具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

如前所述，高盐环境中的营养物转化易受到盐度抑制，存在高盐污水处理困难、盐碱地物质转化难、营养易流失等问题。生物法实现营养物质转化的关键在于寻找具备对有机物、氮、磷等污染物利用能力的耐盐菌株，并实现该功能菌株在环境微生物组中的稳定作用。因此，需要开发一种发展具有明确代谢途径、能够快速富集启动、在盐环境下对营养物质综合转化能力好的适盐微生物及微生物组的方法。

有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一株海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)A4N01，该菌株已于2021年1月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，其生物保藏号为CCTCC NO：M2021120。该菌株能够利用氮同化途径高效代谢氨氮，同时具有自絮凝能力，同时更为重要的是，其代谢过程中不产生硝酸盐和亚硝酸盐，不产生氮损失，对盐度耐受范围广，从而可实现碳氮磷营养物质一体化去除。

所述海水嗜冷杆菌A4N01的代谢物也属于本发明的保护范围。

本发明的又一具体实施方式中，所述海水嗜冷杆菌A4N01的代谢物可以从海水嗜冷杆菌A4N01的发酵液中获得。海水嗜冷杆菌A4N01的代谢产物具体可按照如下方法制备：将所述海水嗜冷杆菌A4N01接种于液体发酵培养基中进行发酵培养，除去液体培养物(发酵液)中的海水嗜冷杆菌A4N01即得到海水嗜冷杆菌A4N01的代谢物。

其中，所述液体发酵培养基优选为海水LB培养基。

发酵培养条件具体为：在20～30℃(优选为25℃)培养20～30h(优选为24h)，转速：180-250r/min(优选为200r/min)。

所述的海水LB培养基组分如下：

蛋白胨10g/L，酵母提取物3g/L，陈海水配制，其中海水盐度为3.3％。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包含上述海水嗜冷杆菌A4N01和/或海水嗜冷杆菌A4N01的代谢物。

本发明的又一具体实施方式中，所述微生物菌剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为菌剂领域常用的且在生物学上是惰性的载体。

所述载体可为固体载体或液体载体；

所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇或/和聚二醇；

所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷或/和十二烷。

所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种适盐氮同化微生物组，其含有上述海水嗜冷杆菌A4N01和/或海水嗜冷杆菌A4N01的代谢物；更具体的，所述适盐氮同化微生物组通过将上述海水嗜冷杆菌A4N01接种至高盐污水中培养即得。

本发明的又一具体实施方式中，所述适盐氮同化微生物组可以为经上述处理后得到的高盐污水或者经上述处理后得到的活性污泥。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述适盐氮同化微生物组的构建方法，所述构建方法如下：

将上述海水嗜冷杆菌A4N01接种至含有高盐污水的生物反应器中，运行至具有稳定氨氮去除效率和沉降性能后，即得到适盐氮同化微生物组。本发明在研究意外发现，海水嗜冷杆菌A4N01可以驱动适盐氮同化微生物组的形成，通过管理微生物组结构，调控由其发展的微生物组的代谢方向，且不需要进行盐度梯度驯化，启动快、耗时少、操作简单、成本低廉。而且适盐氮同化微生物组同样具备良好的有机物和磷去除能力和良好的沉降性能，能实现对高盐废水中营养物质的回收；同时适盐氮同化微生物组含有大量有机质和有机氮，可用于有机肥制备，具备良好的实际应用之价值。

其中，控制接种菌体不少于5g/L。

所述高盐废水可以是实际高盐废水，也可以是模拟高盐废水；其中，所述模拟高盐污水的盐度不低于3％(w/w)，采用陈海水配置。

更具体的，所述模拟高盐废水组分包括：葡萄糖0.8g/L，乙酸钠0.5g/L，氯化铵0.55g/L，磷酸氢二钾0.14g/L和蛋白胨0.25mg/L，陈海水配制，盐度为3.3％。

所述生物反应器为序批式生物反应器(SBR)，序批式反应器就是采用一个池体的间歇式活性污泥系统，池体既作为生物反应器又作为沉淀池。当处理连续流污水时则需要至少两个或者多个池。

所述构建方法包括：

采用连续方式运行，以含盐量为3-7％的高盐废水为进水，曝气控制DO维持在2-3mg/L，进水碳氮比不小于10；运行周期为8h，包括5min进水，450min曝气、15min沉降和10min出水，不排泥。

体积交换率为62.5％，水力停留时间(HRT)为12.8h。

本发明的又一具体实施方式中，上述海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)A4N01、微生物菌剂和/或适盐氮同化微生物组在如下任意一种或多种中的应用：

a)单细胞蛋白合成；

b)氮磷营养物质回收应用；

c)废水处理；

d)有机肥料的制备；

e)土壤肥力改良；

f)盐碱地生物修复；

g)水体富营养化治理；

h)水体污染修复；

i)温室气体减排及碳中和；

其中，所述b)中，基于同化作用代谢氮；

所述c)中，废水包括高盐污水、海产养殖废水、工业含盐污水、海水冲厕废水；

所述g)中，所述水体包括淡水和海水，优选为海水。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种高盐环境中营养物质一体化、资源化转化的方法，所述方法包括：向高盐环境中施加上述海水嗜冷杆菌(Psychrobacteraquimaris)A4N01、微生物菌剂和/或适盐氮同化微生物组。

本发明的又一具体实施方式中，所述高盐环境为高盐水环境，所述高盐水环境其盐度不低于3％(w/w)，进一步优选为3％-7％(w/w)。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)A4N01的筛选及培养方法，步骤如下：

将取自于黄海(122°48′E,35°59′N)的海洋沉积物接种于海水LB培养基，于摇床中在25℃、200r/min的条件下振荡培养24h，在取上清液在海水LB固体平板上划线分离。

将平板上形成的单一菌落分别接种于海水LB培养基中，摇床中在25℃、200r/min的条件下振荡培养24h，观察筛选具有絮凝能力的微生物。

将上面筛选得到的具有絮凝能力的菌株接种于氨氮培养基中，考察其氨氮及总氮去除能力，筛选氨氮去除效率高、无亚硝酸盐和硝酸盐产生、系统总氮无损失的菌株，即为本发明所述的海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)A4N01。

将所测16s rDNA序列输入到NCBI网站的GenBank数据库网站上进行相似性比较，并绘制系统发育树。系统发育树结果如图1所示。结果表明，海水嗜冷杆菌(Psychrobacteraquimaris)A4N01与Psychrobacter aquimaris具有最高的相似性，结合生理生化、菌落形态和指标，将此菌株鉴定命名为Psychrobacter aquimaris A4N01。

实施例2

海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)A4N01菌株的氮代谢理化特性测定方法如下

(1)将海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)A4N01接种于海水LB培养基中，在摇床中于25℃、200r/min的条件下振荡培养24h，制得活化菌液。①取制得的海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)A4N01活化菌液在4000rpm离心10min；②去除上清液后，使用灭菌的生理盐水(0.85％NaCl)重悬洗涤菌体；4000rpm离心10min。③使用灭菌的生理盐水重悬菌体后，按照10％的接种量分别接种于含氨氮、亚硝氮、尿素作为氮源的培养基中，按时间点取样测定该菌株对各类氮源的利用及转化。

上述方法中的氨氮、亚硝氮、尿素培养基由陈海水配置，海水盐度为3.3％，其他组分如表1：

表1

从图2中可以看到，该菌株可以利用氨氮、亚硝氮、尿素作为氮源，且在氨氮转化过程中无硝酸盐、亚硝酸盐产生。从图3中可以看出，该菌株在同化利用氨氮的过程中，体系内总氮由水相转化进入生物质，无氮损失。

实施例3

海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)A4N01菌株的氮代谢理化特性测定方法如下

将海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)A4N01接种于海水LB培养基中，在摇床中于25℃、200r/min的条件下振荡培养24h，制得活化菌液。①取制得的海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)A4N01活化菌液在4000rpm离心10min；②去除上清液后，使用灭菌的生理盐水(0.85％NaCl)重悬洗涤菌体；4000rpm离心10min；③使用灭菌的生理盐水重悬菌体后，按照10％的接种量分别接种于不同盐度的模拟废水中，按时间点取样测定该菌株对氨氮的去除情况。

上述方法中不同盐度的模拟废水由1％、2％、3％、4％、5％(w/w)的氯化钠配置，其他组分如表2：

表2

从图4中可以看到，该菌株对盐度耐受范围广，1-5％的盐度条件下对氨氮均具有较高的去除效果。在盐度1-3％范围内，氨氮去除率超过74％，盐度4-5％时，氨氮去除率也超过60％。

实施例4

由海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)A4N01发展适盐氮同化微生物组的方法，步骤如下：

(1)将海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)A4N01接种于海水LB培养基中，在摇床中于25℃、200r/min的条件下振荡培养24h，制得活化菌液；

(2)将步骤(1)制得的海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)A4N01菌体接种于序批式生物反应器(SBR)中，控制反应器内接种活化菌体浓度在5g/L左右。序批式生物反应器(SBR)有效容积为3.2L，采用连续方式运行，底部安装空气扩散装置，起到曝气和搅拌作用。反应器每一个循环包括进水、曝气、沉降、排水四个步骤，包括5min进水，450min曝气、15min沉降和10min出水，每个周期8小时，体积交换率为62.5％，水力停留时间(HRT)为12.8h。运行期间不排泥，获得氨氮去除效率稳定且沉降性能良好的适盐氮同化微生物组。序批式生物反应器运行参数如表3所示。

所述步骤(1)中的海水LB培养基组分如下：

蛋白胨10g/L，酵母提取物3g/L，陈海水配制，海水盐度为3.3％。

表3

序批式生物反应器(SBR)运行时，采用合成废水模拟污水的成分，合成废水以陈海水配置，组分如表4所示：

表4

实施例5

将实施例4中的适盐氮同化微生物组在序批式生物反应器(SBR)中按实施例4中的模拟高盐废水的条件处理废水中，反应器运行参与实施例4相同，并定时取样测量其COD、氨氮、总氮、总磷浓度。运行结果如图3所示，由结果可以看出，整个运行过程中，由海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)A4N01发展来的适盐氮同化微生物组处理效果良好且稳定，对模拟高盐废水中的氨氮、总氮最终去除率可达84％、75％，且对废水中氮的去除以同化为主，无亚硝酸盐和硝酸盐的累积。同时，对模拟高盐废水中的有机物、磷也具有良好的去除能力，COD、总磷最终去除率分别达到98％和72％以上。

实施例6

将实施例4中的适盐氮同化微生物组按照5g/L的接种量转移入批次培养基中，控制溶解氧浓度2-3mg/L，按时间点取样，测定8h运行周期内的氨氮去除转化情况和总氮平衡情况。

批次培养基以陈海水配置，组分如表5所示：

表5

从图6中可以看出，由海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)A4N01所发展的微生物组表现出与该菌株相似的氮利用特征，仍以氮同化的方式去除氨氮，过程中无亚硝酸盐和硝酸盐的产生，所去除的氨氮积累进入生物质，无氮损失。

实施例7

步骤(1)-(3)与实施例4相同，之后将适盐氮同化微生物组在序批式生物反应器(SBR)中处理盐度分别为3％、4％、5％、6％、7％(w/w)的合成模拟高盐废水，运行方式及参数与实施例4相同，模拟高盐废水的碳氮比不低于10，氨氮为100mg/L，总磷为20mg/L。近60天运行过程中对氨氮的去除效果如图7所示，由结果可以看出，在不同盐度条件下该适盐氮同化微生物组处理系统均具有较短的启动时间，且运行效果稳定。氨氮、总氮和总磷的平均去除效率如图8所示，由结果可以看出，由实施例4中获得的适盐氮同化微生物组具有较好的盐度冲击能力，在3％盐度(w/w)下发展的适盐氮同化微生物组不经过盐度驯化可直接实现对更高盐度废水的处理，适盐氮同化微生物组适应性强；适盐氮同化微生物组对盐度为3％-7％(w/w)的模拟高盐废水中的氨氮均具有一定去除能力，盐度不高于6％时，对模拟高盐废水中的氨氮的去除效率不低于50％。且对废水中氮的去除以同化为主，无亚硝酸盐和硝酸盐的累积，也无氮损失，同时，适盐氮同化微生物组对模拟高盐废水中的磷也具有良好的去除能力。

实施例8

步骤(1)-(2)与实施例4相同，进行序批式生物反应器(SBR)运行时，按照实施例4中表3的参数进行，并定时取样测量其氨氮浓度。

本实施例采用合成废水模拟污水的成分，合成废水以陈海水配置，组分如表6所示：

表6

运行结果如图9所示，由结果可以看出，170天的运行过程中，该适盐氮同化微生物组处理效果良好且稳定，对模拟高盐废水中的氨氮去除率保持在85％以上。适盐氮同化微生物组群落结构组成变化情况如图10所示。

综上，该海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)A4N01具备良好的盐度耐受能力，可从高盐废水中高效回收氮、磷及有机质，由于其氮代谢过程不产生硝酸盐、亚硝酸盐和氮损失，可实现对高盐污水中营养物质高效回收转化，今后可应用于高盐污水处理、盐碱地生物修复等领域。由该海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)A4N01所发展的适盐氮同化微生物组，由于含有较高的氮、磷和有机质，是土壤肥料的良好来源。未来可制作成为肥料，应用于土壤改良、盐碱地生物修复等领域。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。