一株产热稳定和pH稳定细菌素的乳酸乳球菌及其筛选方法和应用
技术领域
本发明属于微生物
技术领域
，具体涉及一株产热稳定和pH稳定细菌素的乳酸乳球菌及其筛选方法和应用。背景技术
植物基发酵制品在制备和保藏过程中，多种潜在因素可导致染菌而引起食物中毒。金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌是常见的食源性致病菌。其中，鼠伤寒沙门氏菌是引起急性胃肠炎的主要病原菌之一，若未及时治疗将引起败血症，即细菌侵入血液循环并在血中生长繁殖，产生毒素而引发急性全身性感染。在国标中制定了沙门氏菌的限量标准，规定肉制品、水产制品、粮食制品等所有11类食品，按照二级采样方案同批次采集5份样品，在被检的5份样品中，不允许任一样品检出沙门氏菌；金黄色葡萄球菌能够产生肠毒素引起食物中毒，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性微生物食物中毒事件的25％左右，金黄色葡萄球菌成为排名第三的微生物致病菌，对人体肠道产生破坏导致呕吐腹泻等症状。在国标中制定了金黄色葡萄球菌的限量标准，规定肉制品、水产制品、粮食制品、即食豆类制品、即食果蔬制品、饮料、冷冻饮品及即食调味品等8类食品，按照三级采样方案同批次采集5份样品，每份样品中的金黄色葡萄球菌浓度均不得超出1000CFU/g(mL)，仅允许其中1份样品在100-1000 CFU/g(mL)之间。
目前植物基发酵制品主要依赖传统的苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸钾和乳酸链球菌素(Nisin)等防腐剂来抑制此类食源性病原菌。然而，由于苯甲酸、苯甲酸钠和山梨酸钾呈味、具低毒性，以及Nisin在pH中性条件下不耐热而使其使用受到限制。
发明内容
本发明的目的是提供一株产热稳定和pH稳定细菌素的乳酸乳球菌(L. lactis)及其筛选方法和应用，该菌为NCU036018，其产生的细菌素能够在pH 2-10范围内同时抑制鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，且在pH中性条件下经高温处理抑菌活性依然显著，相对于传统的化学、生物防腐剂(Nisin)更有优势，可广泛运用于发酵制品的制备和保藏。
本发明提供一株产热稳定和pH稳定细菌素的乳酸乳球菌，该乳酸乳球菌筛选自自然发酵的泡菜，菌株为NCU036018，其16S rRNA序列如SEQ ID：1 所示，该乳酸乳球菌菌株已于2021年3月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.22077，分类命名为乳酸乳球菌Lactobacillus lactis。
本发明还提供一株产热稳定和pH稳定细菌素的乳酸乳球菌的筛选方法，包括如下步骤：
((1)培养：取泡菜样品液1mL用生理盐水进行梯度稀释，选取合适浓度梯度，涂布于MRS固体培养基上，37℃倒置培养46-50h；
(2)纯化：挑取步骤(2)培养基上具有不同形态的单菌落进行连续划线纯化培养；
(3)保存：挑取步骤(3)纯化好的单菌落于10mL MRS液体培养基中孵育22-25h，分别取培养液和50％的灭菌甘油各500μL按1:1(v/v)混合并保存于-80℃冰箱；
(4)活化：将步骤(3)分离保存的菌株接种到MRS液体培养基中，37℃活化22-25h，再以2％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃恒温培养22-25 h得到乳酸菌发酵液；
(5)分离：将步骤(4)中发酵液离心收集上清液，调节上清液pH为6.5 并用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液采用高压灭菌锅121℃加热30min，置于4℃备用；
(6)筛选：将培养24h后的指示菌加入至LB培养基中，混匀后倒平板，待冷却凝固后打8mm的孔，每皿三个孔，向每个孔中加入200μL步骤(5)制备好的滤液，37℃下培养14-16h，测定抑菌圈直径，根据抑菌圈直径大小筛选抑菌性能优异的菌株。
上述技术方案中，通过将乳酸乳球菌产生的细菌素进行高温灭菌预处理，目的是排除那些产热不稳定细菌素的乳酸乳球菌，便于筛选出产热稳定细菌素的乳酸乳球菌。
进一步地，上述技术方案中步骤(1)中泡菜样品采自市场上不同种类自然发酵的泡菜，浓度梯度设置为10-3，10-4，10-5。
进一步地，上述技术方案中步骤(5)中离心转速为6500-7000g，分离时间为10-12min。
进一步地，上述技术方案中步骤(6)中指示菌为金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌，其加入到LB培养基中后的浓度为1.0×107CFU/mL。
本发明还提供一种根据上述的乳酸乳球菌生产的细菌素，所述细菌素能在 pH 2-10范围内同时抑制鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。
进一步地，上述技术方案中细菌素的生产时间为15-16h。
本发明还提供一种根据上述的细菌素在食品发酵和保藏过程中的应用。
相对于现有技术的有益效果：
1.本发明的乳酸乳球菌NCU036018筛选自自然发酵的泡菜，天然、安全；
2.本发明的乳酸乳球菌NCU03601产生的细菌素在pH 2-10范围内能够同时抑制鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，且在pH中性条件下经高温处理抑菌活性依然显著，相对于传统的化学、生物防腐剂更有优势，该细菌素作为防腐剂没有味道，不影响食品品质，可广泛运用于发酵制品和保藏保鲜。
3.本发明提供了一种安全、无味、可生物降解、在pH中性条件下热稳定的生物防腐措施，克服了传统防腐剂低毒、呈味以及pH中性条件下热敏感的局限。
附图说明
图1为本发明乳酸乳球菌NCU036018对金黄色葡萄球菌(A)和鼠伤寒沙门氏菌(B)的生长抑制作用图；
图2为本发明乳酸乳球菌NCU036018菌落镜检图；
图3为本发明乳酸乳球菌NCU036018细菌素代谢动力学生长曲线图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例涉及的原料若无特别说明，均为普通市售品，皆可通过市场购买获得。
本发明的上述各项技术特征和在下文(如实施案例)中具体描述的各项技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
下面结合图示和实施例对本发明作进一步详细描述：
1、乳酸乳球菌菌株的筛选：
(1)培养：从市场上采集不同种类自然发酵的泡菜样本若干份。取泡菜样品液1mL用生理盐水进行梯度稀释，选取合适浓度(10-3，10-4，10-5)梯度，涂布于MRS固体培养基上，37℃倒置培养48h；
(2)纯化：挑取培养基上具有不同形态的单菌落进行连续划线纯化培养；
(3)保存：随后挑取纯化好的单菌落于10mL MRS液体培养基中孵育24 h，分别取培养液和50％的灭菌甘油各500μL按1:1(v/v)混合并保存于-80℃冰箱；
(4)活化：将各分离株接种到MRS液体培养基中，37℃活化24h，再以 2％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃恒温培养24h得到乳酸菌发酵液；
(5)分离：将发酵液离心(转速6500g，时间10min)收集上清液，调节上清液pH为6.5并用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液采用高压灭菌锅121℃加热 30min，置于4℃备用。
(6)筛选：将培养24h后的指示菌(金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌) 加入至LB培养基中使其浓度为1.0×107CFU/mL，混匀后倒平板，待冷却凝固后打孔(8mm)，每皿三个孔，向每孔中加入200μL制备好的发酵上清液，37℃下培养14-16h，用游标卡尺测定抑菌圈直径，根据抑菌圈直径大小来筛选抑菌性能优异的菌株，并命名为NCU036018。其中，从图1可以看出，菌株 NCU036018发酵上清液表现出对金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌生长具有显著的抑制能力。
2、乳酸乳球菌菌落形态：
将乳酸乳球菌NCU036018涂布在含有溴甲酚紫的MRS，培养后观察，从图2可以看出，菌株NCU036018在平板上的菌落形态较小，呈圆形凸起，有光泽，为革兰氏阳性，链球状。
3、接触酶实验：
挑取目标菌株单菌落于载玻片上，然后滴加3％过氧化氢数滴并立即观察，其中菌株NCU036018不产生气泡，说明此菌株为阴性。
4、糖发酵实验：
采用微量生化管对目标菌株进行硫化氢、糖发酵等生理生化试验，参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》，对菌株的生理生化特性进行分析，确定目标菌株种属：取待测菌的24h培养液分别接种到NaCl(4％)、硫化氢、葡萄糖、阿拉伯糖、纤维二糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、松三糖、蜜二糖、棉子糖、鼠李糖、核糖、水杨素、山梨糖、蔗糖、木糖、七叶苷微型发酵管内，开口朝下，置灭菌培养皿中37℃培养24h，观察结果并记录。
若菌株可发酵某种糖或醇产酸，培养基内指示剂溴甲酚紫会(pH 7.0)由紫色变成黄色(pH 5.4)，如果不发酵，则仍保持紫色。如发酵的同时又产生气体，则液体培养基中的倒管会有气泡。
从表1乳酸乳球菌NCU036018糖发酵结果可以看出，该菌液体培养时能发酵葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、果糖和甘露糖，不能利用菊糖；经过实验对比还显示出该均有不耐4％的NaCl。
表1乳酸乳球菌NCU036018糖发酵结果
5、菌株NCU036018细菌素代谢动力学：
将菌株NCU036018接种到MRS液体培养基中，37℃活化24h，再以2％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃恒温连续培养36h，每隔2h采样，采用紫外分光光度计、pH计和琼脂平板打孔法检测发酵液OD600、pH及抑菌活性。
菌株NCU036018在MRS液体培养基中的生长曲线参见图3所示，培养4h 左右进入对数期，菌落数开始随时间呈指数快速生长，8h左右菌体开始进入稳定期；发酵上清液的pH从初始的6.53左右迅速下降，直到进入对数生长期pH 逐渐稳定在4.2左右；菌株NCU036018发酵液的抑菌性能随着时间先增加再下降，最终确定细菌素的最佳生产时间为16h左右。
6、分子生物学鉴定：
(1)使用细菌DNA提取试剂盒进行乳酸菌基因组DNA的提取。
(2)将获得的基因组DNA以细菌通用引物进行PCR扩增。PCR反应体系和反应程序见表2和表3。将PCR产物送至上海生工公司进行测序，将所得序列在Gene Bank数据库中使用BLAST工具进行同源性比较，以此确定分离株的种属。
表2 PCR反应体系
表3 PCR反应程序
鉴定结果：所得序列片段长度为980bp，将所得序列输入NCBI进行BLAST 序列比对，结果为所得序列片段与Lactococcus latis同源性大于97％。
实施例1：菌株NCU036018所产细菌素的生物降解性
将活化后的菌株NCU036018在MRS培养基中37℃下培养24h，并于4℃条件下6500g离心10min，除去沉淀得到无细胞发酵上清液，再将无细胞发酵上清分成6组，加入过氧化氢酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶 K、α-糜蛋白酶37℃处理2h，各酶终浓度为1mg/mL，将混合液置于100℃水浴锅5min将酶灭活，调节pH至6.5，分别测定不同处理组对指示菌金黄色葡萄球菌的抑制活性，菌株NCU036018所产细菌素对不同酶的敏感性参见表4。
表4乳酸乳球菌NCU036018所产细菌素对不同酶的敏感性
结果表明，该菌所产细菌素对淀粉酶、过氧化氢酶不敏感，而对胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、α-糜蛋白酶敏感，即该细菌素可被多种蛋白酶生物降解。
实施例2：菌株NCU036018所产细菌素的优良pH稳定性
将活化后的菌株NCU036018在MRS培养基中37℃培养24h，并于4℃条件下6500g离心10min。除去沉淀得到无细胞发酵上清液，再将无细胞发酵上清液分成9组，调节溶液的pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10处理30min 后，再将溶液调回pH 6.5，分别测定不同处理组对指示菌金黄色葡萄球菌的抑制活性，菌株NCU036018所产细菌素的pH稳定性参见表5。
表5乳酸乳球菌NCU036018所产细菌素的pH稳定性
结果表明，乳酸乳球菌NCU036018所产细菌素在pH 2-10范围内呈现显著抑菌活性，说明该细菌素具有优良的pH稳定性。
实施例3：菌株NCU036018所产细菌素的优良热稳定性
将菌株NCU036018接种于MRS培养基中进行过夜培养，对发酵液离心分离弃去菌体(6500g，10min)，获得的乳酸菌发酵上清液调pH至6.5后分别在 60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴和121℃高压蒸汽下处理30min，以未做处理的发酵上清作为对照。以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用琼脂扩散法进行抑菌活性测定，探究热处理对pH中性发酵上清液抑菌活性的影响，菌株 NCU036018所产细菌素的热稳定性参见表6。
表6乳酸乳球菌NCU036018所产细菌素的热稳定性
结果表明，用不同温度处理该pH中性发酵上清30min后抑菌活性依然显著，说明该菌所产细菌素在pH中性条件下耐高温。
综上所述，本发明提供了一种安全、无味、可生物降解、在pH中性条件下热稳定的生物防腐措施，克服了传统防腐剂低毒、呈味以及pH中性条件下热敏感的局限。
最后需要强调的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南昌大学
<120> 一株产热稳定和pH稳定细菌素的乳酸乳球菌及其筛选方法和应用
<130> 20210601
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 980
<212> DNA
<213> 乳酸乳球菌（L.lactis）
<400> 1
gggggcgggg tgctatacat gcagttgagc gctgaaggtt ggtacttgta ccgactggat 60
gagcagcgaa cgggtgagta acgcgtgggg aatctgcctt tgagcggggg acaacatttg 120
gaaacgaatg ctaataccgc ataacaactt taaacacaag ttttaagttt gaaagatgca 180
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cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct 960
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