一株耐镉促生嗜油不动杆菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物
技术领域
，具体涉及嗜油不动杆菌菌株MRP20及其应用。背景技术
镉不是植物生长发育所必需的元素。当其体内含量超过某一浓度时，植物就会受到严重的危害，如植株萎蔫发黄、长势较弱等症状。植物根系很容易吸收镉，继而向地上部转运，这样就会使植物中毒，影响营养元素的吸收，进而抑制植物生长。镉也会破坏根结构，从而影响植物养分的吸收。
磷是植物最重要的必需营养元素之一，是植物细胞分裂、能量生成、大分子生物合成、膜完整性、信号转导和光合作用等关键代谢过程所必需的常量营养元素。它还在植物的呼吸作用和豆科作物的固氮作用中发挥作用。虽然土壤中含有大量磷化合物，然而植物能真正利用的可溶性磷却非常少。因为土壤中的大部分的磷以难溶态形式存在，而只有磷酸盐形式的磷源能被植物吸收。
微生物和植物紧密相关，微生物或正面或负面的影响植物的生长发育。受植物根系分泌物的影响，土壤中的微生物与植物根际及根系建立稳定的共生关系，有一些细菌能够侵染植物根系，定殖到植株内部。中国发明专利，CN104974962A，公开了一株乙酸钙不动杆菌，该菌株能够有效降低溶液pH并溶解溶液中难溶性磷，促进番茄和茄子植株生长。但该菌株不耐镉，不能解决植物受镉毒胁迫的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一株新的嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)菌株MRP20，该菌株与植物共生，能解决植物低磷胁迫和镉毒胁迫的技术问题。该菌株具有分泌生长素、耐酸、耐镉、溶磷和产铁载体的特性。大豆接种该嗜油不动杆菌能提高大豆的生物量(干重)、显著提高叶绿素SPAD值和磷含量、促进大豆根生长；而且能克服镉对大豆生长抑制的作用，尤其是克服镉对大豆根系生长的抑制作用。
本发明的目的是提供一株嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)菌株MRP20。
本发明的另一目的是提供嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)菌株MRP20在培育耐镉毒植物方面的应用。
本发明的另一目的是提供嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)菌株MRP20在减弱镉抑制植物生长方面的应用。
本发明的另一目的是提供嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)菌株MRP20在促进植物叶片合成叶绿素方面的应用。
本发明的另一目的是提供嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)菌株MRP20在促进植物吸收磷方面的应用。
本发明的另一目的是嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)菌株MRP20在制备适用于植物的生长促进剂、抗镉毒微生物农药、叶绿素生物合成促进剂或促磷吸收菌剂方面的应用。
本发明的另一目的是提供嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)菌株MRP20在溶解难溶性磷方面的应用。
本发明的另一目的是提供一种大豆的种植方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
申请人团队从韶关市曲江区北约村的玉米根际，经人工分离纯化获得了一株具有分泌生长素、耐酸、耐镉、溶磷和产铁载体的特性，能显著提高大豆生物量、磷含量、叶片SPAD值，且使大豆耐镉的菌株。该菌株的测序结果由广州睿博生物技术有限公司完成，其16S rDNA的测序结果在NCBI数据库中进行Blast多重序列比对分析，从而确定分离出的菌株为嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)的新菌株，命名为MRP20。2021年5月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61653。
菌株MRP20形态特征如下：MRP20生长最适温度为37摄氏度，在LB平板培养基上，形成近似圆状，光滑，突起，乳白色菌落，光学显微镜下为棒状，革兰氏染色为红色，革兰氏阴性菌。
研究显示，该嗜油不动杆菌菌株MRP20显著促进大豆吸收磷，提高大豆耐镉的能力。因此本发明要求保护：
嗜油不动杆菌菌株MRP20在培育耐镉毒植物方面的应用，尤其是用于培育耐镉毒大豆科植物，克服镉对大豆科植物根系生长的抑制作用。
嗜油不动杆菌菌株MRP20在减弱镉抑制植物生长方面应用，尤其是在镉毒胁迫下促进大豆科植物的生物量提高及其根系生长，或制备能够减弱镉抑制植物生长的产品方面的应用。
嗜油不动杆菌菌株MRP20在促进植物叶片合成叶绿素方面的应用，或制备能够促进植物叶片合成叶绿素的产品方面的应用，尤其是大豆科植物叶片的叶绿素。
嗜油不动杆菌菌株MRP20在促进植物吸收磷方面的应用，尤其是促进大豆科植物吸收磷，或制备能够促进植物吸收磷的产品方面的应用。
嗜油不动杆菌菌株MRP20在溶解难溶性磷方面的应用，其中，优选所述的难溶性磷为Ca3(PO4)2。
嗜油不动杆菌菌株MRP20在制备适用于植物的生长促进剂、抗镉毒微生物农药、叶绿素生物合成促进剂或促磷吸收菌剂方面的应用。
其中，优选地，所述植物为大豆科植物。
一种大豆的种植方法，利用权利要求1所述的嗜油不动杆菌菌株MRP20的菌悬液浇灌处理大豆苗；
具体优选地，所述处理的方式为浇灌；
更优选地，具体包括如下步骤：大豆种子育苗后，在栽培介质中浇灌权利要求1所述的嗜油不动杆菌菌株MRP20的菌悬液，然后在移苗后1、3、5天各浇灌一次；其中优选地，每次浇灌的量为80～120mL/颗苗；优选地，所述的菌悬液OD600为0.6～1.0。
其中，作为一种可选择的实施方案，所述的菌悬液的分散介质为大豆营养液，其配方如下：2.5mM KNO3，2.5mM Ca(NO3)2·4H2O，0.08mM Fe-Na-EDTA，0.25mM K2SO4，1mMMgSO4·7H2O，4.5×10-3mM MnCl2·4H2O，0.3×10-3mM ZnSO4·7H2O，0.16×10-3mM CuSO4·5H2O，0.16×10-3mM(NH4)6Mo7O24·4H2O，20×10-3mM H3BO3，50×10-3mM KH2PO4。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一株耐镉促生嗜油不动杆菌菌株MRP20，其与植物共生，能够：
(1)促进植物生长，促进植物吸收磷含量，提高其生物量和叶绿素SPAD，尤其适用于大豆科植物。
(2)提高植物的耐镉毒能力，克服镉对植物的生长抑制作用，尤其是克服镉对大豆的生长抑制作用。
(3)该菌株具有分泌生长素、耐酸、耐隔、溶磷和产铁载体的特性。
附图说明
图1显示嗜油不动杆菌菌株MRP20的溶磷圈。
图2显示嗜油不动杆菌菌株MRP20在不同色氨酸浓度下产生IAA。
图3显示嗜油不动杆菌菌株MRP20产生IAA的定量图，图中字母a、b代表方差分析后各样本平均数间是否有显著差异，组间字母相同代表组间差异不显著(P>0.05)，字母不相同代表组间差异显著(P<0.05)。
图4显示嗜油不动杆菌菌株MRP20的耐镉曲线(OD600-镉浓度)，图中字母组合a、ab代表方差分析后各样本平均数间是否有显著差异，组间字母相同代表组间差异不显著(P>0.05)，组间字母不相同代表组间差异显著(P<0.05)。
图5显示嗜油不动杆菌菌株MRP20的耐酸曲线(OD600-pH)，图中字母组合a、ab和b代表方差分析后各样本平均数间是否有显著差异，组间字母相同代表组间差异不显著(P>0.05)，组间字母不相同代表组间差异显著(P<0.05)。
图6显示嗜油不动杆菌菌株MRP20的发育进化树。
图7显示接种嗜油不动杆菌菌株MRP20的大豆在镉毒胁迫下，其植株干重(A)和SPAD值(B)的变化。
图8显示接种嗜油不动杆菌菌株MRP20的大豆在镉毒胁迫下，其根长(A)、根表面积(B)、根直径(C)和根体积(D)的变化。
图9显示接种嗜油不动杆菌菌株MRP20的大豆在镉毒胁迫下，其地上部镉浓度(A)和根部镉浓度(B)。
图10显示接种嗜油不动杆菌菌株MRP20的大豆在镉毒胁迫下，其地上部磷含量(A)和根部磷含量(B)的变化。
图中*:0.01<P<0.05，**:0.001<P<0.01，***:P<0.001。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1：菌株的分离纯化
1.菌株的分离及纯化
在韶关市曲江区北约村，从镉污染土上种植的玉米(正甜68)的玉米根际分离菌株。分别剪取5g玉米根，用小刷子刷去表层土壤，无菌水漂洗多次至无附着土后，置于盛有100mL灭菌水的250mL编号序号的三角形瓶中，180r/min，37℃摇床，摇30min。锥形瓶内添加10-20颗玻璃珠帮助打碎土壤，使细菌能够从土壤中释放出来，震荡结束后，将土壤悬液静置10min，得到土壤悬浮液，取上清液，进行10倍系列梯度浓度稀释，稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，然后吸取稀释液0.1mL涂布于LB平板，每个浓度梯度三次重复，37℃条件下倒置培养，观察菌落生长情况，挑取不同表型的单克隆，给每种菌落在培养基背面编号，并记录菌落形态和长出菌落的时间，每种类型挑取单克隆到1.5mL离心管中摇菌，在180r/min，37℃条件下培养，再经LB固体培养基划线纯化3-4次后(直至显微镜下菌落形态一致，说明已纯化完成)，加入浓度为25％灭菌甘油于-80℃保藏待用。
结果在玉米根际离到55株菌株，编号MRP1～55，此为分离纯化出来的待测菌株。
实施例2：菌株筛选
2.1溶磷菌的初筛
将筛选出的菌株接种于PKO固体培养基上，每个平板点接三次，28℃培养箱培养，在第7d测量菌株溶磷圈外直径(D)和菌落直径(d)的大小并拍照，有溶磷圈的即能够溶磷。然后比较(D/d)的比值，对菌株的溶磷能力进行判断。
吸取1mL具溶磷圈的菌株的菌液，接种于20mL LB液体培养基中(50mL的离心管)，24h培养后，测定OD600为1.0左右，取1mL菌重悬液接种于20mL PKO液体培养基中(50mL的离心管)，每个菌株三次重复，CK对照组为接种等量的无菌水，放置在28℃，180r/min摇床中培养。在第7d测定PKO液体培养基的pH值，并吸取1mL上清液(1200r/min，离心5min)到25mL容量瓶待测，吸取5mL钼锑抗显色液，用二级水定容至25mL，反应30min后，使用酶标仪测定880nm处的吸光度值(为了去除培养基颜色的影响，应用880nm测定，通过换算公式，得出在标准曲线(y＝0.4833x+0.0002(R2＝0.9997)。换算得到相应的磷浓度(mg/L)。
结果：发现菌株MRP20的溶磷圈比值大于1.5(图1和表1)。在溶磷定量试验中，菌株MRP20表现出较强的溶磷能力，可溶解到22.61±0.58的磷。
表1
菌株编号
D(cm)
d(cm)
D/d
溶解磷浓度(mg/mL)
MRP20
1.58
0.92
1.73
22.61±0.58
2.2分泌IAA的筛选
配制含L-色氨酸浓度分别为0、100、200、500mg/L LB液体培养基，将筛选出的菌株接种于液体培养基中，每个菌株三次重复(以不接菌的相同培养基作为空白对照)，在28℃，180r/min下培养2d，每个重复取200μL上清液，加入200μL的Salkowski显色液到96孔酶标板中，并以加入未接菌相同液体培养基与200μL的Salkowski显色液为对照，室温避光放置20min后，使用酶标仪在530nm下测其波长。在标准曲线上查出相应的IAA产量。IAA产量单位为mg/mL。
定性结果显示(图2)，菌株MRP20具有产IAA能力，但比较弱。MRP20表明在0-500mg/L的色氨酸浓度范围内，菌株IAA的释放能力是随着色氨酸浓度的提高而增强的(图3)。
2.3产铁载体能力的筛选
吸取1mL待测菌株的菌悬液，接种于MKB液体培养基中。在28℃，180r/min下培养48h。培养液离心10min(1200r/min)，取200μL上清液(参比值(Ar)为测定时加入200μL未接种的MKB液体培养基)，按照1:1的比例与CAS检测液混合。常温反应1h后，酶标仪测定630nm下波长OD值(A)。实验中，若不产铁载体，则CAS液体培养基和对照一样呈蓝色，若菌株产铁载体，则CAS液体培养基变化为橘黄色。以A/Ar的比值表示样品中铁载体的相对含量，值越小，则表示菌株产铁载体的能力越强，以(Ar-A)/Ar的比值表示样品中铁载体的活性单位，活性单位越高，产铁载体能力越强。
结果发现，MRP20菌株在MRP1～55菌株中产铁载体的活性单位最高，达到58.30±11.29％。
2.4耐镉能力筛选
分别配制镉浓度为0、4、8、12、16、20mg/L的6个LB液体培养基，121℃，20min灭菌。准备2个96孔灭菌细胞培养板，吸取配制好的不同镉浓度的LB液体培养基各200μL到培养板。待测菌株活化培养24h后，每个菌株吸取5μL到不同镉浓度值的培养孔中，每个菌株4次重复，37℃，180r/min下培养48h，测定菌液在600nm下的吸光值。
结果：在0-20mg/L Cd浓度条件下，MRP20的生长速度几乎不变，耐镉性极强(图4)。
2.5耐酸能力筛选
分别配制pH至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的6个LB培养基，121℃，20min灭菌。准备2个96孔灭菌细胞培养板，吸取配制好的不同pH的LB液体培养基各200μL到培养板。待测菌株活化培养24h后，每个菌株吸取5μL到不同pH值的培养孔中，每个菌株4次重复，37℃，180r/min下培养48h，测定菌液在600nm下的吸光值。
菌株MRP20在pH为5.5-7.0之间生长速度最快(图5)，说明这该菌株在弱酸性条件下也能够生长的很好。
实施例3菌株鉴定
经过多方面综合考虑，对筛选的菌株MRP20进行鉴定。
3.1菌株的形态学鉴定
将菌株MRP20接种在LB固体培养基上进行培养，并观察记录。在最适生长条件(pH7.0，温度37℃)培养5～7天后，将分离并纯化得到的菌株MRP20进行单菌落状态观察，主要包括菌落的大小、颜色、菌落表面状态和菌落边缘状态等。另一方面，对处于对数生长期的菌株MRP20，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
在LB平板培养基上，形成近似圆状，光滑，突起，乳白色菌落，光学显微镜下为棒状，革兰氏染色为红色，革兰氏阴性菌。
3.2分子鉴定
经过多方面筛选和综合考虑，筛选菌株MRP20进行鉴定并继续研究。将菌株接种于LB培养基中37℃，180r/min培养24小时后，采用细菌总DNA提取试剂盒提取菌株的总DNA，送生物公司进行测序，将得到的菌株序列在NCBI数据库进行Blast序列比对分析，使用MEGA7.0构建系统发育进化树(图6)。
根据测序结果显示MRP20为嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)，其16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示；并将该嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)菌株MRP20于2021年5月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61653。
实施例4嗜油不动杆菌MRP20的回接大豆试验
4.1回接试验
本研究采用基质土盆栽试验。实验设置三种镉浓度组，分别为0、10、20mg/kgCdCl2·5/2H2O，接种嗜油不动杆菌MRP20，且每盆均为低磷处理，每个处理4个重复，具体如下。
基质和蛭石的混合基质处理方法：称取无肥基质和蛭石按照3：1混合(0.5kg混合土＝0.125kg蛭石+0.375kg基质)，121℃灭菌40min，间隔24h后重复一次灭菌，放置一周后备用。取容量2L的花盆，用10％的次氯酸钠浸泡过夜后用清水充分冲洗数次，风干备用。称取定量氯化镉溶于水，配制0、10、20mg/kg的溶液，量取一定体积倒入混合基质中，同时每盆(0.5kg)混入125mg Ca3(PO4)2(相当于纯磷50mg/kg)，每盆称取混匀，静置一周待用。
种子用盐酸-次氯酸钠产生氯气灭菌4h，用粗砂：中砂＝1：2的混合砂来育苗，育苗一周后，挑选生长基本一致的大豆植株(巴西10)，每盆移栽一株。移苗后1、3、5天浇灌菌悬液，一次100mL，合计3次。
菌悬营养液的配制：菌株接种于装有250mL LB培养液，在37℃摇床中，180r/min振荡培养18h左右，待菌液浑浊测定OD在0.6到1.0之间，离心收集菌体用低磷营养液重悬，用灭菌枪头拨开幼苗根部表面基质。将菌重悬营养液倒入根部，菌体随营养液浇灌到基质中。
其中所述的低磷营养液的配方为:2.5mM KNO3，2.5mM Ca(NO3)2·4H2O，0.08mMFe-Na-EDTA，0.25mM K2SO4，1mM MgSO4·7H2O，4.5×10-3mM MnCl2·4H2O，0.3×10-3mMZnSO4·7H2O，0.16×10-3mM CuSO4·5H2O，0.16×10-3mM(NH4)6Mo7O24·4H2O，20×10-3mMH3BO3，50×10-3mM KH2PO4。
4.2指标检测
培养大豆30天后收获。在光照充足的条件下用SPAD仪测量植株倒三叶不同部位的SPAD值后取平均值。自来水冲洗干净后先放到冷库，一周内及时进行扫描。用台式扫描仪(Epson1460XL)扫描根系，根系尽量平展铺开，使其不重叠，根系过大的可剪开扫描，不影响其扫描结果，盖上蓝色遮光板，扫描完成后，经过根系分析软件WinRHIZO(RegentInstruments Inc.,加拿大)分析各个样品根的根系性状，
将作物地上部和根部分开，称取地上部和根部鲜重，地上部分放入105℃烘箱杀青30min后，在烘箱烘干后，取出在室温下放置10min冷却后称量干重。根部先用根系扫描仪进行扫描，并称重，其余部分同样经过杀青后烘干，称干重。
再将大豆根部浸泡在10mmol/L Na2-EDTA溶液中5min以除去表面吸附的Cd2+，然后用二级水水冲洗干净，将根系与茎叶部分开75℃烘干称取干重后测定地上部磷含量和镉浓度；根部放冷库用于扫根，扫完后烘干称重，测定根部磷含量和镉浓度。磷的测定采用紫外分光光度法，镉的测定采用原子吸收分光光度计火焰吸收法。
结果如下：
(1)随着镉浓度的增加，植株干重明显下降，与0Cd相比，不接种处理(CK组)植株生物量在10mg/kg Cd2+和20mg/kg Cd2+条件下(10Cd和20Cd组)，分别减少了31％和55％，接种了菌株MRP20处理的大豆植株干重在10mg/kg Cd2+和20mg/kg Cd2+条件下分别减少了31％和41％。在20mg/kg Cd2+条件下，接种了菌株MRP20的大豆植株干重显著高于不接菌处理的大豆，高出34％。表明接种MRP20能缓解镉毒害(图7A)。
(2)在20mg/kg Cd2+条件下，MRP20接菌处理的大豆叶片SPAD值显著高于CK不接菌处理，高出了20％，表明接种MRP20能促进大豆氮的吸收(图7B)。
(3)在0mg/kg Cd2+条件下，大豆接菌处理总根长显著高于不接菌处理(CK组)，根表面积显著高于不接菌处理(CK组)，表明接种MRP20能显著促进大豆根系的生长(图8)。
(4)数据表明，随着镉浓度的增加，大豆地上部和根部的镉浓度显著增加。0mg/kgCd2+、10mg/kg Cd2+和20mg/kg Cd2+条件下下，对比CK不接菌，接种嗜油不动杆菌MRP20的大豆地上部镉浓度没有显著变化(图9A)，但在20mg/kg Cd2+条件下，对比CK不接菌，接菌后的根部镉浓度下减少了60％(图9B)。
(5)在0mg/kg Cd2+条件下，对比CK不接菌，接种嗜油不动杆菌MRP20处理的大豆，其地上部磷含量提高了145％。表明MRP20有显著的解磷促生作用(图10)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
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<130> YGZS214949
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<400> 1
tgcagtcgag cggagagagg tagcttgcta ctgatcttag cggcggacgg gtgagtaatg 60
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