具体实施方式

结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。

实施例1：动物双歧杆菌NSY0201的分离鉴定

1、菌株的分离筛选

以来源于内蒙古锡林郭勒盟的天然发酵奶酪为样品。取3份样品按照1%的用量加入到10%脱脂乳培养基中，37℃培养，待其凝乳后进行梯度稀释，逐渐稀释至10^-8梯度。选择3个适宜稀释度，分别取1mL于改良MRS固体培养基中，37℃下厌氧培养48h，进行菌落形态观察，挑选不同形态的单菌落再次在改良MRS固体培养基上划线分离，37℃下厌氧培养48h，重复划线分离3代，得到纯化后菌株，进行革兰氏染色以及显微镜观测，挑选出革兰氏染色阳性，显微镜观测呈球状、杆状或多形状的菌株，共筛选出6株符合要求的菌株，编号为NS001-NS006。利用改良MRS液体培养基将这6株菌厌氧扩增培养，得到的菌液使用30%的甘油保存，保存在-80℃的冰箱中。

将筛选出的6株菌的菌液进行离心，发现其中NS003的菌液离心后无法形成结实的沉淀，其菌泥松散，可能原因是NS003产生了较多的胞外多糖。再采用负染色法对这6株菌进行负染色，发现NS003的荚膜染色最厚。

实验以苯酚-硫酸法测定胞外多糖的含量，再辅以比色法测定。结果表1所示，NS003的胞外多糖产量最高，为306 mg/L，远高于其他5种菌株的胞外多糖产量。因此选择NS003进行下一步试验，并将NS003重新标号为NSY0201。

表1：菌株的胞外多糖生成量

2、形态学特征

对菌株NSY0201进行形态学特征观察，结果如图1和图2所示，所述菌株NSY0201是呈革兰氏阳性，菌落为乳白色至淡黄色，圆形或类圆形，直径1-2mm；表面隆起、光滑无光泽，边缘具不规则的波状；菌体为短杆状，两端钝圆，鲜见分叉，表面较光滑，无芽孢。

3、菌株的16S rRNA鉴定

提取菌株NSY0201的DNA作为模板，利用细菌16S rRNA通用引物27F (5’-GAG AGTTTG ATC CTG GCT CAG-3’)和1492R (5’-ACG GAT ACC TTG TTA CGA CTT-3’)进行扩增，扩增片段送至生物公司进行序列测定，测序结果如SEQ ID No.1所示。BLAST比对结果表明，菌株NSY0201与Bifidobacterium animalis的序列相似性为99.79%，因此判断菌株NSY0201为动物双歧杆菌。

将筛选到的菌株NSY0201进行菌种保藏，所述动物双歧杆菌NSY0201的保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2021年5月31日；动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis的保藏编号为CTCC M 2021629。

实施例2：动物双歧杆菌NSY0201的生理生化性质

将保存的动物双歧杆菌NSY0201活化后，以3%的接种量接种到改良MRS培养基中，37℃培养16h，连续培养3代扩大培养，得到的发酵液（图3）用来进行各项生理生化特征的实验。其中，改良MRS培养基的配方为：葡萄糖18克、蛋白胨10克、牛肉浸粉7克、酵母浸粉4克、柠檬酸氢二铵2克、乙酸钠5克、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.58克、硫酸锰0.25克、吐温-80 1.0毫升、L-半胱氨酸盐酸盐0.5克、蒸馏水1000毫升、pH=6.8±0.5。

1、常规的生理生化实验

利用发酵液进行甲基红实验、乙酰甲基甲醇实验、硝酸盐还原实验、精氨酸产氨实验。结果见表2，动物双歧杆菌NSY0201不产硝酸盐还原酶，不能将硝酸盐还原为有害的亚硝酸盐；不能分解精氨酸产生氨气。

表2：常规生理生化实验结果

2、碳水化合物代谢

利用发酵液对多种碳水化合物进行代谢检测。结果见表3，动物双歧杆菌NSY0201可以利用所列的16种碳源的中15种，唯一不能利用的就是甘露醇，因此该菌的生长条件广泛。

表3：碳水化合物代谢结果

3、菌株生长曲线的测定

将保存的动物双歧杆菌NSY0201活化后，以3%的接种量接种到改良MRS培养基中，37℃厌氧培养，每隔2h取样，于波长600nm处测定不同培养时间菌株发酵液OD值。

结果如表4所示，动物双歧杆菌NSY0201在培养至6-16h进入对数生长期末期，16-20h为生长稳定期。

表4：生长曲线OD值

4、胃液耐受性实验

在pH值分别为2.0、2.5、3.0的灭菌PBS中，以过滤除菌法加入3.0g/L胃蛋白酶，制成人工胃液；将100 µL发酵液加入900 µL模拟胃液中，在37℃厌氧条件下放置0.5h、1.0h、1.5h；实验对照为100 µL菌悬液中加入900 µL无菌生理盐水。取样稀释涂平板，进行活菌计数，计算存活率。

结果见表5，动物双歧杆菌NSY0201能够耐强的酸性，因此其对胃液具有较好的耐受性，适合在胃中生存定植。

表5：胃液耐受性实验结果

5、胆盐耐受实验

在MRS液体培养基中添加3.0g/L牛胆盐和2.0g/L琉基乙酸钠。将动物双歧杆菌NSY0201接种到含有胆盐的MRS液体培养基中37℃厌氧培养，对照组为MRS液体培养基。取样稀释涂平板，进行活菌计数，计算存活率。

结果见表6，动物双歧杆菌NSY0201对胆盐具有较好的耐受，因此其能够在胆肠中定植存活。

表6：胆盐耐受实验结果

实施例3：动物双歧杆菌NSY0201冻干粉的制备

将保存的动物双歧杆菌NSY0201在改良MRS固体平板上划线，37℃培养活化，然后挑取单菌落接种于改良MRS液体培养基中，37℃培养16 h，再以3%的接种量再接种至改良MRS培养基，37℃培养16h，再连续培养2代扩大培养；得到的发酵液在4℃下，12000r/min，离心10 min，弃上清液，收集菌泥，使用超纯水洗涤3次后，将菌泥与冻干保护剂（配方为30g海藻糖，10g脱脂乳粉，7g菊粉、0.5g低聚异麦芽糖，0.2g甘氨酸，1g吐温80，1000mL纯水）以1:1.7的质量比混合，充分乳化后，经真空冷冻干燥可以得到动物双歧杆菌NSY0201的冻干活菌粉。对冻干活菌粉进行倾注计数，菌粉真空保存在-18℃的冰箱中以备后用。动物双歧杆菌NSY0201冻干活菌粉的菌含量为4×10¹¹ CFU/g。

实施例4：动物双歧杆菌NSY0201增强免疫力功能实验研究

1、分组及剂量选择

昆明种小鼠200只，购买后进行适应性饲养一周后，分为4个组：空白对照、0.2 g、1.0g与5.0g剂量组，每组50只，分别进行灌胃。其中，空白对照组的小鼠用0.2 mL蒸馏水进行灌胃；剂量组先将0.2g、1.0g、5.0g的实施例3制备得到的动物双歧杆菌NSY0201冻干粉使用100g超纯水稀释，然后取与蒸馏水等量的稀释液对小鼠进行灌胃。

2、具体研究方法和结果

按剂量各组每天灌胃一次，连续30d后分别进行各项免疫指标测定。

（1）小鼠迟发性变态反应（DTH）测定

迟发性变态反应试验——耳肿胀程度。灌胃第26d将每只鼠腹部用脱毛膏脱毛约4cm ×4 cm，用50μL DNFB溶液均匀涂抹到脱毛处致敏，5 d后用 10 μL DNFB溶液均匀涂抹于小鼠右耳两侧，24 h后处死小鼠剪下左右耳壳，用打孔器取下直径 6 mm 的圆片并称重，计算左右耳重量差异。

结果见表7，在DNFB诱导DTH实验中，0.2g剂量组、1.0g剂量组和5.0g剂量组的左右耳重量差异均显著高于空白对照组（P＜0.05），说明DNFB处理后小鼠出现了DTH，而各剂量组的实验结果呈阳性。迟发型变态反应属细胞免疫，是由特异性致敏效应T细胞介导的一种超敏反应，阳性结果也说明动物双歧杆菌NSY0201能够抑制或缓解DNFB诱导产生的DTH，提高小鼠的机体免疫力。

表7：DTH测定结果

（2）刀豆素A（Con A）诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法)

灌胃第26天对各组小鼠无菌取脾，制备脾淋巴细胞悬液，用RPMI 1640完全培养液调整脾细胞浓度为3×10⁶ CFU/mL，按照程序中MTT法进行脾淋巴细胞增殖反应，其中一部分细胞使用Con A诱导（Con A⁺），以未诱导的细胞作为对照（Con A^-），最后在波长570nm 处测其吸光度值(A)，计算Con A⁺与 Con A^-各孔的吸光值差。各剂量组结果与溶剂对照组比较进行方差分析。

结果见表8，Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验中，各剂量组的加Con A 孔与不加Con A孔的吸光值差值均高于空白对照组（P＜0.05），证明动物双歧杆菌NSY0201能够加快淋巴细胞的增殖。

表8：Con A诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验结果

（3）血清溶血素测定

于灌胃第25天给小鼠腹腔注射20% SRBC (0.2ml/只)，于免疫后第5天对小鼠进行摘眼球采血，分离血清后，并在微量血凝板上进行血清溶血素测定：37℃孵育3h，统计血球凝集度，计算相应抗体积数。

结果见表9，各剂量组小鼠的半数溶血值HC₅₀显著高于空白对照组（P＜0.01），证明动物双歧杆菌NSY0201能够提高小鼠体内血清溶血素的含量，进而可以提高单核吞噬系统功能，即提高小鼠的抗病能力。

表9：血清溶血素测定结果

（4）抗体生成细胞(PFC)检测

灌胃第25天给小鼠腹腔注射20% SRBC (0.2ml/只)，于免疫后第5天处死，解剖取脾制备脾细胞悬液，用RPMI 1640完全培养液调整脾细胞浓度为3×10⁶ CFU/mL，按程序方法制备琼脂糖玻片，在CO₂培养箱(37℃、5% CO₂)中温育1.5h 后加补体，再温育1.5h，计数每张琼脂薄层玻片上形成的溶血空斑数。

结果见表10，抗体生成细胞检测实验发现，各剂量组小鼠相同数量的脾细胞造成的溶血空斑数高于空白对照组小鼠（P＜0.05），说明动物双歧杆菌NSY0201显著增强B淋巴细胞产生相应抗体的功能，即增强机体体液免疫应答功能。

表10：PFC检测结果

（5）小鼠碳廓清实验

按顺序给各组小鼠尾静脉注射印度墨汁(4倍稀释) 0.1ml/10g。每鼠均于注射墨汁后2min及10min 分别准时内毗采血20μl，并迅速加人到2ml 0.1%碳酸钠溶液中并摇匀，以紫外可见分光光度计600nm波长处测吸光度值(A)；同时取小鼠肝、脾称重，按公式计算吞噬指数。各剂量组结果与溶剂对照组比较进行方差分析。

结果见表11，碳廓清实验发现，各剂量组小鼠的吞噬指数均高于空白对照组小鼠（P＜0.05），说明动物双歧杆菌NSY0201能够提高巨噬细胞吞噬碳粒的能力和速度，进而提高机体的免疫功能。

表11：小鼠碳廓清实验吞噬指数的结果

（6）NK细胞活性测定

小鼠眼球取血后立即将血液4000 r/min离心10 min得到血清，并按乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒的测定方法进行NK细胞活性的测定。

结果见表12，NK细胞活性测定发现，各剂量组小鼠的NK细胞活性均高于空白对照组小鼠（P＜0.05），由此表明动物乳杆菌NSY0201能够对小鼠的NK细胞活性有明显的提升，继而能够提高身体的整体免疫力。

表12：NK细胞活性测定结构

综上所述，通过上述的动物实验，能够证明本发明的动物双歧杆菌NSY0201及其冻干粉通过增加DNFB诱导的DTH左右耳重量差、提高小鼠体内血清溶血素水平、溶血空斑数、吞噬指数和NK细胞活性以及加快淋巴细胞的增殖能力，来达到抑制或缓解DNFB诱导产生的DTH，提高单核吞噬系统功能、提高抗体生成能力等作用，最终起到增强机体的免疫功能和抗病能力。同时，根据上述实验也能发现中高剂量，即1.0g和5.0g的作用效果比0.2g的低剂量更好，且1.0g和5.0g剂量之间的差距并不是很大。因此，根据《保健食品功能学评价程序和检测方法》：在细胞免疫功能、体液免疫功能、巨噬细胞功能、NK 细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用，由此能够判定动物双歧杆菌NSY0201及其冻干粉具有提高动物机体免疫力的功效。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛诺森生物技术有限责任公司

<120> 一株动物双歧杆菌NSY0201及其在用于制备增强机体免疫力的保健品或药品中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1462

<212> DNA

<213> 动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)

<400> 1

gatgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac gggatccctg gcagcttgct 60

gtcggggtga gagtggcgaa cgggtgagta atgcgtgacc aacctgccct gtgcaccgga 120

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