一种生防菌株及其在防治浙贝母软腐病和促进浙贝母生长中的应用
技术领域
本发明涉及中药材防病治病
技术领域
，尤其涉及一种生防菌株及其在防治浙贝母软腐病和促进浙贝母生长中的应用。背景技术
浙贝母为贝母属中药材，贝母以鳞茎入药，为药食两用的大宗常用中药，具有化痰止咳、清热散结之功效，生物碱为其化痰、止咳的主要成分。浙贝母适宜生长在海拔较低的山丘荫蔽处或竹林下，主产地在江苏南部、浙江北部以及湖南。
浙贝母在生长过程中容易发生灰霉病、黑斑病、根腐病、软腐病等主要病害，更随连作日益严重。浙贝母软腐病为土传病害，由欧文氏菌胡萝卜软腐变种(Erwiniacarotovora)引致，病鳞茎受害部分开始为褐色水渍状，蔓延很快，受害后鳞茎变成糟糟的豆腐渣状，或变成黏滑的“鼻涕状”；有时停止危害，而表面失水时则成为一个似虫咬过的空洞。腐烂部分和健康部分界明显。表皮常不受害，内部软腐干缩后，剩下空壳，腐烂鳞茎具特别的酒酸味。目前主要使用各种杀菌剂和杀螨刘在下种前浸种的方法进行防治。如下种前用20％可湿性三氯杀螨砜800倍加80％敌敌畏乳剂2000倍再加40％克瘟散乳剂1000倍混合液浸种10～15分钟。但是化学防治会对土壤、水资源造成污染，农药残留也会对人畜的健康造成危害。
基于上述化学防治存在的诸多缺点，目前急需一种有效、安全、可靠的生物防治方式来控制这些病害。农业措施中比较有效的是轮作倒茬，尤其是水旱轮作，能够有效的降低土壤中菌量，减少病害发生，但在实际应用中存在一定困难。而生物防治与其他方法相比，具有安全、有效、持久的特点，特别是避免了化学防治带来的一系列问题。生防制剂对病害防治效果好，对人畜无毒，不污染环境，无残留；对病虫害的杀伤特异性强，不伤害天敌，有益生物，能保持生态平衡；生产原料和有效成分为天然产物易降解，可回归大自然，保证可持续发展；可用生物技术和基因工程的方法对微生物进行改；多种因素和成分发挥作用，病原菌难以产生抗药性。因此，通过生防菌剂对浙贝母软腐病进行防治是一种比较有前途的防治方法，但目前仍缺少能有效防治浙贝母软腐病的生防菌剂。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明分离并筛选了一种生防菌株Dm97，该菌株制备成的微生物菌剂可有效防治浙贝母软腐病，并促进浙贝母生长，且将上述微生物菌剂和农业栽培措施结合起来使用，可使其能尽量发挥其本身的防治潜能。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一种生防菌株，所述生防菌株为Dm97(芽孢杆菌)，其分类命名为Bacillus sp.，其保藏编号为GDMCC No:61459，保藏日期为2021年01月20日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
本发明的第二个方面是提供一种微生物菌剂，其包括上述生防菌株Dm97或由上述生防菌株Dm97发酵培养制备。
进一步地，所述微生物菌剂采用湿菌与菌体保藏液按1：20～60g/mL进行配制。其中，所述湿菌为所制备的生防菌株Dm97的培养菌液；所述菌体保藏液包括玉米面、豆饼粉、豆粕粉中的一种或多种，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖中的一种或多种，鱼粉，矿质营养元素。具体地，所述菌体保藏液的配方为玉米面、豆饼粉、豆粕粉中的一种或多种5～10g，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖中的一种或多种3～6g，鱼粉2～8g，磷酸二氢钾0.1～0.5g，硫酸亚铁0.1～0.5g，硫酸镁1～5g，硫酸锰0.1～0.5g，碳酸钙0.1～0.5g，配平至1L。更进一步地，所述湿菌与菌体保藏液的配制浓度为1：40g/mL。
进一步地，所述微生物菌剂中活菌总浓度为5×109～1×1010CFU/mL。
进一步地，所述微生物菌剂可室温保存2～3年。
进一步地，所述微生物菌剂还包括农药学上可接受的助剂，包括但不限于：分散剂、稳定剂、载体等。上述微生物菌剂的剂型包括但不限于：液体制剂、固体制剂(如粉剂)等。
进一步地，所述微生物菌剂在稀释后进行应用，稀释倍数为50～1000倍，稀释后的浓度为1×107～9×107CFU/mL。
本发明的第三个方面是提供一种生防菌株的培养方法，其包括步骤：将上述生防菌株Dm97接种到培养基中培养，待长出单菌落后，挑取单菌落接入培养液中，摇床培养，制成种子液；将种子液接种于培养液中摇床培养，获得生防菌株Dm97的培养菌液。
进一步地，所述培养基或培养液的配方包括：氯化钠10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L，调节pH值为7.2。具体地，所述配方为LB配方。
进一步地，所述培养方法具体步骤包括：将生防菌株Dm97接种到LB培养基中，平板上划线，25～32℃生化培养箱中培养12-18h，待长出单菌落后，挑取单菌落接入LB培养液中，置于25～32℃，150～250r/min的摇床中培养20～30h，制成种子液；将种子液接种于LB培养液里，置于25～32℃，150～250r/min的摇床中培养36～60h，获得生防菌株Dm97的培养菌液。更进一步地，将培养14～16h后的单菌落接种于含有5mL的LB培养液的试管中，置于28℃，200r/min的摇床中培养25h，制成种子液；以1wt％的接种量将种子液接种于装有500mL的LB培养液的三角瓶里，置于28℃，200r/min的摇床中培养48h，获得生防菌株Dm97的培养菌液。
进一步地，采用所述培养菌液和菌体保藏液按1：20～60g/mL制备微生物菌剂，所述微生物制剂的活菌总浓度为5×109～1×1010CFU/mL。更进一步地，所述微生物菌剂在稀释至1×107～9×107CFU/mL后进行应用。
本发明的第四个方面是提供一种生防菌株Dm97、包括上述生防菌株Dm97或由上述生防菌株Dm97发酵培养制备的微生物菌剂在防治浙贝母病害和/或促进浙贝母生长中的应用。
进一步地，所述浙贝母病害包括浙贝母软腐病。
本发明的第五个方面是提供一种用于防治浙贝母病害和/或促进浙贝母生长的方法，其采用生防菌株Dm97、包括上述生防菌株Dm97或由上述生防菌株Dm97发酵培养制备的微生物菌剂于浙贝母苗移栽时浇灌施用。
进一步地，所述微生物菌剂的施用步骤包括：将所述微生物菌剂进行稀释，前期采用土壤处理，后期采用根部处理。
进一步地，所述微生物菌剂的稀释步骤为：采用的微生物菌剂的组成为生防菌株Dm97的培养菌液与菌体保藏液，其还可包括农药学上可接受的助剂，包括但不限于：分散剂、稳定剂、载体等；上述微生物菌剂采用清水进行稀释并混匀，稀释至1×107～9×107CFU/mL(优选5×107CFU/mL)。
进一步地，所述施用的频率及用量为：将微生物菌剂稀释100倍制备成施用菌液，土壤处理为移栽前每亩使用2L施用菌液进行苗床喷施处理，根部处理为移栽当天处理、15d、30d、75d以灌根的方式处理，每次1L施用菌液/亩。
本发明的第六个方面是提供一种生防菌株Dm97的分离筛选方法，其包括步骤：参照稀释平板涂布法，对发病植株根际土壤细菌进行分离。取100μL稀释液依次涂布在NA培养基上，每个梯度3个重复，于30℃培养24～48h，观察挑取形态特征不同的单菌落，纯化后保存在4℃冰箱中备用。在LB培养基上采用点接法对分离、纯化后的菌株进行筛选，通过初筛和复筛挑取抑菌圈明显的菌株。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
本发明筛选的生防菌株Dm97是针对浙贝母病害开发的生物制剂，尤其是针对浙贝母软腐病，因其属于生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，利于浙贝母的无公害生产，可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可以减少种植成本，而且有利于浙贝母的种业发展。经过大田试验可知，由生防菌株Dm97制备的微生物菌剂前期通过土壤处理预防软腐病，后期可以通过根部处理使用来更好地控制软腐病，其能有效控制软腐病对浙贝母的侵染，达到控制病情发生的效果，具体地，Dm97菌剂对浙贝母软腐病的防治效果达90％以上，对无病植株的促生效果可达70％以上，对浙贝母增产效果在50％以上，这表明Dm97菌剂具有很好的防病增产效果，有较大的潜力开发成商业化的活菌生防制剂。
附图说明
图1是本发明一实施例中大田试验中菌剂Dm97对浙贝母软腐病的防治效果(播种后330天)；其中，A为空白对照，B为采用菌剂Dm97处理。
图2是本发明一实施例中大田试验中菌剂Dm97对浙贝母的促生作用(播种后145天)；其中，A为空白对照，B为采用菌剂Dm97处理。
上述生防菌株-芽孢杆菌Dm97已进行保藏，其分类命名为Bacillus sp.，其保藏编号为GDMCC No:61459，保藏日期为2021年01月20日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为质量百分比。除非另有定义或说明，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
实施例1-生防菌株Dm97的分离筛选及鉴定
本实施例为生防菌株Dm97(芽孢杆菌Bacillus sp.)的筛选及鉴定过程，其具体包括步骤：
(1)生防菌株Dm97的筛选
菌株来源：Dm97从南通浙贝母根围土中分离得到；
菌株分离方法：采用平板稀释法：将分别盛有9mL水的6支试管灭菌，并按10到106的顺序进行编号，移液试管吸取1mL培养的菌液，注入10倍稀释的试管中，用手指轻压移液管上的橡皮，吹吸三次，使菌液与水充分混匀，从10倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复第二步的混匀操作。以此类推，直到完成最后一支试管的稀释。
将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中，取少量稀释菌液(不超过0.1mL，具体可为100μL)滴加到NA培养基表面，将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s。用涂布器将菌液均匀地涂布在NA培养基表面，涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。每个梯度3个重复，于30℃培养24～48h，观察挑取形态特征不同的单菌落，纯化后保存在4℃冰箱中备用；在LB培养基上采用点接法对分离、纯化后的菌株进行筛选，通过初筛和复筛挑取抑菌圈明显的菌株。
(2)生防菌株Dm97的鉴定-分子生物学鉴定
利用原核生物16S rRNA编码基因片段序列测序方法鉴定，16S rRNA编码基因扩增和序列分析具体如下：菌株在LB培养基中28℃培养至对数期，以12000r/min离心5min收集菌体，采用上海赛百盛基因技术有限公司的基因组DNA快速提取试剂盒，提取细菌的基因组DNA，以提取的DNA产物为模板，采用下述细菌16S rRNA编码基因扩增通用引物：
Farword：U8-27(5’-AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3’)
Reserve：L1494-1514(5’-CTACGG(AG)TACCTTGTTACGAC-3’)
以基因组DNA为模板，进行16S rRNA编码基因片段的扩增。纯化PCR产物后，送样至上海生工生物工程有限公司进行测序。将测序结果通过NCBI BLAST软件进行同源性比较，最终鉴定菌株Dm97为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，对该菌株进行保藏，其保藏编号为：GDMCCNo:61459。
实施例2-生防菌株Dm97的培养及其菌剂的制备
本实施例为实施例1筛选获得的生防菌株Dm97的一较佳培养方法及其菌剂制备方法，其具体步骤包括：
(1)生防菌株Dm97的培养
接种生防菌株Dm97到LB培养基(LB配方：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为7.2)。平板上划线，28℃生化培养箱中培养14-16h，待长出单菌落后，挑取单菌落接入含有5mL的LB培养液的试管中，置于28℃，200r/min的摇床中培养25h，制成种子液；以1％的接种量将种子液接种于装有500mL的LB培养液的三角瓶里，置于28℃，200r/min的摇床中培养48h，即为所制备的生防菌株Dm97的培养菌液。
(2)微生物菌剂的制备
微生物菌剂采用步骤(1)制备的生防菌株Dm97的培养菌液与菌体保藏液按1：40(g/mL)配制，可室温保存2～3年。上述菌体保藏液的配方为玉米面、豆饼粉、豆粕粉中的一种或多种5～10g，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖中的一种或多种3～6g，鱼粉2～8g，磷酸二氢钾0.1～0.5g，硫酸亚铁0.1～0.5g，硫酸镁1～5g，硫酸锰0.1～0.5g，碳酸钙0.1～0.5g，配平至1L。上述微生物制剂的活菌总浓度为5×109～1×1010CFU/m。上述菌剂可稀释50～1000倍(稀释浓度为1×107～9×107CFU/mL)后于浙贝母苗移栽时浇灌施用(即在作物移栽同时进行菌株制剂稀释后灌根使用)。
实施例3-由生防菌株Dm97制备的微生物菌剂的应用
本实施例3采用实施例2制备的由生防菌株Dm97制备的微生物菌剂用清水稀释至5×107CFU/mL后摇匀，进行浙贝母病害防治方面的验证，其具体步骤包括：
(1)大田防病试验(浙贝母软腐病)
大田实验在在江苏省南通市海安县韩洋村东城中药材种植专业合作社进行，供试植物为浙贝母(Fritillaria thunbergii Miq.)。
实验处理为：由生防菌株Dm97制备的微生物菌剂的稀释液、清水对照。处理方法：移栽当天处理、15d、30d、75d分别以灌根的方式处理，每次1L/亩。每个处理3个重复，每个小区面积24m2(6m*4m)，行距为20cm，株距为10cm。每个小区1200棵浙贝母。
软腐病病级标准：
0级：整个鳞茎表面未发现病斑；
1级：整个鳞茎病斑面积≦5％；
2级：整个鳞茎病斑面积在5％～20％；
3级：整个鳞茎病斑面积20％～50％；
4级：整个鳞茎病斑面积50％～70％
5级：整个鳞茎病斑面积＞70％。
病害严重度(％)＝100％×Σ(病植株数×病级数)/(总植株数×最高病级数)
防病效果(％)＝100％×(对照病害严重度-处理病害严重度)/对照病害严重度。
上述大田防病试验结果如下表1和图1所示：
表1大田中菌剂Dm97对浙贝母软腐病的防治效果(播种后330天)
注：数值为平均值±标准误，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。
由上表结果可知，Dm97菌剂对浙贝母软腐病的防治效果达92.58％，结合图1可知上述Dm97菌剂可以很好的控制浙贝母软腐病。
(2)大田促生及增产效果
大田实验在江苏省南通市海安县韩洋村东城中药材种植专业合作社进行，供试植物为浙贝母(Fritillaria thunbergii Miq.)。
实验处理为：由生防菌株Dm97制备的微生物菌剂的稀释液、清水对照。处理方法：移栽当天处理、15d、30d、75d分别以灌根的方式处理，每次1L/亩。每个处理3个重复，每个小区面积24m2(6m*4m，)，行距为20cm，株距为10cm。每个小区1200棵浙贝母。分别在生育期统计叶片数、株高等生长指标，并在收获后统计产量，具体促生结果见下表2表3和图2。
表2南通浙贝母根系促生效果(播种后145天)
表3大田中菌剂Dm97对促生作用(播种后145天)
注：数值为平均值±标准误，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。
由上表可知，Dm97菌剂对根系促生效果有75.78％，地上部促生在10％～20％之间，常规产量为530kg/亩，处理田块产量为800kg/亩，增产率达50.94％，结合图2可知Dm97菌剂具有优异的增产效果，有较大的潜力开发成商业化的活菌生防制剂。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围。
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