg agacaggctc aaccgcagct 2160

accaaggcac tgctattaaa gtggcatgac gagattacgg aggagattgg ggctttggag 2220

aggcattttg gggttgataa tgccttactt cgcttgctgg tggaaacctt gcgagtttga 2280

<210> 3

<211> 759

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 3

Met Leu Glu Ala Asn Glu Leu Tyr Pro Tyr Ser Val Ala Val Asp Arg

1 5 10 15

Asp Glu Val Val Gln Ser Gly Ala Leu Thr Ser Leu Pro Val Arg Ile

20 25 30

His Arg Tyr Asn His Leu Ala Asp Ala Gly Ala Leu Cys Leu Thr Asn

35 40 45

Asp Trp Arg Cys Thr Met Lys Asp Gly Gln Asp Arg Lys Ser Asn Gly

50 55 60

Ser Pro Cys Val Val Gly Asn Trp Gly Ser Phe Ile Trp Pro Glu Ser

65 70 75 80

Arg Pro Glu Arg Leu Gly Leu Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Ala Gly Cys

85 90 95

Phe His Asp Asp Ala Cys Glu Glu Met Pro Ile Ala Ala Ala His Gln

100 105 110

Glu His Leu Asp Leu Asp Ala Ala Met Asp Val Glu Asp Arg Arg Glu

115 120 125

Leu Ser Ser Asp Ser Arg Ser Leu Arg Thr Lys Gln Leu Ile Ser Asn

130 135 140

Ala Val Leu Glu Cys Ile Lys Val Asp Arg Val Gly Ala Met Arg Met

145 150 155 160

Leu Glu Ala Tyr Arg Lys Lys Trp Leu Arg Ile Met Glu Thr Tyr Asn

165 170 175

Thr Glu Glu Ile Asn Thr Val Glu Asp Tyr Phe Leu Ala Arg Ala Asn

180 185 190

Asn Gly Gly Met Gly Ala Tyr Tyr Ala Met Leu Glu Phe Ser Leu Gly

195 200 205

Ile Leu Val Thr Asp Glu Glu Tyr Glu Met Met Ala Glu Pro Ile Ala

210 215 220

His Val Glu Arg Cys Met Leu Leu Thr Asn Asp Tyr Trp Ser Trp Pro

225 230 235 240

Arg Glu Arg Lys Gln Ala Glu Tyr Gln Glu Ala Gly Lys Val Phe Asn

245 250 255

Ile Val Trp Phe Leu Lys Lys Ile Glu Leu Cys Thr Glu Glu Glu Ala

260 265 270

Val Ser Lys Val Arg Asp Met Val His Ala Glu Glu Arg Asn Trp Thr

275 280 285

Ala Ala Lys Thr Arg Leu Tyr Ser Gln Phe Gly Asn Leu Arg Gln Asp

290 295 300

Leu Val Lys Phe Leu Glu Asn Leu His Thr Ala Leu Ala Gly Asn Asp

305 310 315 320

Tyr Trp Ser Ser Gln Cys Tyr Arg His Asn Asp Trp Glu His Ile Pro

325 330 335

Asp Leu Pro Gly Glu Asp Ala Pro Lys Leu His Glu Leu Ala Thr Leu

340 345 350

Gly Arg Arg Leu Leu Leu Asp Glu Asp Leu Pro Pro Gly Ala Ser Thr

355 360 365

Tyr Gly Gln Asp Thr Asp Ala Asp Ser Ala Arg Phe Thr Glu Cys Lys

370 375 380

Pro Ser Val Gly Thr Val Ser Gly Asp Glu Thr Gln Ser Leu Pro Gly

385 390 395 400

Arg Ser Thr Ser Gly Glu Glu Ser Ala Ser Gly Tyr Met Tyr Ser Ile

405 410 415

Ser Ser Ala Ser Ala Pro Pro Ser Pro Ser Lys Glu His Gln Ser Ser

420 425 430

Tyr Pro Ser Ile Pro Tyr Gln Ser Ser Ala His Val Ala Gly Asp Leu

435 440 445

Asp Ser Pro Val Leu Arg Glu Pro Ile Lys Tyr Ile Arg Asn Met Pro

450 455 460

Ser Lys Asn Leu Arg Thr Gln Leu Ile Asp Cys Phe Asn Ile Trp Leu

465 470 475 480

Asn Ala Ser Gly Pro Ala Ile Ser Val Ile Lys Glu Val Ile Asp Cys

485 490 495

Leu His His Ser Ser Leu Ile Leu Asp Asp Ile Glu Asp Gly Ser His

500 505 510

Leu Arg Arg Gly Phe Pro Ala Thr His Val Val Tyr Gly Thr Cys Gln

515 520 525

Ala Val Asn Ser Ala Thr Phe Leu Tyr Val Gln Ala Val Glu Ser Val

530 535 540

His Ala Ala Ala Arg Asn Asn Pro Glu Met Met Asp Val Phe Leu Lys

545 550 555 560

His Leu Arg Gln Leu Phe Asn Gly Gln Ser Trp Asp Leu Tyr Trp Thr

565 570 575

Tyr His Arg Gln Cys Pro Thr Glu Glu Gln Tyr Leu Asp Met Val Asp

580 585 590

Gln Lys Thr Gly Ala Met Leu Gln Leu Leu Val Gly Leu Met Gln Thr

595 600 605

Ala Gln Pro Gln His Pro Gly Lys Val Gly Gly Val Val His Ser Glu

610 615 620

Val Leu Phe Arg Phe Thr Gln Leu Phe Gly Arg Phe Phe Gln Val Arg

625 630 635 640

Asp Asp Tyr Met Asn Leu Thr Ser Thr Asp Tyr Ala Arg Gln Lys Gly

645 650 655

Phe Ala Glu Asp Leu Asp Glu Gln Lys Phe Ser Tyr Met Ile Val His

660 665 670

Met Tyr Gln Arg Tyr Pro Glu Ala Lys Asp Lys Val Glu Gly Val Phe

675 680 685

Arg Ala Met Gln Gln Gly Gly Ile Ser Gln Val Ala Ala Asp Thr Ser

690 695 700

Lys Arg Tyr Ile Leu Ser Ile Leu Asp Glu Thr Gly Ser Thr Ala Ala

705 710 715 720

Thr Lys Ala Leu Leu Leu Lys Trp His Asp Glu Ile Thr Glu Glu Ile

725 730 735

Gly Ala Leu Glu Arg His Phe Gly Val Asp Asn Ala Leu Leu Arg Leu

740 745 750

Leu Val Glu Thr Leu Arg Val

755

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 4

cggaattcga gctcgatgct tgaagcaaac gagct 35

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 5

tactacagat ccccggtcaa actcgcaagg tttccaccag 40