一种复合高温菌剂及其在塑料降解中的应用
技术领域
本发明属于环境净化领域，具体涉及一种复合高温菌剂及其在塑料降解中的应用。
背景技术
微塑料(MPs)是指尺寸小于5mm的塑料颗粒，是现今分布广泛的新型污染物。MPs粒径小、数量多，且多含有毒添加剂，使其在环境中容易被生物误食或吸收从而造成生理损伤，而且还容易吸附其他污染物，形成污染物复合体，在环境中迁移，并通过食物链危害人类健康。MPs主要存在于生活垃圾、粪便和城市污泥等有机固废中。据调查发现，城市污泥中的微塑料浓度可达到1.6～5.6×104个每千克污泥(干重)，每年约有4.4～43万吨MPs会随着有机固废填埋、土地利用或其他垃圾处理工序进入土壤环境中，从而改变土壤物理化学性质，破坏土壤功能及生物多样性，引发生态和食物链风险。
堆肥能够促进有机质的腐殖化，是有机固废资源化的重要手段，也是防止有机固废中污染物进入土壤等环境的一道重要“屏障”。堆肥的实质是利用微生物驱动的有机物腐殖质化和污染物降解，并产生热能的过程，在相关文件中，堆肥能够有效去除有机固废中的五氯苯酚、消除抗生素和抗性基因，具有极好的环境净化作用。然而，由于MPs多为疏水性强的高分子聚合物，大多数微生物在自然环境中对其降解率低，导致实际堆肥过程中无法去除微塑料。
因此，开发一种能够提高有机固废堆肥过程微塑料的去除效率的菌剂对于微塑料污染的防控和土壤生态环境保护具有重要的实践意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种复合高温菌剂及其在塑料降解中的应用。本发明中的复合高温菌剂含有嗜热铁还原菌和铁矿物，嗜热铁还原菌会利用堆肥中有机固体废弃物的营养物质进行生长繁殖，并在堆肥好氧-缺氧反应动态变化过程中驱动铁氧化还原循环，利用铁矿物产生大量的·OH(羟基自由基)，破坏堆肥中的微塑料材料表面疏水性，促进堆肥中微塑料的氧化降解，实现堆肥微塑料的高效去除。
本发明中的第一个方面，提供一种复合高温菌剂，该复合高温菌剂含有铁还原菌和铁矿物。
羟基自由基(·OH)是环境中常见的瞬态自由基，也是氧化性最强的活性氧自由基(ROS)，对驱动环境中污染物的转化起着不可忽视的作用。由于环境中的Fe(II)矿物和还原性有机物受到扰动时可与O2反应，经芬顿和Haber-Weiss等途径会产生大量·OH。这些·OH能促使MPs发生化学键断裂，并深度矿化为水和二氧化碳。在好氧-厌氧交替环境中，铁还原菌驱动的铁氧化还原循环可促进环境中·OH持续产生，实现环境污染物的有效去除。相关技术中，微生物-铁氧化还原循环产·OH体系都只能在常温条件(温度<40℃)下进行，难以适用于堆肥等高温环境中。对于本发明，不仅能利用有机固体废弃物的高温堆肥为微生物生长提供所需要的营养物质，而且还能够借由堆肥过程中传质不均使到达堆肥颗粒核心的氧极低，在堆肥颗粒中形成微生物驱动铁氧化还原循环反应所需的好氧-缺氧反应界面，并随着堆肥温度、含水率、曝气量、翻堆等变化，好氧-缺氧反应界面呈动态变化，从而可以得到一种便于控制的、可适用于高温堆肥的微生物-铁矿物介导的塑料降解体系。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述铁还原菌为嗜热铁还原菌。
在本发明的一些优选实施方式中，所述铁还原菌为兼性好氧菌。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述嗜热铁还原菌包括Bacillus composti和Bacillus thermophilus中的至少一种。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述嗜热铁还原菌为Bacillus compostiSgZ-9和Bacillus thermophilus SgZ-10中的至少一种
当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理选择其他嗜热铁还原菌模式菌株进行合理替换，本发明中的嗜热铁还原菌包括但不限定于Bacillus composti SgZ-9和Bacillus thermophilus SgZ-10。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述铁矿物包括赤铁矿、纤铁矿、水铁矿和针铁矿中的至少一种。
赤铁矿(Hematite)化学成分为Fe2O3、属六方晶系的氧化物矿物；纤铁矿的化学组成为γ-FeO(OH)，含三氧化二铁89.9％，晶体属斜方晶系并结晶成γ相的氢氧化物矿物；水铁矿是一种弱结晶的铁氢氧化物，通常水铁矿是Fe3+水解过程中最先出现的沉淀物；针铁矿是一种分布广泛的矿物，作为一种水合铁氧化物，化学组成为α-FeO(OH)。当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理选择其他铁矿物进行合理替换，本发明中的铁矿物包括但不限于赤铁矿、纤铁矿、水铁矿和针铁矿。
在本发明的一些优选实施方式中，所述铁矿物在复合高温菌剂中的质量比为2％～10％。
当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理调整铁矿物在复合高温菌剂中的质量比，使其获得更好的使用效果。
在本发明的一些优选实施方式中，用于培养所述铁还原菌的发酵培养基成分包括培养基营养成分和调理剂。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述培养基营养成分包括但不限于磷酸二氢钠、氯化铵、氯化钾、酵母提取物、葡萄糖。
所述调理剂包括但不限于豆饼粉。
在本发明的一些更优选实施方式中，复合高温菌剂中的嗜热铁还原菌的厌氧发酵培养基配方为：将0.6g/L磷酸二氢钠、0.25g/L氯化铵、0.1g/L氯化钾、0.2g/L酵母提取物、0.5g/L葡萄糖混合，加入2～6％(质量比)铁矿物，调节pH至7.0～7.5进行发酵。发酵完成后加入3～6％(质量比)的豆饼粉。
在本发明的一些优选实施方式中，所述复合高温菌剂中铁还原菌的菌含量为106～109cfu/g。
本发明中的复合高温菌剂能够在有氧条件下，其含有的兼性好氧嗜热铁还原菌通过能够直接利用城市污泥、畜禽粪便、农业残余物、餐厨垃圾等有机固体废弃物中的营养物质进行生长和繁殖，将复合高温菌剂中的铁矿物的Fe(II)氧化成Fe(III)，并产生·OH，破坏塑料材料表面疏水性，促进堆肥中微塑料的氧化降解。在缺氧条件下，嗜热铁还原菌将Fe(III)被还原成Fe(II)，完成铁氧化还原循环。因此，可以配合堆肥过程中的曝气、翻堆等堆肥工艺，改变堆肥过程好氧-缺氧区域的动态变化，推动堆肥中铁氧化还原循环产·OH的持续进行，从而实现堆肥微塑料的进一步高效去除。
本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的复合高温菌剂的制备方法，包括如下步骤：
将嗜热铁还原菌接种至培养基上，在45～50℃厌氧发酵48～96小时，发酵结束后，加入3～6％的调理剂，即得。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述制备方法还包括在加入调理剂后调整含水率为45％～55％。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述制备方法具体为：
制备嗜热铁还原菌种子液；
制备嗜热铁还原菌的厌氧发酵培养基；
将嗜热铁还原菌种子液按约1.5％(体积比)的接种量接种至厌氧发酵培养基中，在45～50℃厌氧发酵48～96小时，发酵结束后，加入3～6％的调理剂，搅拌均匀后，调整含水率，使其含水率在45％～55％，即得。
调整含水率可采用板框压滤的方式，当然，本领域技术人员可根据实际使用需求，采用其他常规含水率调整方式。
本发明的第三个方面，提供一种堆肥降解微塑料的方法，包括如下步骤：
将本发明第一个方面所述的复合高温菌剂与有机固废混合发酵。
发明人发现，在堆肥开始发酵处于高温期(大于65℃)时，羟基自由基开始大量产生。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述复合高温菌剂与有机固废的混合质量比为(1～5)：(95～99)。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述有机固废包括含有塑料的城市污泥、畜禽粪便、农业残余物、餐厨垃圾。
本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述的复合高温菌剂在高温堆肥中的应用。
本发明中的复合高温菌剂在有氧条件下，可通过微生物作用消耗城市污泥、畜禽粪便、农业残余物、餐厨垃圾等废弃物中的营养物质进行生长和繁殖，使其得到有效分解，减少废弃物对环境的危害。
本发明的第五个方面，提供本发明第一个方面所述的复合高温菌剂在塑料降解中的应用。
本发明中的复合高温菌剂能够在有氧条件下，其含有的兼性好氧嗜热铁还原菌通过能够直接利用城市污泥、畜禽粪便、农业残余物、餐厨垃圾等有机固体废弃物中的营养物质进行生长和繁殖，将复合高温菌剂中的铁矿物的Fe(II)氧化成Fe(III)，产生·OH，破坏塑料材料表面疏水性，促进堆肥中微塑料的氧化降解。在缺氧条件下，嗜热铁还原菌将Fe(III)被还原成Fe(II)，完成铁氧化还原循环。因此，可以配合堆肥过程中的曝气、翻堆等堆肥工艺，改变堆肥过程好氧-缺氧区域的动态变化，推动堆肥中铁氧化还原循环产·OH的持续进行，从而实现堆肥微塑料的进一步高效去除。
本发明的有益效果是：
1.本发明中的复合高温菌剂能够在有氧条件下，利用有机固体废弃物中的营养物质进行微生物定殖生长，并利用铁矿物产生·OH，破坏塑料材料表面疏水性，促进堆肥中微塑料的氧化降解。
2.本发明中的复合高温菌剂可以配合堆肥过程中的曝气、翻堆等堆肥工艺，改变堆肥过程好氧-缺氧区域的动态变化，推动堆肥中铁氧化还原循环产·OH的持续进行，从而实现堆肥微塑料的进一步高效去除。
3.本发明中的复合高温菌剂能够克服相关技术中无法实现高温环境下发生微生物-铁氧化还原循环产·OH的问题，从而能够有效扩宽微生物-铁氧化还原循环的应用范围，为环境污染治理及塑料降解工艺的开发提供更多的理论支持。
附图说明
图1为本发明实施例中的添加了复合高温菌剂的实验组和对照组在堆肥中羟基自由基含量变化差异曲线；
图2为本发明实施例中的添加了复合高温菌剂的实验组、对照组堆肥中微塑料的含量变化图；
图3为本发明实施例中的添加了复合高温菌剂的实验组在鸡粪堆肥中羟基自由基含量变化差异曲线；
图4为本发明实施例中的复合高温菌剂堆肥处理后聚苯乙烯微塑料片的分子质量变化图；
图5为本发明实施例中的堆肥处理后聚苯乙烯微塑料片的表面基团变化图，其中，A为碳氧元素的变化情况，B为碳碳键、碳氧单键、碳氧双键的变化情况；
图6为本发明实施例中的堆肥处理后聚苯乙烯微塑料片的表面形貌变化，其中，A为对照组，B为实验组。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
实验材料
下述实施例中所用菌株信息如表1所示。
表1实验所用菌株信息
菌株名称
菌株保藏号
Bacillus composti SgZ-9
CCTCC AB2012109
Bacillus thermophilus SgZ-10
CCTCC AB2012110
下述实施例中的LB培养基的组分为：胰蛋白胨10.0g/L、酵母提取物(酵母粉，购自阿拉丁)5.0g/L、NaCl 10.0g/L，调节pH＝7.0，在0.15MPa、121℃条件下灭菌30min。
实施例1复合高温菌剂的制备
制备方法如下：
(1)制备种子液：
按2％接种量将浓度为108cfu/mL的Bacillus composti SgZ-9菌液接种到装有LB培养基的容器中，50℃条件下发酵48小时，发酵过程中需通入空气，通气量为20-100m3/h，并以180-220转/分钟的速度持续搅拌，发酵完成即得Bacillus composti SgZ-9种子液。
(2)制备厌氧发酵培养基：
将0.6g/L磷酸二氢钠、0.25g/L氯化铵、0.1g/L氯化钾、0.2g/L酵母提取物(酵母粉，购自阿拉丁)、0.5g/L葡萄糖混合，加入3％(质量比)水铁矿，调节pH至7.0，搅拌均匀。向培养基内通入氮气/二氧化碳混合气，100℃灭菌45分钟，冷却至80℃备用。
(3)将步骤(1)制备得到的Bacillus composti SgZ-9种子液按1.5％接种量(体积比)接种至步骤(2)制备得到的厌氧发酵培养基上，50℃厌氧发酵72小时。发酵结束后，加入4％(质量比)的豆饼粉作为调理剂，搅拌均匀后，通过板框压滤，使复合高温菌剂的最终含水率在45％～55％。
对制备得到的复合高温菌剂进行平板计数和试管检测，发现在制备得到的复合高温菌剂中，Bacillus composti SgZ-9的菌量约为1.4×108cfu/g。
实施例2复合高温菌剂的制备
制备方法如下：
(1)制备种子液：
按2％接种量将浓度为108cfu/mL的Bacillus thermophilus SgZ-10菌液接种到装有LB培养基的容器中，50℃条件下发酵48小时，发酵过程中需通入空气，通气量为20-100m3/h，并以180-220转/分钟的速度持续搅拌，发酵完成即得Bacillus thermophilusSgZ-10种子液。
(2)制备厌氧发酵培养基：
将0.6g/L磷酸二氢钠、0.25g/L氯化铵、0.1g/L氯化钾、0.2g/L酵母提取物(酵母粉，购自阿拉丁)、0.5g/L葡萄糖混合，加入5％(质量比)赤铁矿，调节pH至7.5，搅拌均匀。向培养基内通入氮气/二氧化碳混合气，100℃灭菌45分钟，冷却至80℃备用。
(3)将步骤(1)制备得到的Bacillus thermophilus SgZ-10种子液按1.5％接种量(体积比)接种至步骤(2)制备得到的厌氧发酵培养基上，50℃厌氧发酵48小时。发酵结束后，加入5％(质量比)的豆饼粉作为调理剂，搅拌均匀后，通过板框压滤，使复合高温菌剂的最终含水率在45％～55％。
对制备得到的复合高温菌剂进行平板计数和试管检测，发现在制备得到的复合高温菌剂中，Bacillus thermophilus SgZ-10的菌量约为8.3×107cfu/g。
实施例3复合高温菌剂的制备
制备方法如下：
(1)制备种子液：
按每株各2％的接种量将浓度为108cfu/mL的Bacillus composti SgZ-9菌液和浓度为108cfu/mL的Bacillus thermophilus SgZ-10菌液分别接种到装有LB培养基的容器中，50℃条件下发酵24小时，发酵过程中需通入空气，通气量为20-100m3/h，并以180-220转/分钟的速度持续搅拌，发酵完成即得Bacillus composti SgZ-9和Bacillusthermophilus SgZ-10种子液。
(2)制备厌氧发酵培养基：
将0.6g/L磷酸二氢钠、0.25g/L氯化铵、0.1g/L氯化钾、0.2g/L酵母提取物(酵母粉，购自阿拉丁)、0.5g/L葡萄糖混合，加入2％(质量比)赤铁矿和3％(质量比)水铁矿，调节pH至7.0，搅拌均匀。向培养基内通入氮气/二氧化碳混合气，100℃灭菌45分钟，冷却至80℃备用。
(3)将步骤(1)制备得到的Bacillus composti SgZ-9和Bacillus thermophilusSgZ-10种子液按每株1.5％的接种量(体积比)共同接种至步骤(2)制备得到的厌氧发酵培养基上，50℃厌氧发酵72小时。发酵结束后，加入5％(质量比)的豆饼粉作为调理剂，搅拌均匀后，通过板框压滤，使复合高温菌剂的最终含水率在45％～55％。
对制备得到的复合高温菌剂进行平板计数和试管检测，发现在制备得到的复合高温菌剂中，Bacillus composti SgZ-9的菌量约为5.6×108cfu/g，Bacillus thermophilusSgZ-10的菌量约1.8×107cfu/g。
复合高温菌剂的效果测试
(1)复合高温菌剂在污泥堆肥中的微塑料去除效果：
在本实施例中，检测对象为城市污泥，该城市污泥取自福州某污水处理厂，采用本领域常规检测方法对污泥的基本性质进行检测，结果如表2所示。
表2城市污泥堆肥物料的基本性质
pH
含水率(％)
总碳(％)
总氮(％)
C/N
7.3
64.7
60.2
3.1
19:1
按照质量百分比为实施例1中的复合高温菌剂：城市污泥＝5％：95％混合复合高温菌剂和城市污泥。用稻壳将含水率调整至60％左右进行堆置发酵，堆肥采用间歇曝气(每天曝气8小时，不曝气16小时)，且每间隔7天进行翻堆一次。设置空白对照，对照组中不加入复合高温菌剂。
分别在堆肥开始第0、3、5、7、9、11、13、15、17、20、23、26、29、32、35、38天进行取样，测定堆肥过程自由基的产量(采用本领域常规检测方法)，并通过显微镜观察、傅里叶红外光谱鉴定等方式对污泥堆肥前后微塑料含量的变化进行统计分析。
结果如图1～2所示。
通过对比对照组和实验组在堆肥过程自由基的产量，可以发现，添加了实施例1中的复合高温菌剂的实验组堆肥过程中，羟基自由基的产量远高于对照组的羟基自由基的产量。此外，堆肥腐熟后(堆肥45天后)，添加了实施例1中的复合高温菌剂的实验组和对照组堆肥中微塑料的含量都有不同程度的减少(图2)，其中，添加了实施例1中的复合高温菌剂的实验组堆肥中的微塑料含量从堆肥原料中的7.3×104个/千克(干重)下降到约4.0×104个/千克(干重)，微塑料去除率约为45％，而对照组堆肥中的微塑料的去除率仅约为6.8％(腐熟后的微塑料含量约6.8×104个/千克)，添加了实施例1中的复合高温菌剂的实验组的微塑料去除效果远优于对照组，说明添加了上述实施例中的复合高温菌剂能有效的去除污泥中的微塑料。
发明人进一步对实施例2和3中的复合高温菌剂分别进行了测试，其中，实施例2中的复合高温菌剂对微塑料的去除率为43％，实施例3中的复合高温菌剂对微塑料的去除率为48％，均远高于同期设置的对照组的微塑料去除率。因此，能够充分说明上述实施例中的复合高温菌剂能有效的去除污泥中的微塑料。
(2)复合高温菌剂在鸡粪高温堆肥中促进聚苯乙烯氧化降解效果：
为了进一步验证复合高温菌剂对塑料的降解能力以及指出其对塑料的降解机制，本实施例以聚苯乙烯为测试样品，检测复合高温菌剂对聚苯乙烯的氧化降解效果。对照处理组不添加本发明的复合高温菌剂
具体测试步骤如下：
将聚苯乙烯薄膜切割成为5cm×5cm的小片，得到聚苯乙烯塑料片。将切割好的聚苯乙烯塑料片、实施例3制备得到的复合高温菌剂、鸡粪以质量百分比为1％：4％：95％的比例混合均匀。其中，采用本领域常规检测方法对鸡粪的基本性质进行检测，结果如表3所示。
表3鸡粪堆肥物料的基本性质
pH
含水率(％)
总碳(％)
总氮(％)
C/N
7.6
66.0
52.5
4.2
13:1
用稻壳调整混合均匀的聚苯乙烯塑料片、实施例3制备得到的复合高温菌剂、鸡粪混合物的含水率(调整至60％左右)，进行堆置发酵，堆肥采用间歇曝气(每天曝气8小时，不曝气16小时)，且每间隔7天进行翻堆一次。
分别在堆肥开始第0、1、3、5、7、9、11、15、17、20、23、26、29、35、38、40、44天进行取样，测定堆肥过程自由基的产量(采用本领域常规检测方法)，并通过显微镜观察、傅里叶红外光谱鉴定等方式对堆肥前后聚苯乙烯塑料片形态以及含量的变化进行统计分析。
结果如图3～6所示。
如图3所示，添加了实施例3制备得到的复合高温菌剂的鸡粪在高温堆肥过程产生的羟基自由基产量明显比不加复合高温菌剂的对照组高。通过傅里叶红外光谱鉴定，在添加复合高温菌剂的堆肥处理组中，聚苯乙烯微塑料片分子量显著下降，而对照组聚苯乙烯微塑料分子量并不明显下降(图4)，并且表面含氧功能团增加(图5)。进一步对堆肥处理前后的聚苯乙烯微塑料片进行扫描电镜观察，发现聚苯乙烯薄膜表面附有大量铁氧化物及微生物，并且出现了明显的侵蚀孔洞(图6)。实验结果表明，上述实施例中的复合高温菌剂能够在鸡粪高温堆肥中通过产生大量的羟基自由基，破坏塑料材料表面的疏水性，促进微塑料的氧化降解。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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