多功能凝结芽孢杆菌在益生菌坚果制作中的应用
技术领域
本发明涉及多功能凝结芽孢杆菌在益生菌坚果制作中的应用，属微生物应用
技术领域
和食品加工技术领域
。背景技术
坚果是闭果的一个分类，果皮坚硬，内含1粒或者多粒种子。如核桃，腰果等的果实，是植物的精华部分。坚果中分别含有蛋白质36.0％、脂肪58.8％、碳水化合物72.6％，还含有维生素(维生素B、维生素E等)、微量元素(磷、钙、锌、铁)、膳食纤维等。另外，其中还含有单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸，包括亚麻酸、亚油酸等人体的必需脂肪酸。对人体生长发育、增强体质、预防疾病有极好的功效。根据权威机构研究得出：每周食用两次以上坚果能够降低人们患致命心脏病的风险，这是美国医生健康研究项目调查两万名男性后的准确结果。然而，坚果存在加工后坚果表面容易氧化哈败，产生不愉快的风味，影响产品质量、降低坚果的营养价值的问题，尤其是脱皮核桃仁在保质期内易哈败问题突出。此外，坚果中膳食纤维素不能分解利用也是存在的问题。
益生菌是指一类在摄入适当数量后会对宿主机体产生益处的活体微生物，具有调整肠道菌群，提高免疫力的作用。现有报道将益生菌用于坚果的加工。
例如，CN110521988A公开了一种富含活性微生物的坚果仁粉加工方法，将凝结芽孢杆菌用于坚果仁粉的加工过程，凝结芽孢杆菌是一种兼性厌氧菌，与普通乳酸菌相比，它既能够形成芽孢又能产生乳酸，具有耐酸、耐热、耐盐、容易培养和保存的特点。凝结芽孢杆菌进入人体后，对胃酸和胆汁有较高的耐受性，更能适应低氧的肠道环境，同时发酵产生L-乳酸等抑菌物质，可以有效降低肠道pH值，抑制有害菌，并能促进双歧杆菌等有益菌的生长和繁殖，从而调节肠道内微生物菌群的平衡，提高机体的免疫力，对因菌群失调引起的急慢性腹泻、慢性便秘、腹胀和消化不良有一定的治疗作用。但是CN110521988A并没有公开具体用到的的凝结芽孢杆菌菌株，也没有对具体的应用效果进行验证。事实上，值得关注的是，凝结芽孢杆菌不同于其它的益生菌，由于菌体在肠道上皮细胞的粘附性较弱，所以在自然条件下一般很难在肠道中存在。因此，作为肠道内的“移民”，凝结芽孢杆菌只能在肠道内做短暂的停留，一次性口服凝结芽孢杆菌后，经过大约4～7d时间肠道内的凝结芽孢杆菌便会通过排便而消失殆尽。
又例如，CN112335883A公开了一种多元益生菌制剂、易吸收每日坚果及其制备方法，以特定比例的凝结芽孢杆菌、双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和副干酪乳杆菌等的为主要辅料，特定比例的辅料复配益生元、益生因子、麦芽糊精及发酵酸乳粉等制备多元益生菌制剂，同时将该益生菌制剂以特定的多层包衣工艺加入每日坚果。CN112335883A的制剂中含有抗性糊精和异麦芽酮糖为两种“益生因子”，所选择的益生菌和辅料的选取是经过创造性实验合理搭配出，具有很好效果；同时通过多元益生菌制剂制备的每日坚果具有消化好、易吸收、口感好等特点。CN112335883A需要使用多种益生菌复配，也不确定是否能保持较长的产品货架期内的益生菌活性。
因此，如果能获得高性能、多功能的凝结芽孢杆菌，将有利于改善益生菌坚果产品的性能；同时，开发益生菌配方简单、耐坚果加工工艺、活性保持稳定、能有效分解纤维素的菌株，并将其用于益生菌坚果的加工，以有效解决坚果在保质期内易氧化哈败等问题，是目前坚果加工的热点和难点。
发明内容
【要解决的问题】
针对以下至少一个问题，本发明提供一种了一株多功能凝结芽孢杆菌BC2000，并将其用于坚果加工，开发了抗氧化益生菌坚果的制作加工方法：(1)凝结芽孢杆菌性能有待提高；比如，大多数益生菌不耐高温且易失活，不能承受坚果加工工艺、不能在产品货架期内保持益生菌活性以及不能活着到达消费者肠道等问题；(2)现有坚果加工后坚果表面容易氧化哈败，产生不愉快的风味，影响产品质量、降低坚果的营养价值，尤其是脱皮核桃仁在保质期内易哈败问题突出。
本发明的凝结芽孢杆菌BC2000，该菌株兼具耐酸、耐胆盐、产乳酸、抑制病原菌生长、耐高温高压的性能，分泌蛋白酶、淀粉酶和乳酸酶等的能力，降解亚硝酸盐的能力，以及降解多种真菌毒素、高产纤溶酶等性能，适用范围广、使用效果好。
本发明的加工方法，通过有效地成份及配比，与工艺相结合，可以有效解决坚果在保质期内易氧化哈败、益生菌活性保持稳定，同时能解决益生菌不耐坚果加工工艺及不能活着到达消费者肠道以及坚果中膳食纤维素不能分解利用等问题。
【技术方案】
本发明的第一个目的是提供一株凝结芽孢杆菌BC2000，已于2021年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21621，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
该凝结芽孢杆菌BC2000的性能具体如下：
(1)耐高温：在湿热条件和干热条件下的耐高温性能均优良；其中，在160℃干热条件下还能保持一定存活，在100℃湿热条件下处理60min的存活率可以达到70％以上；
(2)耐胆盐：经0.3％的胆汁盐下处理24h后能保持95％以上的存活率；
(3)耐酸性：在pH 1.5下处理6h后能保持50％以上的存活率；
(4)储存稳定性：于干燥、避光处保存36个月后能保持96.92％的存活率；
(5)产乳酸：发酵36h的发酵上清液中浓度达8.72g/L；
(6)产酶丰富：可产蛋白酶、乳酸酶，高产淀粉酶和纤溶酶；淀粉酶活力可达302.43U/mgprot，发酵液中纤溶酶活性高达467.9U/mL；
(7)可降解亚硝酸盐：对2.0mg/L的亚硝酸盐进行降解，36h后降解率高达98％；
(8)抑制病原菌生长：可以抑制大肠杆菌、粪肠球菌、变异链球菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌的生长；
(9)能降解多种真菌毒素：可以高效降解玉米赤霉烯酮，能降解4种黄曲霉毒素。
本发明的第二个目的是提供多功能凝结芽孢杆菌在益生菌坚果制作中的应用。
所述应用是先制备含有凝结芽孢杆菌BC2000的益生菌裹衣粉，然后将其用于益生菌坚果裹衣。
根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用具体包括：
益生菌裹衣粉制备：将凝结芽孢杆菌BC2000、葡萄糖、发酵酸奶粉、乳矿物盐、苹果酸、低聚果糖、雨生红球藻混合均匀；
粘液制备：将异麦芽酮糖醇、麦芽糊精，与水充分溶解，制成裹衣粘液；
益生菌坚果裹衣：将坚果放入裹衣设备中，启动设备，进行裹衣；
益生菌坚果烘干：将裹衣好的益生菌坚果放入烘箱中进行烘烤。
在本发明的一种实施方式中，所述应用还包括益生菌坚果包装步骤；具体是，将烘烤后得到的益生菌坚果半成品与果干或其他食品进行混合包装。
在本发明的实施方式中，所述应用，具体是：
步骤一：益生菌裹衣粉制备：将凝结芽孢杆菌BC2000、葡萄糖、发酵酸奶粉、乳矿物盐、苹果酸、低聚果糖、雨生红球藻混合均匀。
其中裹衣粉各物料之间的添加配比为2-20份(按质量份数计，下同)凝结芽孢杆菌(芽孢含量达1×109-5×109cfu/g)与200-500份葡萄糖进行预混合，确保两者混合均匀，再与200-500份发酵酸奶粉、3-30份乳矿物盐、2-20份苹果酸、10-100份低聚果糖、1-5份雨生红球藻一同放入三维混合机中进行充分混合；其中苹果酸使得凝结芽孢杆菌所处环境偏酸，即可抑制其它微生物生长可保护凝结芽孢杆菌不被其他菌落所抑制，其中低聚果糖为益生元，能使凝结芽孢杆菌在萌发时更好的生长，从而调节人体肠道菌群平衡，其中雨生红球藻富含虾青素具有极强的抗氧化性，可附着在坚果表面，延缓坚果氧化哈败；凝结芽孢杆菌BC2000在人体萌发后能可产生纤维素酶，分解坚果中的膳食纤维素，其产酶过程离不开钙、镁、铁、锌等矿物元素。乳矿物盐含有丰富的钙、锌等矿物元素，此外坚果中也含有富含铁、锌、镁等矿物元素。凝结芽孢杆菌萌发后，可吸收多种矿物元素促进其产纤维素酶，同时各种矿物元素亦可激活纤维素酶、提高纤维素酶活力，能促进分解坚果中膳食纤维素为各种糖类，为肠道中的其他益生菌提供更多的养分。多种矿物元素可促进凝结芽孢杆菌在肠道繁殖，从而消耗肠道中的游离氧，有利于肠道内厌氧微生物和双歧杆菌的生长，从而调节肠道内微生物菌群的平衡；
步骤二：粘液制备：将异麦芽酮糖醇、麦芽糊精，与水充分溶解，制成裹衣粘液。
其中裹衣粘液各物料之间的添加配比为1-10份异麦芽酮糖醇、麦芽糊精20-40份，与水60-130份充分溶解，配制成裹衣粘液。其中麦芽糊精为主要粘合剂，具有溶解性好，无味、粘度高；其中异麦芽酮糖醇为新资源，具有促进人体肠胃蠕动和软化粪便的功能，且为益生元，可与凝结芽孢杆菌相互搭配可提高其在人体中的存活率；其中异麦芽酮糖醇和麦芽糊精按比例配置后粘液的粘性有所提高，保证裹衣粉能均匀附着在坚果表面，同时产品中不宜掉粉，保持凝结芽孢杆菌在产品中的数量稳定。
步骤三：益生菌坚果裹衣：将坚果放入裹衣设备中，启动设备，进行裹衣。
其中该裹衣设备分为两段，前端为粘液添加端，后端为裹粉端。其中裹衣粘液添放入裹衣设备前端储液罐中，粘液添加参数0.3-0.6份粘液，时间0.5-2min，裹衣粉放入后端储粉罐中，裹衣粉添加参数0.7-1.5份裹衣粉，时间0.5-2min，取10份坚果于设备中。启动设备，转速设置为30-50Hz。其中坚果先在粘液添加端设备中并开始自动添加粘液。当运行到达设定时间后，自动将有裹衣粘液的坚果转移至裹粉端，同时裹粉端自动启动，开始喷粉裹衣，到达设定时间后。自动将裹衣好的半成品转移至烤盘中。通过该设备进行裹衣可使得凝结芽孢杆菌和雨生红球藻均匀分布在坚果表面，保证产品中的凝结芽孢杆菌数量的稳定，同时可实现益生菌坚果自动化，生产效率高，节约劳动力，降低生产成本。
步骤四：益生菌坚果烘干：将裹衣好的益生菌坚果放入烘箱中进行烘烤。
其中，烘烤为阶段式烘烤。烘烤参数为：第一段烘烤温度为60℃，烘烤时间为1h；第二段烘烤温度为80℃，烘烤时间为1h；第三阶段烘烤温度为85℃，烘烤时间为1h。分段烘烤能有效保证产品水分缓慢释放，防止益生菌坚果口感僵硬，保持酥脆口感，同时降低益生菌坚果中的水分活度，保证凝结芽孢杆菌活着到达肠道。
步骤五：益生菌坚果包装：将益生菌坚果半成品与果干或其他食品进行混合包装。
其中，包装为充氮包装，可降低包装袋中的氧含量；同时在包装袋中添加吸氧剂，进一步降低袋中的氧含量，两者与雨生红球藻协同作用防止益生菌坚果在保质期内氧化哈败，产生不愉快风味。其中包装袋中还同时添加干燥剂，减缓产品中的物料间的水分迁移，以及阻止吸氧剂中的水分迁移至益生菌坚果中，保证益生菌坚果的口感酥脆以及降低益生菌坚果的水分活度，防止凝结芽孢杆菌的萌发，保证凝结芽孢杆菌可活着到达肠道。
【本发明的有益效果】：
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明从泡菜中筛选到的一株凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans CGMCCNo.21621，具有出众的耐高温，耐高压，耐酸，耐胆盐的特性，同时其产乳酸的能力也非常突出，并且可以实现1000亿以上孢子数稳定的大批量的工业化生产。该菌株出众耐高温能力，能够确保在经历复杂的食品加工环境，依然有稳定的活菌数，独特的耐酸能力，需要在5.2左右的酸性环境才会萌发，比市场上其他菌株更耐酸，经过人体胃酸环境(2.0左右)可以有更高的存活率。此外，该菌株能抑制病原菌生长，能产蛋白酶、淀粉酶和乳酸酶，高产纤溶酶，可降解亚硝酸盐、多种真菌毒素。本发明的Bacillus coagulans CGMCC No.21621用于益生菌坚果的制作，不仅赋予益生菌坚果更好的品质，还赋予其更高的安全性。
(2)本发明的Bacillus coagulans CGMCC No.21621在益生菌坚果保质期内可保持凝结芽孢杆菌的活性；能通过胃酸及胆碱、到达消费者肠道后萌发；萌发成为营养体，可分泌蛋白酶促进蛋白质消化为小分子，更有利于人体吸收；可分泌纤维素酶，促进消化分解坚果中的膳食纤维素为多糖，能给肠道中的其他益生菌及人体提供营养；可在肠道中萌发，分泌酸性物质降低肠道中的Ph，抑制腐败细菌的繁殖；低聚果糖、异麦芽酮糖醇不能被人体消化吸收，可增加肠道蠕动，两者之间可协同作用能有效缓解腹泻和便秘；在肠道中萌发增值，消耗肠道中的游离氧，改善厌氧益生菌的生长环境，从而能调节肠道菌群；此外萌发后可降低肠道中的pH，从而使肠道中的环境更有利于有益菌；同时可分泌多种酶能分解蛋白质和膳食纤维素可提供小分子蛋白质及多糖，从而提高人体免疫力。
(3)本发明的Bacillus coagulans CGMCC No.21621在益生菌坚果制作中的应用时，与雨生红球藻搭配使用。雨生红球藻是一种淡水单胞绿藻，隶属绿藻门、团藻目、红球藻科、红球藻属。该藻能大量累积虾青素而呈现红色，故名红球藻，又称雨生红球藻。红球藻是目前科学界发现的继螺旋藻、小球藻之后，富含营养价值和药用价值的藻类食品。雨生红球藻是一种主要生长在淡水中的单细胞绿藻，在海洋中分布很少，但海水中的盐度有利于藻体中虾青素的累积。雨生红球藻是公认的在自然界中生产天然虾青素的最理想来源，虾青素作为目前发现的一种最高效的纯天然抗氧化剂，在清除自由基、抗衰老、抗肿瘤和免疫调节等方面显示出良好的生物活性，被广泛应用于功能性食品、医药以及化妆品领域。
(4)本发明的Bacillus coagulans CGMCC No.21621在益生菌坚果制作中的应用时，与异麦芽酮糖醇搭配使用。异麦芽酮糖醇是近年来国际上新兴的一种功能性糖醇，是蔗糖、淀粉糖及其它糖醇的优良替代品。甜度是蔗糖的50～60％，具有低吸湿性、高稳定性、高耐受性、低热量、甜味纯正等特点。产品安全性极高，美国FDA给予其GRAS(公认安全)地位，对其每日摄入量不作限制。从营养学的角度来讲异麦芽酮糖醇是一种碳水化合物，而从生理上的角度来讲，它在人体内不易被分解吸收，也不为绝大多数微生物分解利用。根据《卫生部关于批准低聚半乳糖等新资源食品的公告(卫生部公告2008年第20号)》，异麦芽酮糖醇属于新食品原料。其使用范围适用各类食品，但不包括婴幼儿食品。且食用量≤100克/天。且异麦芽酮糖醇是一种优良的双歧杆菌增殖因子，虽然异麦芽酮糖醇不能被人体和绝大多数微生物的酶系所利用，但却可以被人体肠道中的双歧杆菌所分解利用，促进双歧杆菌的生长繁殖，维持肠道的微生态平衡，有利于人体的健康。
(5)本发明的益生菌坚果制作工艺，通过该工艺加工生产的益生菌表面裹粉均匀美观且不宜掉粉、食用时不脏手。益生菌坚果表面的裹衣粉形成一层保护层，可阻止氧气与坚果表面接触，同时与益生菌坚果中的雨生红球藻以及充氮包装、吸氧剂协同作用可延缓坚果氧化哈败，降低坚果表面氧化哈败，保证益生菌坚果质量。
【生物材料保藏】
凝结芽孢杆菌BC2000，分类命名为凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，已于2021年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21621，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实验材料和设备：本发明用到的培养基组分(比如酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、硫酸锰、氯化钙等)、益生菌坚果组分(比如葡萄糖、发酵酸奶粉、乳矿物盐、苹果酸、低聚果糖、雨生红球藻、异麦芽酮糖醇、麦芽糊精等)都是常见的都是商业化产品，可以通过常规的商业化渠道购买获得，比如阿里巴巴1688等平台或者其他常见的生化试剂采购平台等购买得到。
实施例1凝结芽孢杆菌的筛选及性能测定
1菌株的筛选、鉴定、保藏
(1)首先将腌制泡菜碾碎，加入15mL无菌水，剧烈震荡20min，然后80℃水浴作用20min；然后采用浓度梯度稀释法，取稀释液100uL涂布于琼脂培养基平板上(培养基配方为：酵母膏10.0g/L；牛肉膏10.0g/L；蛋白胨10.0g/L；碳酸氢钠1.5g/L；磷酸二氢钾1.5g/L；七水硫酸镁1.0g/L；硫酸锰0.1g/L；氯化钙1.0g/L；去离子水1L)，45℃培养48h，挑选菌落大、生长快的菌株，进一步划线分离纯化。
(2)将上一步获得的分离纯化的菌株进行先甘油管保藏；然后取菌液接种于MRS培养基中，培养至菌体浓度为108cfu/mL，然后按照终浓度为107cfu/mL的添加量添加到胆汁盐含量0.5％的溶液中，37℃孵育24h后，涂布于琼脂培养基平板上测定存活率。选取存活率在95％以上的菌株进行下一步筛选。
(3)将菌株在人工模拟胃液(pH 3.0)37℃处理2小时，涂布于琼脂培养基平板上测定存活率。获得存活率在70％以上的菌株29株。
(4)酶活测定：将上一步获得的凝结芽孢杆菌单菌落分别接种于MRS种子培养基中，37℃下培养36h后转接至发酵培养基，37℃下200r/min培养48h，制得发酵液；取发酵上清液，冰浴条件下向粗酶液中加入60％的硫酸铵粉末，4℃条件下沉淀得粗酶液中的蛋白，得到沉淀物；所得沉淀物用Tris-HCl缓冲液复溶，4℃条件下透析得到浓缩酶液；用淀粉酶试剂盒(购自南京建成生物工程研究所，货号C016-1-1,碘-淀粉比色法)、乳糖酶试剂盒(购自南京建成生物工程研究所，货号A082-1,测乳糖酶)、蛋白酶试剂盒(购自购自上海哈灵生物科技有限公司，货号HL15021.2)分别测定29株菌的淀粉酶活力、乳糖酶活力、蛋白酶活力。获得综合性能较好的菌株15株。
(5)将上一步获得的凝结芽孢杆菌单菌落活化后制备种子培养液，然后发酵培养28h获得发酵培养液，于10000rpm离心5min得到发酵上清液。将发酵上清液与玉米赤霉烯酮(或黄曲霉毒素)的标准品混合，测定玉米赤霉烯酮(或黄曲霉毒素)的降解效果。获得性能最好的菌株，命名为Bacillus coagulans BC2000。
(6)将Bacillus coagulans BC2000采用16SrDNA测序进行分类学分子鉴定，将测序结果在NCBI中进行Blast比对，发现其16SrDNA碱基序列与芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)的相似性最高，确定鉴定为凝芽孢杆菌。将Bacillus coagulans BC2000于2021年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21621，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2、菌株的培养和菌剂的制备
A液体菌剂的制备
方法一：将凝结芽孢杆菌CGMCC No.21621单菌落分别接种于MRS种子培养基中，37℃下培养36h后转接至发酵培养基，37℃下200r/min培养40～56h，制得菌数为1.0×108-5.0×109CFU/mL发酵液。
方法二：
(1)斜面菌体活化
划线接种于斜面培养基(组成以g/L计为：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，麸皮10，琼脂15-20，pH 7.0-7.2)，30℃培养24-48h；
(2)摇瓶及种子罐培养
用无菌水将斜面上的成熟菌泥刮洗下来，装入内装玻璃珠的无菌三角瓶中振荡分散菌泥，获得均匀的菌悬液，将菌悬液在80℃水浴中加热10分钟，以体积比1％-10％的接种量接入三角瓶摇瓶培养；培养条件为：摇瓶转速200r/min；种子罐搅拌转速180r/min，通气量1m3/h，培养温度为40℃，培养时间为24h；培养基组成为以g/L计：麸皮10，酵母膏8，豆粕粉8，K2HPO4 3，NaCl 5，MnSO4·H2O 0.3，pH 7.0；
(3)发酵罐培养
种子培养液以体积比2％的接种量接入发酵罐；发酵培养基由碳源、氮源和无机盐组成，以g/L计：葡萄糖10，蛋白胨5-20，K2HPO4 3，NaCl 5，MnSO4·H2O 0.3，碳酸钙2-10，pH7.0；发酵罐培养条件为：搅拌转速200r/min，通气量1m3/h，培养温度为40℃，培养时间为18-48h；在培养过程中根据泡沫的高涨情况进行消泡；取发酵液进行镜检，当90％以上的菌体已形成芽孢时，即可放罐结束培养。
B固体菌剂的制备
发酵罐培养的凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans CGMCC No.21621的菌液进行离心，将芽孢与干淀粉以重量比1:2混合，在40-50℃干燥20-24h，粉碎机粉碎，过筛，加入配料麦芽糊精，混合后制成微生态制剂，芽孢含量达1×109cfu/g以上。
3、Bacillus coagulans BC2000性能测定
(1)耐高温性能
干热条件下的耐高温性能：将上述制备的100g固体菌剂菌粉均匀平铺于托盘中，置于不同温度高温干燥箱中烘烤一定时间后，取出置于干燥器中自然冷却至室温，采用平板涂布法梯度稀释测定芽孢数，并计算存活率(存活率＝处理后的芽孢数/初始芽孢数)。结果如表1。
湿热条件下的耐高温性能：将上述方法二制备的液体菌剂在不同水浴温度下处理一段时间，进行芽孢计数，计算存活率。结果如表2。
结果显示，Bacillus coagulans CGMCC No.21621在160℃干热条件下处理60min还能保持一定得存活，在100℃湿热条件下处理60min的存活率可以达到70％以上，在说明CGMCC No.21621的耐热性非常好。
表1
表2
(2)耐胆盐性能
为了测定凝结芽孢杆菌CGMCC No.21621孢子在不同胆汁盐浓度下芽孢存活率，分别添加0.03％、0.1％、0.2％和0.3％的牛胆酸钠得MRS培养基，37℃放置24h后，进行芽孢计数。结果如表3所示。
表3
胆汁盐浓度
0.03％
0.10％
0.20％
0.30％
芽孢存活率
100％
100％
98.24％
94.94％
(3)耐酸性能
将上述方法二制备的凝结芽孢杆菌CGMCC No.21621的液体菌剂的菌体，适量加入到用0.1mol/l的盐酸调至pH分别为1.5、2.5、3.5、4.5的MRS培养基中，于37℃处理一段时间，测定存活率。结果显示，37℃处理2h或6h后，存活率如表4所示。说明凝结芽孢杆菌CGMCCNo.21621的耐酸性能优良。
表4
不同条件
pH 4.5
pH 3.5
pH 2.5
pH 1.5
2h后存活率
100.00％
99.88％
96.29％
84.93％
6h后存活率
95.28％
86.24％
77.36％
54.39％
(4)储存稳定性能
取上述方法制备的固体菌剂，置于干燥、避光处，室温保存。分别于1、2、3、4、5、6、8、12、16、20，24以及36个月进行检测，计算芽孢存活率。结果如表5所示。
表5
检测时间
1个月
2个月
3个月
4个月
6个月
8个月
12个月
16个月
24个月
36个月
存活率
100.00％
100.00％
100.00％
99.99％
99.89％
99.59％
98.78％
98.42％
98.02％
96.92％
(5)产乳酸、产酶和降解亚硝酸盐性能
将Bacillus coagulans CGMCC No.21621活化后制备种子培养液，然后以体积比2％的接种量接入发酵罐；发酵培养基，以g/L计：葡萄糖10，蛋白胨5-20，K2HPO4 3，NaCl 5，MnSO4·H2O 0.3，碳酸钙2-10，pH 7.0；发酵罐培养条件为：搅拌转速200r/min，通气量1m3/h，培养温度为40℃，培养时间为36h。
发酵培养结束后，10000rpm离心5min，取发酵上清液，测得发酵上清液中乳酸浓度达8.72g/L。
将发酵上清液冷却，在冰浴条件下向其中加入60％的硫酸铵粉末，4℃条件下沉淀得粗酶液中的蛋白，得到沉淀物；所得沉淀物用Tris-HCl缓冲液复溶，4℃条件下透析得到浓缩酶液。测定浓缩酶液得淀粉酶、乳糖酶、蛋白酶活力(采用购自南京建成生物工程研究所的试剂盒，货号分别为C016-1-1、A082-1、HL15021.2)，结果显示，淀粉酶活力可达302.43U/mgprot，乳糖活力28.56U/mgprot，蛋白酶活力为1.28U/mg/min。其中，U/mgprot代表每毫克组织蛋白每分钟水解10mg淀粉或1nmol乳糖定义为1个酶活单位；U/mg/min代表每单位酶每分钟产生0.01吸光值的升高变化。
参照Astrup等的方法测定发酵上清液中的纤溶酶活性，结果显示纤溶酶活性高达467.9U/mL。
测定降解亚硝酸盐能力测定：发酵培养结束的菌液按1％接种量转接到添加了初始浓度为2.0mg/L的亚硝酸盐的MRS培养基中，在0、24、36、48h分别取发酵液1mL，离心。吸取0.4mL上清液至比色管中，加蒸馏水至5mL，加入格里斯试剂A、B等体积混合的显色剂0.2mL，混匀，沸水浴加热1min。于524nm波长处测吸光值，空白管调零。根据标准曲线计算发酵液中亚硝酸钠的浓度，24h、36h后分别测定亚硝酸钠的残留浓度以计算降解率，结果显示24h、36h的降解率达到88.5％、98.2％。
(6)抑制病原菌性能
取Bacillus coagulans CGMCC No.21621菌液100μL接种于10mL MRS液体培养基中，于40℃恒温摇床培养24h，转数100rpm，得到指示菌液，备用。取致病菌株(大肠杆菌、粪肠球菌、变异链球菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌)菌液100μL分别接种于10mL液体LB培养基中，于37℃恒温摇床培养24h，转数100rpm，得到致病菌菌液，备用。将培养至对数生长期的致病菌菌液稀释至浓度为105CFU/mL的菌悬液，取菌悬液100μL均匀涂布于MRS固体培养基上，用镊子将无菌牛津杯竖于涂布有致病菌液的MRS固体培养基上，每个牛津杯中加入200μL指示菌液，以200μL无菌水作为空白对照，每个平皿上放置4个牛津杯，3个平行，一个对照，将平皿轻盖后正置于37℃恒温培养箱，培养48h后观察。结果显示，Bacilluscoagulans CGMCC No.21621对上述致病菌均具有抑制作用，平皿上均出现了明显的抑菌圈。
(7)降解真菌毒素性能
将Bacillus coagulans CGMCC No.21621活化后制备种子培养液，然后以体积比2％的接种量接入发酵罐；发酵培养基，以g/L计：葡萄糖10，蛋白胨5-20，K2HPO4 3，NaCl 5，MnSO4·H2O 0.3，碳酸钙2-10，pH 7.0；发酵罐培养条件为：搅拌转速200r/min，通气量1m3/h，培养温度为40℃，培养时间为36h。发酵培养结束后，得到发酵培养液；发酵培养液于10000rpm离心5min得到发酵上清液。
降解玉米赤霉烯酮的应用：将900μL发酵上清液与100μL玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)标准品混合，使ZEA标准品终浓度为50μg/mL；同时，以含相同终浓度ZEA的培养基作为对照，分别在反应0h、1h、2h、4h、6h、8h取样，测定ZEA浓度，计算ZEA的降解率(ZEA降解率(％)＝(初始ZEA浓度-取样后测得的ZEA浓度)/初始ZEA浓度×100％)。结果显示，1h、2h、4h后ZEA的降解率分别为95.2％、98.6％、100％。
降解黄曲霉毒素的应用：将含有黄曲霉毒素的花生粕样品粉碎后过40目筛混合均匀，采用GB/T 14699.1-2005方法采样并称取5.00g置于玻璃容器中，四层纱布报纸封口经高温高压灭菌锅121℃、20min灭菌处理。将灭菌处理过的花生粕转移至发酵皿中，向上述处理后的样品加入1mL的Bacillus coagulans CGMCC No.21621的发酵培养液，再加入适量的无菌蒸馏水，搅拌混合均匀后于38℃下进行恒温固态发酵，在发酵48h后即得固态发酵后脱除四种黄曲霉毒素后样品。收集发酵完成的样品，干燥后分别将每份花生粕导入离心管内，加入乙腈-水溶液(70+30)进行提取并冲洗发酵皿一并导入离心管内，避免因粕中毒素分布不均对实验结果的影响；混匀后超声处理10min，振荡30min，8000r/min下离心10min，取过滤后上清液过固相净化柱，收集液体后进行冷冻浓缩，用甲醇-水溶液(50+50)复溶过滤膜后，上LC-MS/MS检测。色谱条件：色谱柱：BEH C18柱(2.1mm×100mm，1.7μm)流动相A为乙腈，B为甲酸铵溶液，柱温：45℃，流速：0.3mL/min，进样量：5μL；采用上述方法检测脱除黄曲霉毒素后的样品中四种毒素的残留量，并计算出相应的四种黄曲霉毒素脱除率。结果显示，黄曲霉毒素AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2的脱除率分别为：72.4％、39.3％、52.82％、56.76％。
实施例2多功能Bacillus coagulans BC2000应用于益生菌坚果制作
多功能Bacillus coagulans BC2000应用于益生菌坚果制作的方法如下：
(1)益生菌裹衣粉制备：
称取5份凝结芽孢杆菌(芽孢含量达1×109cfu/g以上，按照质量份数计，下同)与350份葡萄糖粉进行预混合，确保两者混合均匀，再与350份发酵酸奶粉、11份苹果酸、16份乳矿物盐、55份低聚果糖、3份雨生红球藻一同放入三维混合机中进行充分混合；
(2)粘液制备：
用5份异麦芽酮糖醇、麦芽糊精30份，与水90份，配成裹衣液；
(3)益生菌坚果裹衣
将10份脱皮核桃仁放入裹衣设备中，将粘液放入裹衣设备粘液添加端的储液罐中，粘液的添加参数为：0.4份粘液，时间1min，将裹衣粉放入裹粉端的储粉罐中，裹衣粉添加参数为：1份裹衣粉，时间1min，转速设置为40Hz，启动设备。1min后将粘液添加端端中的有粘液的坚果转移至裹粉端，同时裹衣粉开始自动添加，1min后将裹衣好的半成品移至烤盘中。
(4)益生菌坚果烘干
将烤盘中的半成品放入烘箱中，进行阶段式烘烤。烘烤参数为：第一段烘烤温度为60℃，烘烤时间为1h；第二段烘烤温度为80℃，烘烤时间为1h；第三阶段烘烤温度为85℃，烘烤时间为1h。
(5)益生菌坚果包装
将益生菌坚果半成品(益生菌核桃仁、益生菌巴旦木仁、益生菌腰果仁、益生菌榛子仁)与果干(蔓越莓干、黑加仑葡萄干、蓝莓干)进行混合后充氮包装，同时再袋中添加吸氧剂和干燥剂。
实施例3
(1)益生菌裹衣粉制备：
称取2份凝结芽孢杆菌与350份葡萄糖粉进行预混合，确保两者混合均匀，再与350份发酵酸奶粉、11份苹果酸、16份乳矿物盐、55份低聚果糖、3份雨生红球藻一同放入三维混合机中进行充分混合；
(2)粘液制备：
用5份异麦芽酮糖醇、麦芽糊精30份，与水90份，配成裹衣液；
(3)益生菌坚果裹衣
将10份脱皮核桃仁放入裹衣设备中，将粘液放入裹衣设备粘液添加端的储液罐中，粘液的添加参数为：0.4份粘液，时间1min，将裹衣粉放入裹粉端的储粉罐中，裹衣粉添加参数为：1份裹衣粉，时间1min，转速设置为40Hz，启动设备。1min后将粘液添加端端中的有粘液的坚果转移至裹粉端，同时裹衣粉开始自动添加，1min后将裹衣好的半成品移至烤盘中。
(4)益生菌坚果烘干
将烤盘中的半成品放入烘箱中，进行阶段式烘烤。烘烤参数为：第一段烘烤温度为60℃，烘烤时间为1h；第二段烘烤温度为80℃，烘烤时间为1h；第三阶段烘烤温度为85℃，烘烤时间为1h。
(5)益生菌坚果包装
将益生菌坚果半成品(益生菌核桃仁、益生菌巴旦木仁、益生菌腰果仁、益生菌榛子仁)与果干(蔓越莓干、黑加仑葡萄干、蓝莓干)进行混合后充氮包装，同时再袋中添加吸氧剂和干燥剂。
实施例4
(1)益生菌裹衣粉制备：
称取20份凝结芽孢杆菌与350份葡萄糖粉进行预混合，确保两者混合均匀，再与350份发酵酸奶粉、11份苹果酸、16份乳矿物盐、55份低聚果糖、3份雨生红球藻一同放入三维混合机中进行充分混合；
(2)粘液制备：
用5份异麦芽酮糖醇、麦芽糊精30份，与水90份，配成裹衣液；
(3)益生菌坚果裹衣
将10份脱皮核桃仁放入裹衣设备中，将粘液放入裹衣设备粘液添加端的储液罐中，粘液的添加参数为：0.4份粘液，时间1min，将裹衣粉放入裹粉端的储粉罐中，裹衣粉添加参数为：1份裹衣粉，时间1min，转速设置为40Hz，启动设备。1min后将粘液添加端端中的有粘液的坚果转移至裹粉端，同时裹衣粉开始自动添加，1min后将裹衣好的半成品移至烤盘中。
(4)益生菌坚果烘干
将烤盘中的半成品放入烘箱中，进行阶段式烘烤。烘烤参数为：第一段烘烤温度为60℃，烘烤时间为1h；第二段烘烤温度为80℃，烘烤时间为1h；第三阶段烘烤温度为85℃，烘烤时间为1h。
(5)益生菌坚果包装
将益生菌坚果半成品(益生菌核桃仁、益生菌巴旦木仁、益生菌腰果仁、益生菌榛子仁)与果干(蔓越莓干、黑加仑葡萄干、蓝莓干)进行混合后充氮包装，同时再袋中添加吸氧剂和干燥剂。
对比例1
(1)益生菌裹衣粉制备：
称取5份麦芽糊精与350份葡萄糖粉进行预混合，确保两者混合均匀，再与350份发酵酸奶粉、11份苹果酸、16份乳矿物盐、55份低聚果糖、3份雨生红球藻一同放入三维混合机中进行充分混合；
(2)粘液制备：
用5份异麦芽酮糖醇、麦芽糊精30份，与水90份，配成裹衣液；
(3)益生菌坚果裹衣
将10份脱皮核桃仁放入裹衣设备中，将粘液放入裹衣设备粘液添加端的储液罐中，粘液的添加参数为：0.4份粘液，时间1min，将裹衣粉放入裹粉端的储粉罐中，裹衣粉添加参数为：1份裹衣粉，时间1min，转速设置为40Hz，启动设备。1min后将粘液添加端端中的有粘液的坚果转移至裹粉端，同时裹衣粉开始自动添加，1min后将裹衣好的半成品移至烤盘中。
(4)益生菌坚果烘干
将烤盘中的半成品放入烘箱中，进行阶段式烘烤。烘烤参数为：第一段烘烤温度为60℃，烘烤时间为1h；第二段烘烤温度为80℃，烘烤时间为1h；第三阶段烘烤温度为85℃，烘烤时间为1h。
(5)益生菌坚果包装
将益生菌坚果半成品(益生菌核桃仁、益生菌巴旦木仁、益生菌腰果仁、益生菌榛子仁)与果干(蔓越莓干、黑加仑葡萄干、蓝莓干)进行混合后充氮包装，同时再袋中添加吸氧剂和干燥剂。
对比例2
(1)益生菌裹衣粉制备：
称取5份凝结芽孢杆菌与350份葡萄糖粉进行预混合，确保两者混合均匀，再与350份发酵酸奶粉、11份苹果酸、16份麦芽糊精、55份低聚果糖、3份雨生红球藻一同放入三维混合机中进行充分混合；
(2)粘液制备：
用5份异麦芽酮糖醇、麦芽糊精30份，与水90份，配成裹衣液；
(3)益生菌坚果裹衣
将10份脱皮核桃仁放入裹衣设备中，将粘液放入裹衣设备粘液添加端的储液罐中，粘液的添加参数为：0.4份粘液，时间1min，将裹衣粉放入裹粉端的储粉罐中，裹衣粉添加参数为：1份裹衣粉，时间1min，转速设置为40Hz，启动设备。1min后将粘液添加端端中的有粘液的坚果转移至裹粉端，同时裹衣粉开始自动添加，1min后将裹衣好的半成品移至烤盘中。
(4)益生菌坚果烘干
将烤盘中的半成品放入烘箱中，进行阶段式烘烤。烘烤参数为：第一段烘烤温度为60℃，烘烤时间为1h；第二段烘烤温度为80℃，烘烤时间为1h；第三阶段烘烤温度为85℃，烘烤时间为1h。
(5)益生菌坚果包装
将益生菌坚果半成品(益生菌核桃仁、益生菌巴旦木仁、益生菌腰果仁、益生菌榛子仁)与果干(蔓越莓干、黑加仑葡萄干、蓝莓干)进行混合后充氮包装，同时再袋中添加吸氧剂和干燥剂。
对比例3
(1)益生菌裹衣粉制备：
称取5份凝结芽孢杆菌与350份葡萄糖粉进行预混合，确保两者混合均匀，再与350份发酵酸奶粉、11份苹果酸、16份乳矿物盐、55份低聚果糖、3份雨生红球藻一同放入三维混合机中进行充分混合；
(2)粘液制备：
用麦芽糊精30份，与水90份，配成裹衣液；
(3)益生菌坚果裹衣
将10份脱皮核桃仁放入裹衣设备中，将粘液放入裹衣设备粘液添加端的储液罐中，粘液的添加参数为：0.4份粘液，时间1min，将裹衣粉放入裹粉端的储粉罐中，裹衣粉添加参数为：1份裹衣粉，时间1min，转速设置为40Hz，启动设备。1min后将粘液添加端端中的有粘液的坚果转移至裹粉端，同时裹衣粉开始自动添加，1min后将裹衣好的半成品移至烤盘中。
(4)益生菌坚果烘干
将烤盘中的半成品放入烘箱中，进行阶段式烘烤。烘烤参数为：第一段烘烤温度为60℃，烘烤时间为1h；第二段烘烤温度为80℃，烘烤时间为1h；第三阶段烘烤温度为85℃，烘烤时间为1h。
(5)益生菌坚果包装
将益生菌坚果半成品(益生菌核桃仁、益生菌巴旦木仁、益生菌腰果仁、益生菌榛子仁)与果干(蔓越莓干、黑加仑葡萄干、蓝莓干)进行混合后充氮包装，同时再袋中添加吸氧剂和干燥剂。
对比例4
(1)益生菌裹衣粉制备：
称取5份凝结芽孢杆菌与350份葡萄糖粉进行预混合，确保两者混合均匀，再与350份发酵酸奶粉、11份苹果酸、16份乳矿物盐、55份低聚果糖、3份麦芽糊精一同放入三维混合机中进行充分混合；
(2)粘液制备：
用5份异麦芽酮糖醇、麦芽糊精30份，与水90份，配成裹衣液；
(3)益生菌坚果裹衣
将10份脱皮核桃仁放入裹衣设备中，将粘液放入裹衣设备粘液添加端的储液罐中，粘液的添加参数为：0.4份粘液，时间1min，将裹衣粉放入裹粉端的储粉罐中，裹衣粉添加参数为：1份裹衣粉，时间1min，转速设置为40Hz，启动设备。1min后将粘液添加端端中的有粘液的坚果转移至裹粉端，同时裹衣粉开始自动添加，1min后将裹衣好的半成品移至烤盘中。
(4)益生菌坚果烘干
将烤盘中的半成品放入烘箱中，进行阶段式烘烤。烘烤参数为：第一段烘烤温度为60℃，烘烤时间为1h；第二段烘烤温度为80℃，烘烤时间为1h；第三阶段烘烤温度为85℃，烘烤时间为1h。
(5)益生菌坚果包装
将益生菌坚果半成品(益生菌核桃仁、益生菌巴旦木仁、益生菌腰果仁、益生菌榛子仁)与果干(蔓越莓干、黑加仑葡萄干、蓝莓干)进行混合后充氮包装，同时再袋中添加吸氧剂和干燥剂。
与实施例2相比，对比例1中不添加BC2000菌种，对比例2中不添加乳矿物盐，对比例3中不添加异麦芽酮糖醇，对比例4中不添加雨生红球藻。经50人分五组，分别食用实施例2、3、4的产品和对比例1、2的产品，连续食用7天、28天后，检测五组人员粪便中的凝结芽孢杆菌BC2000活菌(表6)。表明BC2000可在人体肠道中萌发，且乳矿物盐具有一定促进其增值的作用。
表6凝结芽孢杆菌数量级
注：CFU/g，是指每g粪便中含有的凝结芽孢杆菌数量级；
通过将实施例2、3、4和对比例1、2的产品通过模拟SGF[sp]和SIF[sp]后进行分离培养BC2000，转移至添加有蛋白样品和纤维素样品的溶液中处理一段时间，并通过分光光度法对其进行检测。根据表7结果表明菌种可产生消化蛋白质和纤维素的酶，并且含乳矿物盐样品效果更明显。
表7凝结芽孢杆菌分泌的酶活力
样品名称
实施例2
实施例3
实施例4
对比例1
对比例2
纤维素酶活U/g
96
52
170
0
49
注：U/g，是指每g处理液中酶的活力；
对比例4中不添加雨生红球藻、不加吸氧剂、不充氮，产品放置常温5个月后轻微哈味，6个月后较严重，8个月后开袋即可闻到，实施例1中的产品常温下放置8个月后风味正常无哈味。其中，益生菌坚果保质期内综合品评结果和评分标准，如表8和表9所示。
表8益生菌坚果保质期内综合品评结果
样品
0个月
2个月
4个月
5个月
6个月
7个月
8个月
实施例1
96
94
93
92
92
90
88
对比例4
96
91
85
80
75
70
65
表9评分标准
对益生菌坚果储存稳定性能进行测试：对实施例1的益生菌坚果，置于干燥、避光处，室温保存。分别于0、2、4、6、7、8、10个月进行检测，计算芽孢存活率。结果如表10所示，表明多功能凝结芽孢杆菌在益生菌坚果储藏期期间能稳定存在。
表10：益生菌坚果保质期内BC2000存活率
样品
0个月
2个月
4个月
6个月
7个月
8个月
10个月
实施例1
100％
100.00％
100.00％
99.95％
99.58％
98.78％
98.42％
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
