具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的内容做进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

供试植株为1年生当归苗，品种为岷归1号，由岷县中药材生产技术指导站提供。试验于2019年4～10月在甘肃天祝中药材生态种植示范基地进行。土壤类型为粟钙土，pH7.85，前茬作物为油菜；4月底整地，施有机肥(有机质≥45％，总养分N+P₂O₅+K₂O≥5％)3000kg·hm^-2。试验中用到的试剂、培养基均为化学纯。激素和品质检测相关试剂为色谱纯。丙二醛、叶绿素、过氧化氢、酶活检测相关试剂盒购自苏州科铭生物科技有限公司。

以下实施例所述的荧光假单胞菌CBS5、产碱假单胞菌CBS7、嗜冷假单胞菌CBSB、枯草芽孢杆菌GSICC 32822、解淀粉芽孢杆菌GSICC 32823、贝莱斯芽孢杆菌30287均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心甘肃分中心(甘肃省科学院生物研究所)。

以下实施例所用培养基成分：PDB培养基：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L，自然pH。

以下实施例中菌剂制备与试验设计：

实验组复合微生物菌剂(T1)：分别用PDB培养基培养的荧光假单胞菌CBS5(NCBI号MW981369.1)、产碱假单胞菌CBS7(NCBI号MW981370.1)、嗜冷假单胞菌CBSB(NCBI号MW981371.1)等比例混合；所述微生物菌种的CFU数为3-4×10⁷/ml；

阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂(T2)：分别用PDB培养基培养的枯草芽孢杆菌GSICC 32822、解淀粉芽孢杆菌GSICC 32823、贝莱斯芽孢杆菌30287等比例混合；所述微生物菌种的CFU数为3-4×10⁷/ml；

阳性对照组荧光假单胞菌菌剂(T3)：用PDB培养基培养的荧光假单胞菌CBS5(NCBI号MW981369.1)；所述微生物菌种的CFU数为3-4×10⁷/ml；

阴性对照组(CK)：PDB培养基不加菌。

试验采用单因素完全随机设计，设T1、T2、T3及CK处理组，每处理3次重复，小区面积30m²(4m×7.5m)。2019年7～8月，当归(不覆膜种植)叶面喷施上述处理，每2周叶面喷施一次，共4次，不同小区喷施量体积相等。田间管理按常规措施进行。第4次处理后7天，每小区随机选取当归30株，剪下第3～5位同样位置功能叶，混样装入样品袋中，液氮速冻，-80℃保存，测定相关指标。当归收获期采挖根部，清洗，阴干保存，待测定相关指标。

实施例1复合微生物菌剂相关酶活检测

分别将上述细菌接种到20mL PDB培养基中，振荡培养(30℃，180r/min)24h；5000r/min离心收集菌体，用灭过菌的蒸馏水重悬菌体至菌液浊度为1左右，在1.5mL离心管内加入试剂盒中1mL相应酶的提取液，并加入100μL待测菌液，冰浴超声波破碎细菌(功率200W)，超声3s，间隔10s，重复30次；将超声过的菌液离心10min(4℃，9000r/min)，吸取上清至新的离心管中，置于冰上待测；按照相应测定试剂盒所述方法分别测定酶活，计算结果除以相应的待测菌液浊度(OD₆₀₀)，标准化为单位浊度的待测菌液的酶活。

实验组复合微生物菌剂T1、阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2及阳性对照组荧光假单胞菌菌剂T3相关酶活见表1，总体而言，实验组复合微生物菌剂T1和阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2两种菌剂POD、漆酶、SOD活性较阳性对照组荧光假单胞菌菌剂T3的酶活性绝对值较大，表明清除活性氧、多酚等抑制生长物质，促进植物生长的作用较强。T1和T2两种菌剂不同酶活性差异均显著，除了ACC脱氨酶外，本发明所述的复合微生物菌剂T1都的SOD、POD、NEX、几丁质酶、漆酶酶活都高于阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2；相较于芽孢杆菌属复合菌剂T2，本发明所述的复合微生物菌剂T1中SOD、POD、NEX、几丁质酶、漆酶活性分别高了21.8％、27.8％、74.8％、56.7％、125.1％。结果表明本发明所述的复合微生物菌剂在促生和病害防御方面的作用都强于芽孢杆菌属复合菌剂，尤其是漆酶活性是芽孢杆菌属复合菌剂的1.25倍。

表1不同复配菌剂相关酶活(n＝3)

实施例2不同菌剂处理对当归叶片生理生化特性的影响

按试剂盒所述方法测定不同处理当归叶片叶绿素、MDA、H₂O₂含量，SOD、POD、CAT、PAO、DAO、PPO活性。每个样品重复3次，计算平均值。

结果如图1所示，本发明所述的复合微生物菌剂T1、阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2较阴性对照组CK都显著提高了当归叶片中CAT、SOD、POD、PAO、DAO、PPO的活性，以及H₂O₂、叶绿素含量，显著降低了叶片中丙二醛含量(P<0.05)，两种处理均起到了较好的胁迫保护作用；相较于阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2，本发明所述的复合微生物菌剂T1处理后，当归叶片中CAT、POD、PAO的活性以及叶绿素含量分别增加了7.7％、17.3％、6.4％、9.1％；SOD、PPO的活性分别减少了7.2％、11.8％。其中，本发明所述的复合微生物菌剂T1的SOD、POD、漆酶酶活大于阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2，分别喷施当归后，本发明所述的复合微生物菌剂T1处理后的当归叶片SOD、PPO活性减小，表明本发明所述的复合微生物菌剂对当归具有更强的胁迫保护作用；本发明所述的复合微生物菌剂T1处理后的当归叶片CAT、POD活性高于阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2处理后的叶片，相较于阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2，本发明所述的复合微生物菌剂T1处理后当归叶片的POD/SOD、CAT/SOD、POD/CAT的比值分别提高了28.6％、15.7％、8.7％，表明本发明所述的复合微生物菌剂T1较阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2显著激活了植物自身POD、CAT活性，并且POD的表达强于CAT。

实施例3不同处理对当归內源激素的影响

按照文献“纳米铁和褪黑素对驯化栽培条件下甘肃贝母产量和品质的影响”(中国实验方剂学杂志，2021年)报道的方法，用UPLC-MS测定当归叶片不同内源激素含量，每个样品重复3次，计算平均值。

结果如表2所示，除水杨酸、生长素、赤霉素外，本发明所述的复合微生物菌剂T1、阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2较阴性对照组CK，其它激素两者均表现出一致的变化趋势，显著的提高了茉莉酸含量，分别增加了257.91％、99.94％；降低了脱落酸含量，分别减少了64.69％、66.91％；提高了细胞分裂素含量，分别增加了37.27％、42.64％；脱落酸含量的降低，茉莉酸、细胞分裂素含量的增加，是本发明所述的复合微生物菌剂T1、阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2促进当归产量和品质提高的共同因素；相较于阴性对照组CK，本发明所述的复合微生物菌剂T1能够显著提高当归中水杨酸含量，提高率为30.59％；降低生长素含量，降低率为42.85％；而赤霉素含量无显著差异；而相较于阴性对照组CK，阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2降低了当归中水杨酸含量，降低率为5.94％；提高了生长素和赤霉素含量，提高率分别为102.61％和15.37％。

上述数据、根和产量相关指标进行相关性分析，结果见表3-4。生长素与水杨酸、CAT/SOD呈负相关，与赤霉素、不定根数呈正相关；赤霉素与不定根数正相关，由此可知，阳性对照组T2较本发明所述的复合微生物菌剂T1，主要通过促进生长素和赤霉素增加了不定根数。水杨酸与茉莉酸、CAT/SOD、POD/SOD、芦头长、单株鲜重呈正相关；茉莉酸与CAT/SOD、POD/SOD、芦头直径、芦头长、主根长、单株鲜重呈正相关，由此可知，本发明所述的复合微生物菌剂T1较阳性对照组T2，主要通过促进水杨酸、茉莉酸、CAT/SOD、POD/SOD，增加了芦头直径、芦头长、主根长，最终单株鲜重高于T2。

一般而言，植物体内水杨酸和茉莉酸含量存在负相关关系(参见“植物防御反应中水杨酸与茉莉酸的对话机制”，细胞生物学杂志，2002年)，而本发明所述的复合微生物菌剂T1处理当归后，水杨酸和茉莉酸含量呈正相关关系，本发明所述的复合微生物菌剂T1较阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2，当归水杨酸含量增加了38.84％，茉莉酸含量增加了79.01％，本发明所述的复合微生物菌剂T1较阴性对照组CK，当归水杨酸含量增加了30.59％，茉莉酸含量增加了257.91％；阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2处理后，较阴性对照组CK，当归水杨酸和茉莉酸表现为负相关关系；而本发明所述的复合微生物菌剂T1处理后，当归水杨酸和茉莉酸表现为正相关关系，具有意想不到的效果。

表2不同处理对当归叶片内源激素的影响(ng·g^-1，n＝3)

表3当归根、产量相关指标皮尔森相关分析1

表4当归根、产量相关指标皮尔森相关分析2

实施例4不同处理对当归植株生长及产量的影响

常规方法生长期测定茎粗、株高、冠幅。采收后测定芦头直径、芦头长、主根长、单株鲜重。每小区选30株，计算平均值。

当归地上部分相关指标统计结果如表5所示，当归根相关指标及产量统计结果如表6所示，相较于阳性对照组荧光假单胞菌菌剂T3、阴性对照组CK，本发明所述的复合微生物菌剂T1和阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2均增加了当归的茎粗、株高和冠幅，降低了根腐病的发生率，且T1、T2间差异不显著；而相较于阴性对照组CK，本发明所述的复合微生物菌剂T1增加了不定根数、芦头直径、芦头长、主根长、单株鲜重，增长率分别为13.40％、18.64％、11.21％、11.43％、41.43％(P＜0.05)；相较于阴性对照组CK，阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2增加了不定根数、芦头直径、单株鲜重，增长率分别为28.35％、12.39％、20.29％(P＜0.05)；相较于阴性对照组CK，阳性对照组荧光假单胞菌菌剂T3对不定根数、芦头直径、芦头长、主根长、单株鲜重等无显著影响；而且相较于阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2，本发明所述的复合微生物菌剂T1显著增加了芦头长、单株鲜重，增长率分别为10.13％，17.58％，降低了不定根数，减少率为11.65％。

上述结果表明，本发明所述的复合微生物菌剂T1处理根表型和产量都优于阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2。

表5当归地上部分相关指标统计(n＝30)

表6当归根相关指标及产量统计(n＝30)

实施例5不同处理对当归品质的影响

当归药效整体质控评价指标为阿魏酸、Z-藁本内酯。按照文献“不同植物激素和微生物对重茬地当归产量和品质的影响”(中药材，2021年)所述方法，测定阿魏酸、洋川芎内酯I、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、Z-藁本内酯含量，重复3次，计算平均值。

结果如表7所示，阿魏酸、阿魏酸松柏酯、Z-藁本内酯绝对值较大，洋川芎内酯A、I绝对值较小。本发明所述的复合微生物菌剂T1较阴性对照组CK，阿魏酸、Z-藁本内酯分别增加了72.82％、10.32％；阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2较CK，阿魏酸、Z-藁本内酯分别增加了38.64％、21.78％；阳性对照组荧光假单胞菌菌剂T3较CK，阿魏酸、Z-藁本内酯无显著差异。本发明所述的复合微生物菌剂T1显著提高了当归整体质控指标。

表7不同处理当归品质指标含量(mg·g^-1，n＝3)

实施例6不同处理数据分析与总结

不同处理叶片激素含量与当归品质指标主成分分析见图2，主成分1的载荷为54.06％，主成分2的载荷为44.25％。洋川芎内酯A、阿魏酸、茉莉酸、细胞分裂素、脱落酸对主成分1的贡献较大；阿魏酸松柏酯、生长素、赤霉素、水杨酸对主成分2的贡献较大；洋川芎内酯I和Z-藁本内酯对主成分1和2的贡献相当。本发明所述的复合微生物菌剂T1、阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2较阴性对照组CK，主要由主成分1相关指标区分，除了洋川芎内酯I外，对其他品质指标都有一定的促进作用。本发明所述的复合微生物菌剂T1、阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2主要由主成分2相关指标区分，本发明所述的复合微生物菌剂T1通过促进叶片中水杨酸、茉莉酸积累，促进阿魏酸含量增加；阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2通过促进叶片中生长素、赤霉素积累，促进阿魏酸松柏酯、Z-藁本内酯含量增加。

当归叶片激素、酶活等生理生化指标主成分分析见图3，主成分1的载荷为74.23％，主成分2的载荷为22.09％。叶绿素、细胞分裂素、脱落酸、MDA、活性氧清除酶系、多胺氧化酶、PPO等对主成分1的贡献较大；生长素、赤霉素、水杨酸、茉莉酸、CAT/SOD、POD/SOD对主成分2的贡献较大。本发明所述的复合微生物菌剂T1、阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2较阴性对照组CK，主要由主成分1相关指标区分，降低脱落酸、丙二醛(MDA)含量，提高叶绿素、细胞分裂素含量，活性氧清除酶系、多酚多胺氧化酶系活性是其共同作用。本发明所述的复合微生物菌剂T1较阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2，主要由主成分2相关指标区分，本发明所述的复合微生物菌剂T1提高了水杨酸、茉莉酸含量，CAT/SOD、POD/SOD的比值；阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2提高了生长素、赤霉素含量。本发明所述的复合微生物菌剂T1、阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2作用机理不同，当归增产幅度、根外观性状不同。本发明所述的复合微生物菌剂T1处理后，当归叶片水杨酸、茉莉酸含量增加，生长素含量降低，赤霉素含量无显著变化，这种特殊的內源激素响应方式，最终通过增加芦头直径、芦头长、主根长达到增加平均单株重的作用。

综合考虑产量、品质、抗病性、根外观性状，本发明所述的复合微生物菌剂T1处理效果优于阳性对照组芽孢杆菌属复合菌剂T2，更优于阳性对照组T3和阴性对照组CK。

序列表

<110> 甘肃省科学院生物研究所

新疆农垦科学院

<120> 一种假单胞菌属复合微生物菌剂及在当归抗病增产提质中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 886

<212> DNA

<213> 假单胞菌(Pseudomonas sp)

<400> 1

cgctaactgc actctagcgg tcagaaactt gcttctcttg aagcggcgga cgggtgaata 60

atgcctacga atctgcctgg tagtggggga taacgttccg aaaccgacgc taataccgca 120

tacgtcctac gggagaaagc aggggacctt cgggccttgc gctatcagat gagcctaggt 180

cggattagct aggtggtgag gtaatggctc accaaggcga cgatccgtaa ctggtctgat 240

aggatgatca gtcacgctgg aactgagaca cggtccagac tcctacagga ggcaccagtg 300

gggaatattg gacgatgggc gaaagcctga tccagccatg ccgcgtgtgt gaagaaggtc 360

ttcggattgt aaagcacttt aagttgggag gaagggcagt tacctaatac gtgattgttt 420

tgacgttacc gacagaataa tcaccggcta actctgtgcc agcaaccgcg gtaatacaga 480

gggtgcgagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgcg cgtaggtggt ttgttaagtt 540

ggatgtgaaa tccccgggct caacctggga actgcattcg aaactgactg actacagtat 600

ggtagagggt ggtggaattt cctgtgtagc ggtgaaatgc ggaaatatat gaaggagcac 660

aagtggcaaa agcgagcacc tggactgata ctgacactga ggtgcgaaag cgtggggagc 720

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gccgtgagct cttagtggcg catctaacgc attgagttga cggcctgcgg agaacgggcc 840

gcaaggctag aaatcgaatg aattgactgg ggccggcaca agcgga 886

<210> 2

<211> 894

<212> DNA

<213> 假单胞菌(Pseudomonas sp)

<400> 2

gggtgtcacg ctacctgcag tcgagcggat gagtggagct tgctccatga ttcagcggcg 60

gacgggtgag taatgcctag gaatctgcct ggtagtgggg gacaacgttt cgaaaggaac 120

gctaataccg catacgtcct acgggagaaa gcaggggacc ttcgggcctt gcgctatcag 180

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gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcg 894

<210> 3

<211> 939

<212> DNA

<213> 假单胞菌(Pseudomonas sp)

<400> 3

ggggttcacg cttcctgcac tcgagcggta gagagaagct tgcttctctt gagagcggcg 60

gacgggtgag taatgcctac gaatctgcct ggtagtgggg gataacgttc ggaaacggac 120

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