植物乳杆菌hg-23菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物
技术领域
，具体涉及一种植物乳杆菌HG-23菌株及其在调节血脂方面的应用。背景技术
高胆固醇血症也称高低密度脂蛋白胆固醇血症，是导致动脉粥样硬化性心血管病的首要危险因素。最新研究显示，各种心血管病风险人群低密度脂蛋白每降低1mmol/L，主要血管事件可降低21％。据2013年的统计显示，我国约有2亿临界高胆固醇血症人群以及8800万高胆固醇血症患者。
目前主要采用药物治疗和饮食干预的方法来控制和降低血脂水平。临床上使用较多的是他汀类和贝特类药物，药物初期使用疗效较为显著，但随着长期服用会产生不同程度的副作用，加重患者的健康问题，如长期服用他汀类药物容易诱发肌病、横纹肌溶解、血糖异常、肝炎及肾功能障碍等，长期服用贝特类药物会导致肝损伤严重，增加患胆结石的风险。低脂或低饱和脂肪食物的膳食能有效减少血清中胆固醇的含量，但低脂食物的口感和风味比较简单，这个膳食建议仍未被大众接受或长期坚持，稍不注意就容易反弹，因此，食用降血脂功能性食品是长期控制血脂更理想的方法。
目前，对于益生菌降血脂的研究已经持续将近半个世纪，国内针对降血脂功能研究比较深入的两个菌株同属于植物乳杆菌，分别为L.plantarum P8和植物乳杆菌ST-III。L.plantarum P8来自内蒙古农业大学的张和平领导的团队，动物试验表明，L.plantarumP8具有显著的降血脂作用。曾任东北农业大学食品学院副院长，现任光明乳业股份有限公司总经理郭本恒领导的团队和江南大学合作研发的植物乳杆菌ST-III，成功通过动物实验和人群临床试验的证实其降胆固醇的效果，并已产业化，成为光明公司的一个具有自主知识产权的益生菌产品。
因此，开发出安全、有效，具有调节血脂作用的乳酸菌在发酵食品和医药领域具有广泛的应用前景。
鉴于此，申请此专利。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种植物乳杆菌HG-23菌株及其应用，菌株可以耐受胃酸和胆盐，存活和定殖于肠道内，调解改善宿主的肠道微生态平衡，调节血脂，具体表现为降低胆固醇和甘油三酯。
本发明的目的是提供一种植物乳杆菌HG-23。
本发明的另一目的是提供上述植物乳杆菌HG-23的应用。
根据本发明的
具体实施方式
的植物乳杆菌HG-23，所述植物乳杆菌HG-23的保藏号为CCTCC No.2021330。
根据本发明的具体实施方式的植物乳杆菌HG-23在制备食品或药物中的应用，所述食品或药物为降低血脂的食品或降低血脂的药物。
优选的，所述食品或药物为降低胆固醇和甘油三酯的食品或药物。
根据本发明的具体实施方式的植物乳杆菌HG-23在制备药物中的应用，进一步的，所述药物包含所述的植物乳杆菌HG-23；以及医药用无毒载体。
根据本发明的具体实施方式的植物乳杆菌HG-23在制备药物中的应用，进一步的，所述药物的剂型选自片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂的至少一种；优选的，所述药物为复合益生菌片。
本发明所述的药物中还包含药学上可接受的辅料。所述药学上可接受的辅料包括但不限于：药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂。所述载体包括但不限于淀粉或其衍生物、乳糖、聚乙二醇；所述稀释剂包括但不限于淀粉或其衍生物、乳糖、蔗糖、植物油、蜡、脂肪酸；填充剂包括但不限于滑石粉；所述辅料还可以包括如防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂、保湿剂、抗氧化剂、着色剂、稳定剂、缓冲剂、pH值调节剂。上述物质根据需要帮助配方的稳定性或有助于提高活性或生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
根据本发明的具体实施方式的植物乳杆菌HG-23在制备食品中的应用，进一步的，所述食品包含所述的植物乳杆菌HG-23，以及食品学上可接受的添加剂。
本发明中所使用的术语“食品”是指广义理解，其可以是任何可被使用的形式，即除了常规的食品形式外，本发明的食品还可以为保健品、饮品、发酵食品等。
优选地，所述食品为益生菌固体粉剂。将在实施例中详细阐明一种益生菌固体粉剂的配方。
根据本发明的具体实施方式的植物乳杆菌HG-23在制备食品中的应用，更进一步的，所述益生菌固体粉剂由低聚木糖、菊粉、低聚果糖、柠檬水果粉和植物乳杆菌HG-23制成。
根据本发明的具体实施方式的植物乳杆菌HG-23在制备食品或药物中的应用，更进一步的，所述植物乳杆菌HG-23为冻干粉；所述冻干粉采用冻干机将植物乳杆菌HG-23的菌悬液在无菌环境下冷冻真空干燥而成。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明筛选所得植物乳杆菌HG-23可以耐受胃酸和胆盐，存活和定殖于肠道内，调解改善宿主的肠道微生态平衡，发挥其有益作用，产生确切的健康功效；具体表现降低血液中甘油三酯和胆固醇。
(2)本发明筛选所得植物乳杆菌HG-23可用于制备降胆固醇及甘油三酯的食品及药品，试验表明，得到的食品也同样具有降低胆固醇及甘油三酯功效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实用新型的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示根据本发明的具体实施例2植物乳杆菌HG-23对胆固醇的降解率，横坐标为分组(空白对照、商业菌株、HG-23)，纵坐标为体外对胆固醇的降解率；
图2为根据本发明的具体实施例4植物乳杆菌HG-23的耐胃酸能力，横坐标为时间，纵坐标为HG-23菌株在pH为2的模拟胃液中的存活菌数；
图3为根据本发明的具体实施例4植物乳杆菌HG-23耐胆盐能力，横坐标为时间，纵坐标为HG-23菌株在MRS培养基和含0.3％胆盐的MRS培养基中的OD值；
图4为根据本发明的具体实施例5植物乳杆菌HG-23降低体内TG含量的能力，横坐标代表组别，纵坐标代表甘油三酯的浓度；
图5为根据本发明的具体实施例5植物乳杆菌HG-23降低体内TC含量的能力，横坐标代表组别，纵坐标代表胆固醇的浓度；
图6为根据本发明的具体实施例6益生菌固体粉剂降解甘油三酯(TG)动物实验的结果，横坐标代表组别，纵坐标代表甘油三酯的浓度；
图7为根据本发明的具体实施例6益生菌固体粉剂降解胆固醇(TC)动物实验的结果，横坐标代表组别，纵坐标代表胆固醇的浓度。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明的植物乳杆菌HG-23是一种乳酸菌，能够有效的降低胆固醇和甘油三酯，可作为食品及药物的成分，改善人体高血脂症状。
本发明的新菌株植物乳杆菌HG-23(分类名称：植物乳杆菌；拉丁名称：Lactobacillus plantarum)已经于2021年4月6日在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏单位的地址为：武昌珞珈山武汉大学校内中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo.2021330；存活性由该保藏中心于2021年4月6日进行检测，结果为：存活。
在一些较为具体的实施方案中，植物乳杆菌HG-23在制备食品或药物中的应用，所述食品或药物为降低胆固醇的食品或降低胆固醇的药物。
进一步的，所述药物包含所述的植物乳杆菌HG-23；以及医药用无毒载体。
优选的，所述药物为复合益生菌片。
所述食品包含所述的植物乳杆菌HG-23，以及食品学上可接受的添加剂。
优选地，所述食品为益生菌固体粉剂。
更进一步的，所述益生菌固体粉剂由低聚木糖、菊粉、低聚果糖、柠檬水果粉和植物乳杆菌HG-23制成；所述植物乳杆菌HG-23为冻干粉；所述冻干粉采用冻干机将植物乳杆菌HG-23的菌悬液在无菌环境下冷冻真空干燥而成。
以下通过实施例并结合附图进一步详细说明本发明的技术方案。然而，所选的实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明的范围。
实施例1植物乳杆菌HG-23的分离鉴定
1.培养基配方优化
分组进行优化培养基实验，最后得到乳酸菌培养基最佳配方：
MRS固体培养基1L配方：酪蛋白胨10.0g/L，牛肉浸膏10.0g/L，酵母浸膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，吐温801.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，醋酸钠5.0g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂17.5g；pH6.5，121℃灭菌20min。
MRS肉汤培养基配方：酪蛋白胨10.0g/L，牛肉浸膏10.0g/L，酵母浸膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，吐温801.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，醋酸钠5.0g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锰0.05g/L，pH6.5，121℃灭菌20min。
2.菌株筛选
植物乳杆菌HG-23菌种来源于健康人肠道，从健康的成年人粪便中分离得到。取健康的成年人粪便，用无菌生理盐水，10倍梯度稀释样品后至10-3倍，将其涂布于MRS固体培养基，置于37℃培养箱中培养24-48h，观察菌落形态特征，并挑取MRS固体培养基上乳酸菌的疑似菌落，分别转接到MRS液体培养基中进行纯培养，共分离出5株菌，对每株菌进行编号。
对分离纯化得到的这若干株菌进行酸及胆盐耐受力及降胆固醇能力的测定，详细实验步骤见实施例2和实施例3，从中筛选得到酸及胆盐耐受力较强，降胆固醇能力较强的植物乳杆菌HG-23。
3.菌种鉴定
对筛选到的植物乳杆菌HG-23抽提细菌总DNA，进行16s rDNA扩增，引物为：
sgF:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'(SEQ ID NO：1)
sgR:5'-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQ ID NO：2)
利用上述引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收、测序。
分离获得的菌株16s DNA测序结果如SEQ ID NO:3所示。
实施例2植物乳杆菌HG-23的体外胆固醇去除率试验
按照以下步骤检测菌株体外胆固醇去除率，以商业菌株植物乳杆菌299V作为实验对照组，具体如下：
将供试菌株转接于MRS液体培养基中，于37℃培养24h，以1％的接种量传代2次后，于37℃培养15h，待用。配制液体MRS培养基，灭菌待用；
配制含有胆固醇的MRS培养基(培养液MRSO-CHOL)：由MRS液体培养基、巯基乙酸钠、胆盐和胆固醇组成，其中，巯基乙酸钠在培养液MRSO-CHOL中的浓度为2g/L，胆盐在培养液MRSO-CHOL中的浓度为0.3％，胆固醇的浓度为120ug/ml。
实验组：活化本发明的植物乳杆菌HG-23菌液按1％接种量接种于10ml培养液MRSO-CHOL中。
阳性对照组：活化商业菌株的菌液按1％接种量接种于10ml培养液MRSO-CHOL中。
空白对照组：10ml没有接种菌株的培养液MRSO-CHOL。
将这两组样品放置于37℃恒温培养箱培养24h后，取出摇匀，4000r/m离心15min，取上清液，用邻苯二甲醛显色剂测定上清中胆固醇含量，并计算胆固醇的去除率。
其中，胆固醇去除率＝对照组胆固醇与实验组胆固醇的差值/对照组胆固醇含量。
实验结果见图1，植物乳杆菌HG-23降胆固醇降低率为70.94％，表明植物乳杆菌HG-23有较强体外降低胆固醇能力。
实施例3植物乳杆菌HG-23的细菌安全性试验
(1)抗生素敏感性测试
采用微量稀释法检测HG-23抗生素抗性。将测试抗菌药物(Gentamicin,Kanamycin,Tetracycline,Erythromycin,Clindamycin,Chloramphenicol,Amplicilin，起始浓度分别为1024ug/ml，256ug/ml，64ug/ml，8ug/ml，16ug/ml，64ug/ml，16ug/ml)做一系列2倍比稀释共12次并分别加入96孔板对应孔，然后对应孔加入2ml稀释的试验菌液，经48h培养后观察，以抗菌药物最小抑菌浓度(MIC)孔，即为试验菌株的敏感度。实验结果如见表1所示：
表1植物乳杆菌HG-23对抗生素的抗性测试结果
抗生素(mg/mL)
HG-23
EFSA规定安全值(植物乳杆菌属)
Gentamicin
8
16
Kanamycin
32
64
Tetracycline
16
32
Erythromycin
0.5
1
Clindamycin
0.5
2
Chloramphenicol
2
8
Amplicilin
1
2
从表1中可以看出，植物乳杆菌HG-23对抗生素的抗性测试结果表明抗生素MIC都在安全范围内。
(2)代谢物毒性检测
乳酸旋光性检测：使用爱尔兰Megazyme公司的D-/L-乳酸检测试剂盒进行检测。实验结果不产生D-乳酸。
硝酸盐还原酶活性检测：在无菌条件下，将活化好的菌株按3％的接菌量接入到硝酸盐培养基中37℃培养5d后，滴加碘化钾溶液和淀粉溶液各10滴，观察实验结果。同时做空白实验。实验结果显示所有菌液均未变蓝，为阴性反应。
吲哚实验：无菌条件下，将活化好的菌株按3％的接菌量接入到蛋白胨水养基中。37℃培养72h，加入吲哚试剂8～10滴，观察实验结果。同时做空白实验。实验结果未出现红色圆环，表明其代谢不产生吲哚。
氨基脱羧酶活性检测：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺(赖氨酸→尸胺，鸟氨酸→腐胺，精氨酸→精胺)和二氧化碳，使培养基变碱性，滴加指示剂(溴甲酚紫)，呈黄色为阴性，呈紫色为阳性。实验结果显示测定管呈黄色，为阴性。
(3)细胞粘附能力的测定
6孔板中的细胞单层培养物用不完全DMEM(不添加血清和双抗)液37℃恒温培养1h；将培养液吸出，用无菌PBS洗涤3次,将洗涤液吸干；取500μL108cfu/mL的实验菌株与500μL不完全DMEM混匀后，加入到6孔培养板中，同时设无细胞仅有菌液的空白对照，37℃，恒温培养1.5h；取出培养板，将培养液吸干，用无菌PBS洗涤5次，吸干洗涤液；每孔加入10％甲醛,室温固定2h；吸干固定液，用无菌PBS洗涤3遍，吸干洗涤液，室温干燥；革兰氏染色后镜检，随机选取20个视野进行计数，并计算粘附指数：
粘附指数＝细菌/细胞数(即平均每个细胞粘附的细菌个数)
菌株随机选取20个视野，对视野中的细胞上粘附的细菌的总数和细胞数进行计数并测定粘附指数，实验结果HG-23对人结肠癌细胞系HT-29粘附指数为5.6，具有较好的细胞粘附能力。
实施例4植物乳杆菌HG-23的体外酸及胆盐耐受力试验
配制模拟胃液SGF(2.0g NaCl+3.2g胃蛋白酶(pepsin)+适量浓盐酸调PH值3.0)，用0.2μm微孔滤膜过滤后待用。挑取斜面菌种于MRS液体培养基中，37℃培养16～18h。将菌悬液4000r/min离心15min，去上清，称量菌体湿重，按照0.1g/ml的比列重新悬浮菌体于生理盐水中，在按照1：10的比列加入到SGF液中，充分混匀后置于37℃恒温培养箱中培养2h，进行细胞计数。实验结果见图2，活菌数保持在一个数量级，表明植物乳杆菌HG-23体外有较强的耐酸能力。
将活化两次的菌液按1％量接入灭菌的含有0.3％胆盐的10mL MRS液体培养基中培养并进行生长曲线测定，实验结果见图3，表明HG-23体外有较强的抗胆汁能力。
实施例5植物乳杆菌HG-23的体内有效性研究(动物实验)
(1)实验菌株的制备：
将活化两次的植物乳杆菌HG-23接种于MRS液体培养基中，于37℃培养18h，6000r/m离心10min，用灭菌生理盐水洗涤后收集菌体。然后，加入0.85％生理盐水，调整菌数约1.0×109CFU/ml，然后将活菌按每日使用量分装于15ml离心管，服用剂量为每天2ml/只，每组10只，共4组，需灌胃28天。
(2)实验动物分组及饲养方式：
Sprague-Dawley系5周龄雄性大鼠，共40只，自由饲喂至第28天，平均分为4组，每组10只：
HG-23组：灌胃活菌悬液，饲喂高脂饲料；
模型组：灌胃0.85％生理盐水，饲喂高脂饲料；
正常组：灌胃0.85％生理盐水，饲喂标准饲料；
血脂康组：灌胃标准剂量血脂康，饲喂高脂饲料。
每天每只2ml灌胃，持续28天，然后停止灌胃，各组饲料、水不变持续28天。
(3)样品采集与分析测试：
正式试验前、第28天以及时间段进行采血。采血方法为绝食一夜后，于大鼠股静脉采血，凝血后4000r/m离心10min分离血清，利用试剂盒(试剂盒名称：总胆固醇测定试剂盒，公司：浙江东瓯诊断产品有限公司)和)和变色酸显色法，酶标仪(公司：MolecularDevices，型号：Spectra MAX190)分别检测胆固醇及甘油三酯。
(4)实验结果
实验结果见图4和图5。用含HG-23菌株菌悬液喂养高脂大鼠28天后股静脉抽血检测，发现与对照相比大鼠血液中甘油三酯(TG)及胆固醇(TC)分别下降25％和27.6％，表明植物乳杆菌HG-23在大鼠体内确有降低胆固醇及甘油三酯功效。
实施例6
一种调节血脂的复合益生菌固体粉剂的制备。其由以下重量百分比的组分组成：柠檬水果粉30％、低聚果糖22％、低聚木糖20％、菊粉20％、植物乳杆菌HG-23菌粉8％。
动物实验证明植物乳杆菌HG-23有效降低血清中胆固醇和甘油三酯水平。低聚果糖、低聚木糖和菊粉为益生元，可以促进益生菌的增殖。此外，国内外多项研究表明低聚果糖、低聚木糖和菊粉能够降低血清中甘油三酯和胆固醇的浓度,进而改善脂类代谢。该配方还具有组分天然，配方科学，营养均衡，服用方便，溶解性好，不粘牙的优点。
复合益生菌固体粉剂按以下工艺步骤制备而成：
(1)冻干粉制备：采用冻干机将植物乳杆菌HG-23的菌悬液在无菌环境下冷冻真空干燥制成植物乳杆菌HG-23冻干粉，真空度6Pa，冷冻温度-40℃，冻干时间为其中每克植物乳杆菌HG-23冻干粉中活菌数为5×1011cfu，水分含量小于5％；
(2)配料：将植物乳杆菌HG-23、柠檬水果粉、低聚果糖、低聚木糖、菊粉、原料转入10万级洁净区域，取样进行检验；
(3)过筛：检验合格后，分别过80目筛，按照配比称取原料；
(4)混合：将称量的原料边混合边搅拌，混合成色泽一致，无色差，得到总混合粉；
(5)包装：将混合粉按计量重量进行包装，贴签，装箱，得到成品。
将实施例6得到的调节血脂的复合益生菌固体粉剂进行药效试验。
试验方案：实验方案同实施例5，其中灌胃的样品改为上述益生菌固体粉剂加无菌水制成的悬液，调整菌数约1×109CFU/mL，服用剂量为每天2mL/只。
用上述益生菌固体粉剂的悬液喂养高脂大鼠28天后股静脉抽血检测，结果见图6和图7，发现与对照相比大鼠血液中甘油三酯及胆固醇都有明显下降的情况，植物乳杆菌HG-23在大鼠体内定植并发挥了作用，表明灌胃上述益生菌固体粉剂在大鼠体内确有降低甘油三酯及胆固醇功效。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市华大农业应用研究院
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