具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

如前所述，石油的提炼、加工过程中，难免会产生高温含油废水，高温含油废水中溶解氧浓度下降，粘度降低，常规的石油烃降解菌难以适应这样的环境，因此大部分高温含油废水不得不设置冷却塔降低废水温度，这就加大了成本提高了处理难度。

而耐热降解菌具有耐高温的降解酶系，能够在高温环境下利用石油烃类有机物作为碳源生长、传代，为高效稳定的处理高温含油废水提供了可能。破乳菌对废水中乳化油颗粒具有很高的分离去除效果，因此，筛选底物利用范围广的耐热石油降解菌，尤其是能够降解重质组分的石油降解菌，并配合破乳菌开发复合菌剂，是处理高温含油废水的关键所在。

有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一株耐高温石油烃降解菌，所述耐高温石油烃降解菌为芽孢杆菌(Bacillus paramycoides)A4-1或芽孢杆菌(Bacillusparamycoides)P4-3；

其中，所述芽孢杆菌A4-1已送至中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2021年1月20日，保藏编号为CCTCC NO：M 2021117。所述芽孢杆菌A4-1可以在低温和高温环境下以原油(包括重质原油)为唯一碳源进行生长，并对石油污染物进行降解去除，无须人为添加能源、碳源、热源等。

所述芽孢杆菌P4-3已送至中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2021年1月20日，保藏编号为CCTCC NO：M 2021118。所述芽孢杆菌P4-3具有破乳功能。

本发明又一具体实施方式中，提供一种耐高温石油烃降解菌组合物，所述组合物包括上述芽孢杆菌(Bacillus paramycoides)A4-1和芽孢杆菌(Bacillus paramycoides)P4-3。

所述芽孢杆菌(Bacillus paramycoides)A4-1和芽孢杆菌(Bacillusparamycoides)P4-3的菌落数之比为0.1～10:1，优选为1:1。

本发明又一具体实施方式中，提供上述耐高温石油烃降解菌或耐高温石油烃降解菌组合物在制备耐高温石油烃降解菌剂中的应用。

本发明又一具体实施方式中，提供一种耐高温石油烃降解菌菌剂，所述耐高温石油烃降解菌菌剂包括上述耐高温石油烃降解菌或耐高温石油烃降解菌组合物。

本发明的又一具体实施方式中，所述微生物菌剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为菌剂领域常用的且在生物学上是惰性的载体。

所述载体可为固体载体或液体载体；

所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇或/和聚二醇；

所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷或/和十二烷。

所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

本发明又一具体实施方式中，提供上述耐高温石油烃降解菌、耐高温石油烃降解菌组合物和/或耐高温石油烃降解菌菌剂在生物修复去除环境中的石油污染物中的应用。

本发明又一具体实施方式中，所述环境包括土壤和水体。

本发明又一具体实施方式中，提供一种石油污染环境的治理方法，所述治理方法包括向所述石油污染环境中施加上述耐高温石油烃降解菌、耐高温石油烃降解菌组合物和/或耐高温石油烃降解菌菌剂。

本发明又一具体实施方式中，所述石油污染环境包括石油污染土壤和石油污染水体。

本发明又一具体实施方式中，治理过程中，所述石油污染环境温度可以在25℃以上，包括25～50℃。

为了更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明做进一步说明。

以下实施例中，采用的培养基的成分：

1)无机盐培养基:Na₂HPO₄·3H₂O 1.97g·L^-1,KH₂PO₄ 0.22g·L^-1,MgS0₄·7H₂O0.2g·L^-1,NH₄Cl 1.908g·L^-1,CaCl₂ 0.02g·L^-1,FeSO₄·7H₂O 0.0lg·L^-1,NaCl 33g·L^-1。

2)石油液体培养基:在无机盐培养基的基础上添加重质原油5g·L^-1。

3)固体分离培养基:在无机盐培养基的基础上添加琼脂20g·L^-1，重质原油5g·L^-1。

4)破乳液体培养基:在无机盐培养基的基础上添加液体石蜡4％，酵母提取物5g·L^-1，

5)LB固体培养基:酵母提取物3g·L^-1，胰蛋白l0g·L^-1，琼脂20g·L^-1。

实施例中所采用的乳液、含油废水配制方法：

1)O/W乳液：吐温80(1g/L)水溶液300ml与司盘80(0.8g/L)煤油溶液200ml混合，并使用组织剪切机15000转/分处理10分钟；

2)W/O乳液：0.8％吐温80水溶液与煤油体积比1:2混合，并使用组织剪切机15000转/分处理10分钟；

3)原油乳液：原油与去离子水1:1混合，并使用组织剪切机15000转/分处理10分钟；

4)模拟含油废水:KH₂PO₄ 18mg·L^-1,NaNO₃ 48mg·L^-1,MgS0₄·7H₂O 1g·L^-1,NH₄Cl106.4mg·L^-1,CaCl₂ 1g·L^-1,NaCl 15g·L^-1,原油100mg·L^-1,吐温80 6mg·L^-1。

实施例l

石油降解菌的驯化、分离与纯化方法:

1)将5g海底沉积物样品放入50mL离心管中，加入25mL生理盐水，涡旋震荡器上震荡5-l0min，使土壤充分打散，静置沉淀。其中，海底沉积物样品来源于。

2)取l0mL上清液加入100mL石油液体培养基中，在50℃,180r/min摇床培养7天。

3)7天后，按5％接种，重新转接入新鲜的石油液体培养基中，与上述培养条件相同，连续转接富集培养3次。

4)采用稀释涂布平板法进行分离，将培养液稀释至10^-4或10^-5后，取100uL菌液稀释液涂布于新鲜的固体分离培养基中。

5)培养48h，待平板长出菌落后选择不同颜色及形态的单菌落，分别回接于固体分离培养基和石油液体培养基中，在两种含油培养基中均能生长的即为石油降解微生物。

筛选出来的菌株划线培养并重新接种回石油液体培养基，纯化三次，涂布于LB固体培养基中，收集菌体，加入30％甘油，于-80℃保存。

实施例2

菌株的分子生物学鉴定

1)各保存的菌株在LB固体培养基中划线培养，培养后利用DNA试剂盒对其进行全基因组提取，并采用引物27-F和1492-R进行PCR扩增。PCR反应体系为25uL:上下游引物(10umol/L)各lμL，DNA模板(l0ng/μL)1μL，2×Taq Master Mix 12.5μL，超纯水补足至25μL。PCR反应条件为:94℃5min；94℃30s,58℃30s,72℃1min30s,35个循环；终延伸72℃7min。

2)PCR扩增产物委托上海美吉生物医药科技有限公司进行测序，所得基因序列通过GenBank进行同源性比对，确定其分类地位。

菌株A4-1的16S rRNA基因测序结果如SEQ ID NO:1所示，结果表明其基因序列长度约为764(序列)，序列比对结果表明其与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的多个种的16SrRNA基因序列相似率达到99％，结果表明该菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。

GGTGCATTCGCGCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTCAACTAGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCCGCCTTTCAATTTCGAACCATGCGGTTCAAAATGTTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACTTCATAAGAGCAAGCTCTTAATCCATTCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCATCCTGAGCAGAA(SEQ ID NO:1)菌株P4-3的16S rRNA基因测序结果如SEQ ID NO:2所示，结果表明其基因序列长度约为1458(序列)，序列比对结果表明其与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的多个种的16S rRNA基因序列相似率达到99％，结果表明该菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。

CCTTAGGCGGCTGGCTCCAAAAAGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTAAATGATGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAACTTCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTCAACTAGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCCGCCTTTCAATTTCGAACCATGCGGTTCAAAATGTTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACTTCATAAGAGCAAGCTCTTAATCCATTCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCATCCTGA(SEQ ID NO:2)

实施例3

本发明芽孢杆菌(Bacillus paramycoides)A4-1的原油降解率采用重量法计算。具体步骤如下:配制液体培养基，并添加0.5g(1g/100m1)来源于我国胜利油田的原油样品，灭菌备用。接种生长至对数生长期的A4菌液4m1至100m1培养基中，50℃培养7天，并设空白对照组，原油降解效果如图2所示。由图2可见：经培养后，未接种菌株A4的空白对照组培养基中残油仍是清晰可见的一块固体状重质原油，无任何乳化、分散现象；而接种了菌株A4的实验组培养基中，残油是明显的极小体积的液质油滴，分散在培养基的表层，说明了菌株A4对原油显著的降解能力。进一步为了计算原油的降解率，随后采用石油醚并使用分液漏斗分别充分萃取实验组与对照组培养瓶中的残存原油，所得原油组分40℃烘干，置干燥器中冷却恒重，称重，根据如下公式计算原油降解率。MO为空白对照组残油重量，M1为实验组残油重量。

原油降解率＝(M0-M1)/初始原油重量×100％

经计算本发明菌株A4-1的原油降解率为25％。实际降解效果图(图2)和25％的原油降解率均证明本发明菌株具有重质原油和石油的降解乳化功能。

利用气相色谱一质谱联用技术(GC-MS)对石油烃的降解率进行测定。降解效果见图3。从峰图中可以明显看出，经过7天的培养，饱和烃各组分的峰发生了明显的变化，菌株A4-1的降解效果十分显著。各链烷烃组分有非常明显的降解。

实施例4

选取芽孢杆菌(Bacillus paramycoides)P4-3进行如下操作:上述菌株P4-3接种于100mLLB液体培养基中，25℃条件下在180-200转/分摇床上振荡培养24小时，至对数生长期中期，制得一级种子，以体积比为5％-8％的接种量，接一级种子于300mL破乳液体培养基中，25℃条件下在180-200转/分摇床上振荡培养18-24小时至对数生长后期，取培养好的细菌全培养液2ml加入到配制好的乳液(W/O乳液、O/W乳液、原油乳液)5ml中，用力摇晃200次将溶液混合均匀，将混合乳液放置到25℃的水浴锅中恒温静置24h。根据如下公式计算细菌破乳率。H₀为乳化层高度，H₁为混合乳液总高度。

原油降解率＝H₀/H₁×100％

经计算本发明菌株P4-3对W/O乳液、O/W乳液和原油乳液的降解率分别为82％、90％和91.1％。实际降解效果图(图4)证明本发明菌株具有很强的破乳功能。

实施例5

选取芽孢杆菌(Bacillus paramycoides)A4-1与芽孢杆菌(Bacillusparamycoides)P4-3进行如下操作:上述菌株接种于100mL LB液体培养基中，50℃条件下在180-200转/分摇床上振荡培养24小时，至对数生长期中期，在5000转/分条件下离心8分钟，分别收集制得的菌体，并用生理盐水洗涤1-2次；之后用生理盐水重新配成OD600达到3的菌悬液，备用；将芽孢杆菌(Bacillus paramycoides)A4-1与芽孢杆菌(Bacillusparamycoides)P4-3等体积混合成降解菌剂，以10％的投加量加入到初始含油量为50mg·L^-1模拟含油废水中，50℃条件下180-200转/分摇床上振荡培养。根据紫外分光光度法检测含油废水中的总石油烃含量。

经计算，本发明菌株A4-1与P4-3对高温含油废水中总石油烃的去除率分别达到30.26％与42％，而经过两株菌等体积混合的降解菌剂对高温含油废水中总石油烃的去除率达到62.43％(图5)。证明本发明菌剂与单一菌剂相比具有更高的总石油烃去除率。

实施例6

选取芽孢杆菌(Bacillus paramycoides)A4-1与芽孢杆菌(Bacillusparamycoides)P4-3进行如下操作：上述菌株分别接种于100mLLB液体培养基中，50℃条件下在180-200转/分摇床上振荡培养24小时，至对数生长期中期，在5000转/分条件下离心8分钟，分别收集制得的菌体，并用生理盐水洗涤1-2次；之后用生理盐水重新配成OD600达到3.5的菌悬液，备用；将芽孢杆菌(Bacillus paramycoides)A4-1与芽孢杆菌(Bacillusparamycoides)P4-3等体积混合成降解菌剂。将降解菌剂转移到两个相同的序批式反应器中，反应器菌剂初始投加浓度为3g/L，用以处理模拟含油废水。序批式反应器曝气强度调整为1L/min；设定运行周期为8小时，主要包括曝气时间控制在7小时，沉降30分钟，进水和排水共30分钟；运行期间由电磁搅拌器和搅拌磁子提供混流；排水由电磁阀控制，体积交换比为50％，水力停留时间为16小时，两个反应器的温度分别设定在25±3℃与50±3℃。根据紫外分光光度法检测含油废水中的总石油烃含量。

经计算，两个反应器出水中总石油烃含量均低于10mg/L(图6)，本发明菌剂对含油废水中总石油烃的平均去除率分别达到93.64％(25℃)与93.44％(50℃)，证明本发明菌剂对含油废水具有良好的石油烃去除功能。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 耐高温石油烃降解菌、降解菌组合物、降解菌菌剂及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 764

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌菌株A4-1 16S rDNA

<400> 1

ggtgcattcg cgctcagtgt cagttacaga ccagaaagtc gccttcgcca ctggtgttcc 60

tccatatctc tacgcatttc accgctacac atggaattcc actttcctct tctgcactca 120

agtctcccag tttccaatga ccctccacgg ttgagccgtg ggctttcaca tcagacttaa 180

gaaaccacct gcgcgcgctt tacgcccaat aattccggat aacgcttgcc acctacgtat 240

taccgcggct gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg ttaggtaccg tcaaggtgcc 300

agcttattca actagcactt gttcttccct aacaacagag ttttacgacc cgaaagcctt 360

catcactcac gcggcgttgc tccgtcagac tttcgtccat tgcggaagat tccctactgc 420

tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg tggccgatca ccctctcagg 480

tcggctacgc atcgttgcct tggtgagccg ttacctcacc aactagctaa tgcgacgcgg 540

gtccatccat aagtgacagc cgaagccgcc tttcaatttc gaaccatgcg gttcaaaatg 600

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<210> 2

<211> 1458

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌菌株P4-3 16S rDNA

<400> 2

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ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc 120

gattactagc gattccagct tcatgtaggc gagttgcagc ctacaatccg aactgagaac 180

ggttttatga gattagctcc acctcgcggt cttgcagctc tttgtaccgt ccattgtagc 240

acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg 300

gtttgtcacc ggcagtcacc ttagagtgcc caactaaatg atggcaacta agatcaaggg 360

ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca 420

ccacctgtca ctctgctccc gaaggagaag ccctatctct agggttgtca gaggatgtca 480

agacctggta aggttcttcg cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg 540

ggcccccgtc aattcctttg agtttcagcc ttgcggccgt actccccagg cggagtgctt 600

aatgcgttaa cttcagcact aaagggcgga aaccctctaa cacttagcac tcatcgttta 660

cggcgtggac taccagggta tctaatcctg tttgctcccc acgctttcgc gcctcagtgt 720

cagttacaga ccagaaagtc gccttcgcca ctggtgttcc tccatatctc tacgcatttc 780

accgctacac atggaattcc actttcctct tctgcactca agtctcccag tttccaatga 840

ccctccacgg ttgagccgtg ggctttcaca tcagacttaa gaaaccacct gcgcgcgctt 900

tacgcccaat aattccggat aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt 960

agttagccgt ggctttctgg ttaggtaccg tcaaggtgcc agcttattca actagcactt 1020

gttcttccct aacaacagag ttttacgacc cgaaagcctt catcactcac gcggcgttgc 1080

tccgtcagac tttcgtccat tgcggaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtctgg 1140

gccgtgtctc agtcccagtg tggccgatca ccctctcagg tcggctacgc atcgttgcct 1200

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