具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行说明，应当能够理解的是，以下具体实施方式仅用于解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明中的酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis)和酸鱼乳杆菌(Ligilactobacillus acidipiscis)是同一菌种，可以互换使用。其仅分别根据最初分离鉴定时归属的属名和2020年重新划分的属名不同而具有不同的命名，实质上是相同的菌种。

本发明的发明人在研究的过程中，从斑点叉尾鮰肠道中分离到一株酸鱼乳杆菌，经16sRNA基因测序鉴定为酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis)，经过体外实验表明，该菌株能够抑制嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等水产动物致病菌，且对胆盐具有较好的耐受性。经投喂实验表明，该菌株能够促进斑点叉尾鮰的生长、提高其免疫力，使得斑点叉尾鮰具有抗鮰鱼爱德华氏菌感染的能力，是一种较好的饲料添加剂。该菌株于2021年02月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.21806。

本发明第一方面提供一种酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis)，所述酸鱼乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.21806。

本发明第二方面提供一种水产饲料添加剂，所述水产饲料添加剂中含有如上所述的酸鱼乳杆菌。

本发明提供的水产饲料添加剂中，可以含有任意含量的所述酸鱼乳杆菌，本领域技术人员可以根据实际情况(例如养殖动物种类、养殖模式等)调整其中所述酸鱼乳杆菌的含量。根据本发明的优选实施方式，其中，所述水产饲料添加剂中，以所述水产饲料添加剂的总重量为基准，所述酸鱼乳杆菌的含量以活细胞干重计在5重量％以上，优选为10-70重量％。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述水产饲料添加剂中也可以仅含有所述酸鱼乳杆菌作为活性成分。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述水产饲料添加剂中还可以含有辅料。

优选地，所述辅料包括：小麦淀粉、小麦麸、马铃薯淀粉、木薯淀粉、牛磺酸、蔗糖、葡萄糖、麦芽糊精、果糖、枸橼酸、粉状纤维素、可溶性淀粉、玉米淀粉、稻壳粉、米糠、硫酸钙等中的至少一种。

更优选地，所述辅料选自牛磺酸、葡萄糖、麦芽糊精、果糖、枸橼酸、粉状纤维素、可溶性淀粉、玉米淀粉、米糠、硫酸钙中的至少一种。

进一步优选地，所述辅料选自牛磺酸、果糖、粉状纤维素、玉米淀粉、硫酸钙中的至少一种。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述水产饲料添加剂中，以所述水产饲料添加剂的总重量为基准，所述辅料的含量为30-95重量％。

优选地，以所述水产饲料添加剂的总重量为基准，所述辅料的含量为40-80重量％。

本发明的发明人在研究的过程中发现，将本发明提供的酸鱼乳杆菌CGMCCNo.21806加入鱼类饲料时，能够获得明显的提高养殖鱼类生长性能、提高养殖鱼类免疫力等效果。

本发明第三方面提供一种鱼饲料，所述鱼饲料中含有如前所述的酸鱼乳杆菌或者水产饲料添加剂。

本发明提供的鱼饲料中，可以含有任意含量的所述酸鱼乳杆菌或者水产饲料添加剂，本领域技术人员可以根据实际情况(例如养殖鱼类种类、养殖鱼类的营养和免疫需求、养殖模式等)调整其中所述酸鱼乳杆菌或者水产饲料添加剂的含量。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述酸鱼乳杆菌或者所述水产饲料添加剂的用量使得在所述鱼饲料中，以所述鱼饲料的总重量为基准，所述酸鱼乳杆菌以活菌数计的含量为1×10⁸-8×10⁸CFU/g。

根据本发明一种特别优选的实施方式，所述鱼饲料的配方可以为：

优选地，所述鱼饲料中的维生素采用维生素预混料进行添加，所述维生素预混料中优选含有维生素A、维生素D3、维生素K、维生素E、维生素B1、维生素B2、维生素6、维生素B12、维生素H、维生素C、泛酸钙、烟酸、叶酸和氯化胆碱中的至少一种。所述维生素预混料可以是商购获得的相关产品，也可以是根据实际需要自行制备的相关产品。本领域技术人员可以根据实际情况(例如鱼类生长需要、养殖环境条件等)对维生素预混料中的成分和各组分的用量进行调整，在此不再赘述。

优选地，所述鱼饲料中的矿物质采用矿物质预混料添加，所述矿物质预混料中优选含有Zn、Fe、Mn、Cu、K、Co、Na等元素中的至少一种。本领域技术人员可以根据实际情况(例如鱼类生长需要、养殖环境条件等)对矿物质预混料中的成分和各组分的用量进行调整，在此不再赘述。

优选地，所述鱼饲料中的饲料添加剂即为如前所述的水产饲料添加剂。

更优选地，所述饲料添加剂的添加量使得在所述鱼饲料中，以所述鱼饲料的总重量为基准，所述酸鱼乳杆菌以活菌数计的含量为1×10⁸-8×10⁸CFU/g。

本发明第四方面提供如前所述的酸鱼乳杆菌或者水产饲料添加剂在水产养殖中的用途。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述用途可以包括在任意需要提高生长性能、增强免疫力的水产养殖过程中使用本发明提供的酸鱼乳杆菌或水产饲料添加剂。例如在海水养殖和/或淡水养殖中使用含有本发明提供的酸鱼乳杆菌或水产饲料添加剂的水产饲料等。

本发明的发明人在研究的过程中发现，本发明提供的酸鱼乳杆菌CGMCC No.21806以及利用该酸鱼乳杆菌制备获得的添加剂、饲料等产品特别适用于鱼类养殖，能够满足海水鱼以及淡水鱼养殖中各种不同鱼类在提高生长能力、增强免疫力等方面的需要。

本发明第五方面提供如前所述的酸鱼乳杆菌、水产饲料添加剂或者鱼饲料在海水鱼和/或淡水鱼养殖中的用途。

优选地，所述海水鱼选自大菱鲆、牙鲆和大黄鱼中的至少一种。

优选地，所述淡水鱼选自斑点叉尾鮰、黄颡鱼、草鱼、鲤鱼、鲫鱼和鲈鱼中的至少一种。

本发明的发明人在研究中发现，本发明提供的酸鱼乳杆菌对于水产养殖业中常见的致病菌，例如嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)等具有较好的抑制能力，将本发明提供的酸鱼乳杆菌或含有该酸鱼乳杆菌的添加剂、饲料等相关产品用于水产养殖可以有效防治由上述致病菌带来的疾病。

本发明第六方面提供如前所述的酸鱼乳杆菌、水产饲料添加剂或者鱼饲料在抑制细菌和/或提高养殖动物抗病能力中的用途。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述用途可以包括将本发明提供的酸鱼乳杆菌、水产饲料添加剂或者鱼饲料用于研发抑制养殖动物致病菌(例如养殖动物肠道病原菌等)的生物制品。还可以包括将本发明提供的酸鱼乳杆菌、水产饲料添加剂或者鱼饲料用于研发提高养殖动物抗病能力，尤其是提高养殖动物对于上述致病菌造成的疾病的抵抗能力的生物制品。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述细菌选自能够引起养殖水产疾病的细菌。优选选自嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)中的至少一种。

本发明的发明人经研究发现，本发明提供的酸鱼乳杆菌能够有效缓解鮰鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)感染造成的水产动物(尤其是养殖鱼类，例如斑点叉尾鮰等)疾病发展，降低死亡率。将其用于鱼类养殖时，能够有效提高养殖鱼类(针对鮰鱼爱德华氏菌)的抗病能力。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述提高养殖动物抗病能力包括提高养殖动物抵抗由嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和鮰鱼爱德华氏菌中的至少一种造成的疾病的能力。

由于嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等细菌分别是淡水、海水水产养殖动物的主要致病菌，导致水产动物肠炎、出血、烂鳃等相关疾病。而本发明提供的酸鱼乳杆菌CGMCCNo.21806可以用作肠道菌群调节剂和免疫调节剂，以降低由于淡水、海水养殖动物主要致病菌导致的动物病害(尤其是养殖动物病害)。根据本发明的优选实施方式，其中，所述用途还可以包括利用本发明提供的酸鱼乳杆菌进行与上述致病菌相关的饲料添加剂制备以及相关病害防治生物制品的研发。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。

以下实施例中采用的斑点叉尾鮰购自北京龙池养殖厂，购买时检验体表、鳃、内脏均未发现有明显细菌性感染症状，且鳃及肠道无寄生虫。

以下实施例中采用的试剂和材料未作特殊说明的情况下均购自正规化学试剂供应商，纯度为分析纯。

以下实施例中采用的菌株来源如下：

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 1.18738。

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)购自上海鲁微科技有限公司，保藏编号为ATCC 17802。

鮰鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri,Ei)购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 1.18867。

屎肠球菌(Enterococcus faecium,Ef)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 20430。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的酸鱼乳杆菌的分离、鉴定和保藏。

自斑点叉尾鮰肠道食糜中分离获得菌株P1，经16S rDNA测序鉴定为酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis,La)。

于2021年02月02日将菌株P1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位缩写：CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.21806。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的酸鱼乳杆菌在体外实验中对嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的抑制作用。

本实施例中采用的MRS培养基购自英国Oxoid公司，货号为CM1163；营养肉汤培养基购自杭州百思生物技术有限公司，货号为BS1003；营养琼脂培养基购自北京奥博星生物技术有限公司，货号为02-276。

将实施例1中分离获得的菌株P1(即酸鱼乳杆菌CGMCC No.21806)和乳酸菌常用菌株屎肠球菌(CICC20430)采用MRS培养基在37℃培养72h，而后利用MRS培养基制成浓度为2×10⁹个细胞/mL的菌液1(P1)和菌液2(屎肠球菌)备用。

将副溶血弧菌和嗜水气单胞菌分别按照1×10⁶个细胞/mL的浓度采用营养肉汤培养基培养过夜(约18h)，条件为28℃，150rpm振荡培养。而后利用营养肉汤培养基分别将其配制成浓度约为2×10⁶个细胞/mL的菌液A(副溶血弧菌)和菌液B(嗜水气单胞菌)。分别取100μL菌液A和菌液B涂布营养琼脂平板，并安置牛津杯(购自上海三麝实业有限公司，型号为7.8×6×10mm)，其中分别加入200μL菌液1和菌液2，并设置培养基对照。4℃静置扩散4h，而后置于28℃培养24h。共设置三组平行实验。

观察平板中抑菌圈的大小，结果详见表1。图1和图2中分别示出了菌株P1对嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的抑制实验结果，图3和图4中分别示出了屎肠球菌(CICC20430)对嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的抑制实验结果。

表1酸鱼乳杆菌和屎肠球菌抑菌活性*实验结果

*抑菌活性测量标准：抑菌圈直径8mm：-；抑菌圈直径8.1-10.0mm：+；抑菌圈直径10.0-16.0：++；抑菌圈直径>16mm：+++。

结果显示，酸鱼乳杆菌对两种病原菌的抑菌活性均强于屎肠球菌。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的酸鱼乳杆菌在体外实验中对胆盐的耐受程度。

分别将实施例1中分离获得的菌株P1(即酸鱼乳杆菌CGMCC No.21806)和乳酸菌常用菌株屎肠球菌(CICC20430)采用MRS培养基在37℃培养48h，而后利用生理盐水分别制成浓度约为1×10⁸个细胞/mL的菌液3(P1)和菌液4(屎肠球菌)。按照1％(v/v)的比例将菌液3和菌液4分别接种至不含胆盐、含有0.2％(w/v，即每mL培养基中加入2mg胆盐)胆盐和0.4％(w/v)胆盐的MRS培养基中，于37℃培养。在0h(接种后立即计数，即初始活菌数)及培养4h、8h进行平板计数，按照以下公式计算存活率。每个浓度设置三组平行实验。

存活率(％)＝各时间点活菌数/初始活菌数×100％

表2不同胆盐浓度下酸鱼乳杆菌和屎肠球菌的存活率％

由表2中的结果可以看出，本发明提供的酸鱼乳杆菌和参考菌株屎肠球菌均能够在0.2％的胆盐浓度下生长，但酸鱼乳杆菌存活率远高于屎肠球菌。酸鱼乳杆菌和屎肠球菌在0.4％的胆盐浓度下均不能生长。总体来看，本发明提供的酸鱼乳杆菌对胆盐的耐受性强于屎肠球菌，这表明其能够更适应养殖水产动物，尤其是养殖鱼类的肠道环境。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的酸鱼乳杆菌作为添加剂制成鱼饲料后对斑点叉尾鮰饲养的结果。

本实施例中采用的酸鱼乳杆菌鱼饲料配方为：

*该鱼饲料中酸鱼乳杆菌的添加量以酸鱼乳杆菌的活菌数计。

表3维生素预混料成分

表4矿物质预混料成分

上述鱼饲料制备完成后采用MRS平板监测其中酸鱼乳杆菌的活力，制作完成14天后检测到该饲料中酸鱼乳杆菌P1以活菌数计的含量为3.03±0.18×10⁸CFU/g。这表明，制作完成14天后饲料中的酸鱼乳杆菌的活力没有明显衰减。

(一)饲喂试验

饲喂试验中采用的鱼饲料按照以上配方每周配制一次，配制完成后置于-20℃密封保存。

饲喂试验方法：

将斑点叉尾鮰在室外养殖缸内驯化养殖2周后，按照44.89±2.03g的规格选择180尾斑点叉尾鮰，将其随机分至6个300L的玻璃养殖缸中，每缸30尾，并将其分为2组：酸鱼乳杆菌实验组(La)和基础饲料对照组(空白对照组，CG，采用的饲料与实验组的区别仅在于其中不含酸鱼乳杆菌)。其中，每组设置三个平行试验组，在玻璃养殖缸中饲养3天后开始饲喂试验。饲喂试验期间，每天上午9:00和下午16:00分别投喂一次，实验组投喂酸鱼乳杆菌饲料，对照组投喂基础饲料。采用饱食投喂的方法进行饲喂试验，未摄食的饲料进行回收，并80℃烘干称重，计算斑点叉尾鮰的摄食量(摄食量＝投喂量-回收量)。在饲喂试验期间每2天换水1次，每次更换养殖缸中1/3的水，保持水质清新。水温为27.5±1.5℃，pH在7.5±0.5，持续充氧。持续饲喂4周，将所有斑点叉尾鮰称重，计算体重增重率、特定生长率、存活率和饵料系数，结果详见表5。计算公式如下：

存活率(Survival rate,％)＝100×(试验结束鱼数量/初始试验鱼数量)

体重增重率(Weight gain，WG)＝终末体重(Final weight,FG)-初始体重(Initial weight,IG)

特定生长率％(Specific growth rate，SGR)＝100×(ln终末体重-ln初始体重)/养殖时间(天)

饵料系数(Feed conversion ratio,FCR)＝饵料总摄食量(干重，g)/总体重增重(g)

表5饲喂试验结果

注：表5中上标a和b代表实验组和对照组的数据差异显著

表5中的结果表明，采用含本发明提供的酸鱼乳杆菌的饲料进行斑点叉尾鮰养殖时，能够明显提高其生长性能。例如，实验组终末平均体重、体重平均增重以及特定生长率的等参数均显著高于对照组(P<0.05)，而实验组的饵料系数显著低于对照组。此外，实验组和对照的存活率无显著差异(P>0.05)。

(二)免疫参数检测

饲喂试验结束后，每缸中随机挑选5尾斑点叉尾鮰进行鱼尾静脉采血，采集的血液分别放入做好标记的不含抗凝剂的离心管中，室温(25±2℃)静置1h，4℃静置4h后。1500g离心5min，取血清-20℃保存备用。

检测项目：

1、替代补体通路活性(ACH₅₀)

检测方法：通过吸光度方法检测血清中的溶血度，将溶血度和血清体积绘制在对数表上，采用50％溶血血清体积计算ACH₅₀。

计算公式：ACH₅₀(单位/ml)＝1/K×r×1/2

其中，K为溶血50％的血清量，r为血清稀释的倒数，1/2为校正因子。

检测结果详见图5。

2、溶菌酶和超氧化物歧化酶(SOD)活性

检测方法：采用购自南京建成生物工程研究所的试剂盒(货号分别为A050和A001-3)对溶菌酶和超氧化物歧化酶活性分别进行检测，具体操作方法按照试剂盒说明书中记载的方法进行。

检测结果详见图6-7。

从图5-7可以看出酸鱼乳杆菌实验组的斑点叉尾鮰血液中ACH₅₀、溶菌酶和SOD活性均高于基础饲料对照组的斑点叉尾鮰，说明采用本发明提供的酸鱼乳杆菌能够提高斑点叉尾鮰的免疫力。

(三)人工感染试验

将免疫参数检测剩余的斑点叉尾鮰全部用于人工感染试验。将实验组和对照组的斑点叉尾鮰分别平均分配至3个300L养殖缸中，共计6缸斑点叉尾鮰用于人工感染试验。每尾斑点叉尾鮰腹腔注射100μl 4.0×10⁸cfu/ml的鮰鱼爱德华氏菌。人工感染试验共计进行18天，投喂方式与饲喂试验相同。每天记录死亡率(结果详见图8)。

根据图8中的结果可以看出：人工感染后，对照组在第2天陆续出现死亡，在第4天出现明显死亡，在第12天死亡数趋于稳定。实验组在第3天出现死亡，整个试验过程中死亡数较为平缓，在12天以后，未出现死亡。18天人工感染试验结束后，对照组和实验组的累积存活率分别为：16.39±6.99％和52.78±5.21％，差异显著(P<0.05)。这说明，本发明提供的酸鱼乳杆菌用于斑点叉尾鮰养殖时，能够显著提高斑点叉尾鮰的免疫力和抗病能力，降低由于鮰鱼爱德华氏菌感染造成的养殖鱼类死亡，减少病害造成的经济损失。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。