基于lux报告系统的猪链球菌发光菌及其构建方法

文档序号：3245 发布日期：2021-09-17 浏览：49次英文

技术领域

本发明涉及生物

技术领域

，具体涉及基于lux报告系统的猪链球菌发光菌及其构建方法。

背景技术

猪链球菌是一种重要的人兽共患病病原体，每年都会给猪养殖业造成巨大的损失，近年来，人感染猪链球菌的病例每年仍有报道，在东南亚地区，尤其是泰国和越南，猪链球菌感染已经成为越南成人脑膜炎的首要病因，在泰国成人脑膜炎病因中排名第二位，引起了人们越来越多的关注，关于猪链球菌的感染途径以及其相关的毒力因子是猪链球菌研究中的重点。虽然之前有报道基于绿色荧光蛋白来实现对猪链球菌的示踪观察，但是只能在体外实验中使用，无法在动物体内进行实时观察。

来源于发光细菌的lux报告系统的核心元件包括luxA、B、C、D、E五个基因，其中luxA、luxB分别编码荧光酶的α和β亚基,而luxC、luxD、luxE分别编码依赖NADPH的脂肪酸还原酶、酰基转移酶和ATP合成酶，三者共同构成脂肪酸还原酶复合体，产生长链脂肪醛作为发光反应的电子供体。因其具有即时性和高灵敏度，在分子生物学、临床微生物及生化检测中呈现出潜在的应用价值。肺炎链球菌、化脓链球菌以及金黄色葡萄球菌等致病菌均有基于该系统构建的发光菌的报道，在细菌的感染进程以及致病机制研究中发挥了重要的作用。

发明内容

为了有效解决上述技术问题，本发明旨在提供一种可以在动物体内进行实时观察的基于lux报告系统的猪链球菌发光菌及其构建方法。

第一方面，本发明要求保护一种猪链球菌发光菌。

本发明要求保护的猪链球菌发光菌是将荧光素酶报告系统敲入片段定点插入到猪链球菌的基因组中SSU05_0518基因和SSU05_0519基因之间后得到的。其中，所述SSU05_0518基因和SSU05_0519基因为NCBI的Refseq数据库里面的05ZYH33菌株的基因注释。其中，所述“将荧光素酶报告系统敲入片段定点插入到猪链球菌的基因组中SSU05_0518基因和SSU05_0519基因之间”可包括将所述荧光素酶报告系统敲入片段取代猪链球菌的基因组中SSU05_0518基因和SSU05_0519基因之间的部分序列。

所述荧光素酶报告系统敲入片段自5’端到3’端依次包含表达盒1、表达盒2和表达盒3；所述表达盒1用于表达荧光素酶报告系统的基因簇luxAB；所述表达盒2用于表达荧光素酶报告系统的基因簇luxCDE；所述表达盒3用于表达抗性标记基因。

进一步地，在所述表达盒2中，启动所述基因簇luxCDE转录的启动子可为CP25G启动子；所述CP25G启动子是以CP25启动子为基础，经改造后得到的带有AGGAGG序列的启动子。

更进一步地，所述CP25G启动子的核苷酸序列可如SEQ ID No.1的第3437-3573位所示。

进一步地，在所述表达盒1中，启动所述基因簇luxAB转录的启动子可为147AGGAGG启动子或1647AGGAGG启动子或1647启动子。

所述147AGGAGG启动子为以猪链球菌基因组中SSU05_0147基因启动子为基础，经改造后得到的带有AGGAGG序列的启动子。所述1647AGGAGG启动子为以猪链球菌基因组中SSU05_1647基因启动子为基础，经改造后得到的带有AGGAGG序列的启动子。所述1647启动子为猪链球菌基因组中SSU05_1647基因启动子。

更进一步地，所述147AGGAGG启动子的核苷酸序列可如SEQ ID No.1的第1171-1351位所示；所述1647AGGAGG启动子的核苷酸序列可如SEQ ID No.2的第1171-1282位所示；所述1647启动子的核苷酸序列可如SEQ ID No.3的第1171-1271位所示。

进一步地，在所述表达盒3中，所述抗性标记基因可为氯霉素抗性基因。

在本发明的一个实例中，所述表达盒1的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第1171-3436位所示；所述表达盒2的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第3437-7090位所示；所述表达盒3的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第7091-8146位所示。相应的，所述荧光素酶报告系统敲入片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第1171-8146位所示(对应组合7)。

在本发明的另一个实例中，所述表达盒1的核苷酸序列如SEQ ID No.2的第1171-3367位所示；所述表达盒2的核苷酸序列如SEQ ID No.2的第3368-7021位所示；所述表达盒3的核苷酸序列如SEQ ID No.2的第7022-8077位所示。相应的，所述荧光素酶报告系统敲入片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第1171-8077位所示(对应组合5)。

在本发明的再一个实例中，所述表达盒1的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第1171-3356位所示；所述表达盒2的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第3357-7010位所示；所述表达盒3的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第7011-8066位所示。相应的，所述荧光素酶报告系统敲入片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第1171-8066位所示(对应组合3)。

在本发明的

具体实施方式

中，所述荧光素酶报告系统敲入片段具体是取代了猪链球菌的基因组中SEQ ID No.4所示序列的第1350-1424位。

进一步地，所述猪链球菌发光菌可按照包括如下步骤的方法制备得到：利用同源重组将所述荧光素酶报告系统敲入片段定点插入到猪链球菌的SSU05_0518基因和SSU05_0519基因之间，即得所述猪链球菌发光菌。

进行所述同源重组时，采用的上游同源臂的序列如SEQ ID No.1的第1-1170位(即SEQ ID No.2的第1-1170位，或者SEQ ID No.3的第1-1170位)所示，下游同源臂的序列如SEQ ID No.1的第8147-9379位(即SEQ ID No.2的第8078-9310位，或者SEQ ID No.3的第8067-9299位)所示。

更进一步地，所述猪链球菌发光菌可按照包括如下任一步骤的方法制备得到：

P1、通过自然转化将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA片段导入猪链球菌，通过同源重组实现所述荧光素酶报告系统敲入片段定点插入猪链球菌的SSU05_0518基因和SSU05_0519基因之间，得到所述猪链球菌发光菌(对应组合7)；

P2、通过自然转化将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA片段导入猪链球菌，通过同源重组实现所述荧光素酶报告系统敲入片段定点插入猪链球菌的SSU05_0518基因和SSU05_0519基因之间，得到所述猪链球菌发光菌(对应组合5)；

P3、通过自然转化将核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段导入猪链球菌，通过同源重组实现所述荧光素酶报告系统敲入片段定点插入猪链球菌的SSU05_0518基因和SSU05_0519基因之间，得到所述猪链球菌发光菌(对应组合3)。

其中，在进行所述自然转化的过程中包括向体系中加入多肽ComS_13-21的步骤。该多肽可以刺激猪链球菌收集菌体周围的核酸，从而将敲入片段吸收进菌体后发生同源重组。

第二方面，本发明要求保护一种构建猪链球菌发光菌的方法。

本发明要求保护的构建猪链球菌发光菌的方法，可包括前文第一方面中所述的相关步骤。

在前文第一方面或第二方面中，所述猪链球菌可为2型猪链球菌。

在本发明的具体实施方式中，所述猪链球菌具体为猪链球菌05ZYH33。

第三方面，本发明要求保护前文第一方面所述猪链球菌发光菌在动物活体成像中的非疾病诊断性应用。

其中，所述动物可为小鼠。

本发明通过设计7种猪链球菌发光菌的构建策略，优化筛选不同的启动子，最终建立了一种基于lux报告系统的猪链球菌发光菌的构建方法，可以在小鼠体内实时观察到细菌，在猪链球菌的感染途径及致病机制研究上具有一定的应用前景。

附图说明

图1为lux基因簇插入位置示意图。

图2为本发明7种构建策略示意图。注：1647为猪链球菌内源的SSU05_1647基因启动子；1647AGGAGG为带AGGAGG序列的SSU05_1647基因启动子；147AGGAGG为带AGGAGG序列的SSU05_0147基因启动子；CP25为CP25启动子；CP25G是以CP25启动子为基础，加了一个G碱基以组成AGGAGG序列的启动子。

图3为不同组合下的敲入片段。

图4为不同组合下发光菌成像。

图5为各发光菌荧光值。WT表示未经改造的猪链球菌野生株05ZYH33。

图6为小鼠活体成像观察。注：最左侧为野生株感染的小鼠，后四只为发光菌感染的小鼠。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、基于lux报告系统的猪链球菌发光菌的构建

一、实验材料

1、实验菌株及质粒

猪链球菌野生株05ZYH33：一种猪链球菌2型强毒株，实验室保存。记载于“WenhuaHuang,et al.LytR plays a role in normal septum formation and contributes tofull virulence in Streptococcus suis.Veterinary Microbiology,254(2021)”一文。公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。

质粒pSET1：温度敏感型自杀质粒，氯霉素抗性，实验室保存。记载于“WenhuaHuang,et al.LytR plays a role in normal septum formation and contributes tofull virulence in Streptococcus suis.Veterinary Microbiology,254(2021)”一文。公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。

质粒pXen5：大肠杆菌-革兰氏阳性菌穿梭质粒，提供lux报告系统，美国caliper公司产品。

2、引物及多肽序列

具体如表1所示。

表1、本发明所涉及的引物及多肽序列

3、实验试剂

如表2所示。

表2、本发明所涉及的实验试剂

4、实验设备

如表3所示。

表3、本发明所涉及的实验设备

二、实验方法

1、敲入片段设计

在原核生物中表达的lux报告系统主要有两种类型：以基因组为载体的lux报告系统和以质粒为载体的lux报告系统。以质粒为载体的lux报告系统，培养过程中需要使用抗生素以防止质粒丢失，而此举会限制报告菌株在活体动物内的应用。故本发明采用插入猪链球菌基因组的方法进行构建。之前的研究一般通过转座子将lux报告系统随机插入到基因组上，不仅插入的个数不能控制，而且可能会插入某些关键基因内，比如某些重要的毒力因子等，本发明的敲入系统可以实现定向插入细菌基因组，插入位置是可控的，通过查看05ZYH33的基因座位，为了防止lux基因簇的插入影响上下游基因的转录，本发明最终选择在SSU05_0518基因和SSU05_0519基因之间插入，插入位置附近的基因分布示意如图1所示。具体是取代了猪链球菌05ZYH33的基因组中SEQ ID No.4所示序列的第1350-1422位。

lux报告系统是一个较大的基因簇，分为luxAB和luxCDE两部分，需要强启动子对其进行转录和翻译。本发明将luxAB和luxCDE两部分分开转录，以提高该系统的转录水平。本发明最终选取了猪链球菌内源的SSU05_1647、SSU05_0147两个基因的启动子及人工合成的CP25启动子为候选的强启动子。pXen5质粒含有针对革兰氏阳性菌进行优化后lux报告系统，在每个基因转录起始位点前均加入了AGGAGG序列，以提高基因的转录水平，故本发明也在三个启动子后加上了AGGAGG序列或碱基G来组成AGGAGG，共尝试了以下七种组合，如图2所示。

2、含不同启动子的lux报告系统敲入片段的搭建

以猪链球菌野生株05ZYH33基因组为模板，扩增得到上游同源臂、下游同源臂、SSU05_0147基因启动子(包括带AGGAGG的和不带AGGAGG的)、SSU05_1647基因启动子(包括带AGGAGG的和不带AGGAGG的)；以上海生工生物工程有限公司合成的CP25基因为模板，扩增CP25启动子(包括带G的和不带G的)；以pSET1质粒为模板，扩增得到氯霉素抗性基因盒；以pXen5质粒为模板，扩增得到luxAB及luxCDE片段(各引物序列见表1)。得到各个片段后，再按照顺序(图2所示7种组合)依次使用重叠PCR进行连接。使用的PCR反应试剂为PrimeSTARMax DNA Polymerase，PCR反应体系及反应程序如下：

PCR反应体系：PrimeSTAR Max DNA Polymerase 25μL；上游引物(10μM)1μL；下游引物(10μM)1μL；模板2μL；水21μL。

PCR反应程序：98℃10s，55℃5s，72℃5s/kb，32个循环。

对应图2中7种组合的最终PCR产物经序列测定后证实序列正确。

其中，对应图2中“组合7”的最终PCR产物序列如SEQ ID No.1所示。SEQ ID No.1的第1-1170位为上游同源臂序列，第1171-1351位为147AGGAGG启动子的序列，第1352-3436位为基因簇luxAB的序列，第3437-3573位为CP25G启动子的序列，第3574-7090位为基因簇luxCDE的序列，第7091-8146位为氯霉素抗性基因盒的序列，第8147-9379位为下游同源臂序列。

对应图2中“组合5”的最终PCR产物序列如SEQ ID No.2所示。SEQ ID No.2的第1-1170位为上游同源臂序列，第1171-1282位为1647AGGAGG启动子的序列，第1283-3367位为基因簇luxAB的序列，第3368-3504位为CP25G启动子的序列，第3505-7021位为基因簇luxCDE的序列，第7022-8077位为氯霉素抗性基因盒的序列，第8078-9310位为下游同源臂序列。

对应图2中“组合3”的最终PCR产物序列如SEQ ID No.2所示。SEQ ID No.2的第1-1170位为上游同源臂序列，第1171-1271位为1647启动子的序列，第1272-3356位为基因簇luxAB的序列，第3357-3493位为CP25G启动子的序列，第3494-7010位为基因簇luxCDE的序列，第7011-8066位为氯霉素抗性基因盒的序列，第8067-9299位为下游同源臂序列。

3、通过自然转化将Lux报告系统敲入猪链球菌05ZYH33的基因组

接种猪链球菌野生株05ZYH33于5mL THY培养基中，待培养至OD₆₀₀＝0.6时，取100μL菌液转接至5mL THY培养基中，37℃培养箱静置培养，1h后取100μL菌液至无菌的1.5mL离心管中，加入1.2μg步骤2中PCR得到的含lux发光系统的敲入片段及10μl 2.5mM的多肽ComS_13-21，混合均匀后于37℃静置孵育2h，之后涂布于含5μg/mL氯霉素的THY平板上，37℃静置培养12h，抗性平板上生长的菌为待筛选发光菌。

4、评价不同启动子下的发光强度

(1)使用美国bio-rad公司ChemiDocXRS+高灵敏度化学发光成像仪对抗性平板上的菌进行成像，评价不同组合下细菌能否发光，并筛选重组成功的发光菌；

(2)抗性平板上的菌挑单克隆于THY氯霉素抗性培养基中复苏，培养至对数后期，每种菌取500μL菌液，离心富集弃上清，使用PBS将菌体清洗一遍后，统一调整OD₆₀₀＝0.4以保证菌量一致，每种菌取调整后的200μL液体于96孔酶联板中，使用96Microplate Luminometer检测每孔的发光强度。

5、小鼠活体成像观察构建菌株的发光效果

经过发光强度评价，最终确定组合7(对应图2)下的菌株发光强度最高，将其接种于THY液体培养基中，待菌株培养至对数后期，用1mL THY培养基重悬的1×10⁸CFU的菌量腹腔感染脱毛处理后的6周龄BABL/c雌鼠，并使用IVIS Spectrum活体成像仪进行观察。

三、实验结果

1、含不同启动子的lux报告系统敲入片段的搭建

不同组合下的敲入片段全长大小在9300bp左右，最终的扩增结果如图3所示。每种组合在3000bp处有一条杂带，经过几次PCR条件优化均未能消除。但考虑到lux发光系统长达5600bp，如果杂带与基因组发生了重组，也不会发光。之后可以用发光来进一步筛选重组正确的菌株。

2、评价不同启动子下的发光强度

(1)将不同组合下的平板在bio-rad公司ChemiDocXRS+高灵敏度化学发光成像仪下成像，结果如图4所示，可以看到，除组合1之外，其余组合下的菌株均可以发光。

(2)为了更为精准的比较不同组合下的菌株的发光效率，本发明将各菌株培养至对数后期，用PBS调整菌量相同后，使用96 Microplate Luminometer检测其发光强度，结果如图5所示，可以看到，与单一启动子相比，两部分分开转录可以使发光强度明显增强；在luxAB启动子相同的情况下，带CP25G启动子的菌株的发光效率明显高于CP25启动子的菌株；luxAB的不同的启动子对菌株发光效率影响不大，带147AGGAG启动子的菌株发光效率略高。

3、小鼠活体成像

使用按照组合7构建好的发光菌感染小鼠，在感染后对小鼠进行活体成像，结果如图6所示，可以看到可以在小鼠体内检测到发光菌(最左侧作为对照的野生株感染的小鼠无发光信号)，证明该发光菌在猪链球菌的致病机制研究中具有潜在的应用前景。

综合上述结果，可见：本发明建立并优化了一种基于lux报告系统的猪链球菌发光菌的构建方法，可以在小鼠体内实时观察到细菌，在猪链球菌的感染途径及致病机制研究上具有一定的应用前景。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 基于lux报告系统的猪链球菌发光菌及其构建方法

<130> GNCLN211422

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9379

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gatgcggtgg gacttgatgt ttatgggatt ggggagcatc accgagaaga ttttgcggtt 60

tctgcacctg agattgtgct ggcagctggt gccgtcaata ccaagcatat caagctaaca 120

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tcagtcgata ataagccagt ctatccacgt cctgttcagg aagattttcc gatctgggtt 420

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tatcaagttc cataaggtaa aagtaaaccc cgcggcgtat agcagaggtg gcgcaccggt 1860

ttatgtggtg gctgaatcag cttcgacgac tgagtgggct gctcaatttg gcctaccgat 1920

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acggcggatt tctgagata 9379

<210> 2

<211> 9310

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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