一种桃色杆菌JZB09、褐藻胶裂解酶rAly06925及该酶的编码基因与应用
技术领域
本发明涉及一种桃色杆菌JZB09、褐藻胶裂解酶rAly06925及该酶的编码基因与应用，属于生物
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。背景技术
褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸(β-D-Mannuronate,M)和α-L-古洛糖醛酸(α-L-Guluronate,G)两种糖单元通过β-1,4糖苷键随机链接而成的线性阴离子多糖，且M和G在C5位上互为差向异构体[1]。褐藻胶主要产自海带、马尾藻、墨角藻和巨藻等大型褐藻的细胞壁和细胞质间质中[2]。此外，条件致病菌铜绿假单胞菌和某些土壤微生物如棕色固氮菌也能分泌褐藻胶[3,4]，区别在于微生物来源的褐藻胶具有乙酰化修饰[5]。褐藻胶无毒无害，在食品行业里可用于清除体内重金属离子[6]和提高冰激凌的粘稠度[7]，也可用于医药行业里的止血纱布、止血剂和绷带[8]及药物包埋材料[9]。褐藻胶与琼胶、卡拉胶一起，是产量最大、经济价值最高、应用最为广泛的三大海洋多糖。长期以来，褐藻胶的高值化研究一直是海洋生物
技术领域
的重点之一。已有研究表明褐藻胶寡糖使白血病细胞U973的细胞核形态发生改变从而导致细胞凋亡[10]，实现对白血病细胞U973的抑制作用。此外，最新研究表明由聚M段褐藻胶寡糖制备的“甘露寡糖二酸(GV971)”能抑制β-淀粉样蛋白沉淀、细胞毒性和细胞的聚集[11]，可用于治疗轻度、中度阿尔兹海默症(Alzheimer Disease,AD)。因此，具有特定M/G比例和聚合度大小的褐藻胶寡糖具有重要应用价值和经济价值，实现这类寡糖的高效制备具有重要意义。褐藻胶裂解酶是一类多糖裂解酶(Polysaccharide Lyase,PL)，通过β消去反应催化糖苷键的断裂，并在寡糖产物的非还原性末端形成C4＝C5不饱和双键，与C5-位的C＝O(羧羰基)形成共轭结构，从而产生含有不饱和末端(Δ)的寡糖产物并在232nm附近具有特征吸收[12]。褐藻胶裂解酶的来源非常广泛，包括土壤微生物、海洋藻类、海洋软体动物、棘皮动物及多种体表或体内共生的海洋微生物，其中细菌是褐藻胶裂解酶的主要来源[13,14]。然而，受限于天然褐藻胶裂解酶的产量低，转基因褐藻胶裂解酶虽然产量高、但多数酶的水溶性和活性较差等综合因素的影响，迄今，关于酶的底物选择性、底物降解模式与寡糖生成特性的研究较少，仅见G-专一性内切酶Aly5[15]、M-专一性内切酶Pae-AlgL和Avi-AlgL[16]、G-倾向性内切酶Aly1[17]和Aly2[18]等报道。因此整体上不能提供充足的酶学特性信息，导致工具酶匮乏且无法精确应用。尤其在工业上，内切型褐藻胶裂解酶是高效制备系列褐藻胶寡糖产物的工具酶。
发明人的已有研究重点围绕内切型褐藻胶裂解酶进行了分析，并重点阐述了一系列内切型褐藻胶裂解酶的底物选择性、底物降解模式和寡糖生成特性，并通过归纳总结，发现是酶的底物选择性和底物降解模式共同决定了内切酶的寡糖生成特性。已发现寡糖终产物结构特征具有ΔM向ΔG或ΔG向ΔM的演替规律的褐藻胶内切酶[15-18]、专产ΔG末端的富含G片段的单糖外切褐藻胶裂解酶[19]及专产ΔM末端的富含G片段的PL8家族以褐藻胶为最适底物的M-专一性广谱多糖降解酶[20]，但目前未见Persicobacter菌株来源的褐藻胶裂解酶、特性与应用价值的报道，尤其专产ΔM末端终产物的褐藻胶内切酶。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种桃色杆菌JZB09、褐藻胶裂解酶rAly06925及该酶的编码基因与应用。
下面内容中Δ为不饱和单糖、X是指G或M；所述M为β-1,4-D-甘露糖醛酸，G为α-1,4-L-古罗糖醛酸。
褐藻胶裂解酶rAly06925简称“rAly06925”。
该酶能专一性降解来自褐藻胶的甘露糖醛酸寡糖片段，是M-专一型褐藻胶裂解酶。因此推测降解褐藻胶时专一性降解富含M的片段，即M-MMXn、G-MMXn、Δ-MMXn(n≥1，且为自然数；X为G或M)，并高效切割其中-所示糖苷键位置，从而生成非还原末端仅为ΔM的系列不饱和寡糖终产物。因此rAly06925是目前首次报道的专产仅含ΔM末端的内切型褐藻胶裂解酶。据此，可用于彻底降解褐藻胶多糖或寡糖以专一性制备以ΔM为非还原性末端的富含G的系列不饱和寡糖片段。此外，深入探讨该酶其系列突变体对酶活的影响，确定了潜在催化基序为N238-N239-H240-G241-T242-H243，且Y87，Q170，H240，Y295等是关键的催化位点残基。特别的，截除rAly06925的额外肽段K45-N60(即T45-60N，为截除氨基酸序列中从45位到60位的氨基酸)或将Y244突变为除芳香烃氨基酸外的其他氨基酸均导致重组蛋白丧失水溶性，因此额外肽段K45-N60及所含Y244残基对维持蛋白质构象或决定蛋白质表面的亲水性具有关键作用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种桃色杆菌(Persicobacter sp.)JZB09保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏日期2021年4月12日，保藏编号CCTCCM2021354。
“桃色杆菌(Persicobacter sp.)JZB09”简称“桃色杆菌JZB09”。
上述桃色杆菌JZB09的培养方法，包括如下步骤：
(1)将桃色杆菌JZB09接种至液体培养基中，在温度为25～30℃、转速为180～220转/分钟的条件下，培养16～24h，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株按1-3％的体积百分比接种至液体培养基中，在温度为25～30℃、转速为180～220转/分钟的条件下，培养16～24h，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液，按1-5％的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25～30℃、转速为180～220转/分钟的条件下，扩大培养4～6天，制得桃色杆菌JZB09菌液。
根据本发明优选的，所述步骤(1)、(2)、(3)中的液体培养基，每升组分如下：
胰蛋白胨4g/L、酵母提取物2.5g/L、氯化钾7.5g/L、氯化钠20g/L、氯化钙1.1g/L、硫酸镁7.2g/L、氯化铵1.5g/L、余量水，pH 7.0～7.5。
上述桃色杆菌JZB09在制备褐藻胶裂解酶rAly06925中的应用。
上述桃色杆菌(Persicobacter sp.)JZB09在降解褐藻胶或褐藻胶寡糖中的应用。
一种来源于桃色杆菌JZB09的褐藻胶裂解酶rAly06925，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
所述褐藻胶裂解酶rAly06925仅含有一个结构域，即Alginate_lyase。
上述褐藻胶裂解酶rAly06925的编码基因aly06925，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述编码基因aly06925全长1197bp，所编码蛋白质含有399个氨基酸，分子量约为45.6kDa。
一种重组表达载体Ⅰ，包含上述褐藻胶裂解酶rAly06925的编码基因aly06925。
一种重组菌Ⅰ，包含上述褐藻胶裂解酶rAly06925的编码基因aly06925。
上述褐藻胶裂解酶rAly06925的编码基因aly06925、重组表达载体Ⅰ、重组菌Ⅰ在制备褐藻胶裂解酶rAly06925中的应用。
上述褐藻胶裂解酶rAly06925在降解褐藻胶或褐藻胶寡糖中的应用。
根据本发明优选的，上述褐藻胶裂解酶rAly06925在降解褐藻胶或褐藻胶寡糖生产非还原末端含有ΔM的系列富含G不饱和寡糖片段的应用。
根据本发明优选的，上述褐藻胶裂解酶rAly06925在降解褐藻胶或褐藻胶寡糖生产不饱和二糖的应用。
一种褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶，氨基酸突变位点为氨基酸序列SEQ ID NO.2的第48位氨基酸由酪氨酸变为丙氨酸；
优选的，所述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶的编码基因，根据所述氨基酸的突变位点在编码基因SEQ ID NO.1上进行定点突变；
优选的，一种重组表达载体Ⅱ，包含所述突变酶的编码基因；
优选的，一种重组菌Ⅱ，包含所述突变酶的编码基因。
上述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶的编码基因、重组表达载体Ⅱ、重组菌Ⅱ在制备褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶中的应用。
上述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶在降解褐藻胶或褐藻胶寡糖中的应用。
根据本发明优选的，上述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶在降解褐藻胶或褐藻胶寡糖生产非还原末端含有ΔM的系列富含G不饱和寡糖片段的应用。
一种褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶，氨基酸突变位点为氨基酸序列SEQ ID NO.2的第53位氨基酸由异亮氨酸变为丙氨酸、第52位氨基酸由苯丙氨酸变为丙氨酸、第115位氨基酸由组氨酸变为丙氨酸、第118位氨基酸由苯丙氨酸变为丙氨酸、第119位氨基酸由天冬酰胺变为丙氨酸或者第243位氨基酸由组氨酸变为丙氨酸。
优选的，所述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶的编码基因，根据所述氨基酸的突变位点在编码基因SEQ ID NO.1上进行定点突变；
优选的，一种重组表达载体Ⅲ，包含所述突变酶的编码基因；
优选的，一种重组菌Ⅲ，包含所述突变酶的编码基因。
上述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶的编码基因、重组表达载体Ⅲ、重组菌Ⅲ在制备褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶中的应用
上述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶在降解褐藻胶或褐藻胶寡糖中的应用。
根据本发明优选的，上述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶在降解褐藻胶或褐藻胶寡糖生产非还原末端含有ΔM的系列富含G不饱和寡糖片段的应用。
一种褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶，氨基酸突变位点为截除氨基酸序列SEQ IDNO.2中第1位到第65位氨基酸；
优选的，所述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶的编码基因，根据所述氨基酸的突变位点在编码基因SEQ ID NO.1上进行定点突变；
优选的，一种重组表达载体Ⅳ，包含所述突变酶的编码基因；
优选的，一种重组菌Ⅳ，包含所述突变酶的编码基因。
上述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶的编码基因、重组表达载体Ⅳ、重组菌Ⅳ在制备褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶中的应用。
上述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶在降解褐藻胶或褐藻胶寡糖中的应用。
一种褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶，氨基酸突变位点为截除氨基酸序列SEQ IDNO.2中第45位到第60位氨基酸；
优选的，所述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶的编码基因，根据所述氨基酸的突变位点在编码基因SEQ ID NO.1上进行定点突变；
优选的，一种重组表达载体Ⅴ，包含所述突变酶的编码基因；
优选的，一种重组菌Ⅴ，包含所述突变酶的编码基因。
上述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶的编码基因、重组表达载体Ⅴ、重组菌Ⅴ在制备褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶中的应用。
上述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶在降解褐藻胶或褐藻胶寡糖中的应用。
一种褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶，氨基酸突变位点为氨基酸序列SEQ ID NO.2中第244位氨基酸突变为除芳香烃氨基酸外的其他氨基酸；
优选的，所述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶的编码基因，根据所述氨基酸的突变位点在编码基因SEQ ID NO.1上进行定点突变；
优选的，一种重组表达载体Ⅵ，包含所述突变酶的编码基因；
优选的，一种重组菌Ⅵ，包含所述突变酶的编码基因。
上述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶的编码基因、重组表达载体Ⅵ、重组菌Ⅵ在制备褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶中的应用。
上述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶在降解褐藻胶或褐藻胶寡糖中的应用。
所述氨基酸序列SEQ ID NO.2中第1位到第65位氨基酸为Met1～Ala65。
所述氨基酸序列SEQ ID NO.2中第45位到第60位氨基酸为K45-N60，即Lys45～Asn60。
上述褐藻胶裂解酶rAly06925的非催化域T65N(T65N为氨基酸序列中Met1～Ala65非催化域部分)在维持蛋白质构象或决定蛋白质表面的亲水性和发挥催化功能都起到了不可或缺的作用。
上述褐藻胶裂解酶rAly06925的催化基序为N238-N239-H240-G241-T242-H243，且Y87，Q170，H240，Y295等是关键的催化位点残基。特别的，截除rAly06925的额外肽段K45-N60或将Y244突变为除芳香烃氨基酸外的其他氨基酸均导致重组蛋白丧失水溶性，因此额外肽段K45-N60及所含Y244残基对维持蛋白质构象或决定蛋白质表面的亲水性具有关键作用。
有益效果
1、本发明首次公开了由桃色杆菌(Persicobacter sp.)JZB09的基因组中获得一种褐藻胶裂解酶rAly06925，首次报道桃色杆菌属来源的褐藻胶裂解酶其特性与应用价值，同时也是首次报道的专产仅含ΔM末端的内切型褐藻胶裂解酶，该酶与现有已知褐藻胶裂解酶具有显著差异，理化性质稳定、活性高，具备工业应用的潜质。
2、本发明所制备的褐藻胶裂解酶rAly06925降解褐藻胶酶活力为135U/mg，适用于系列不饱和寡糖的生产。
3、本发明制备的褐藻胶裂解酶rAly06925，在降解由M、G随机混合组成的褐藻胶多糖时，只能专一性识别M-MMXn、G-MMXn、Δ-MMXn(n≥1，且为自然数；X，M或G)等富含M的基序，并高效切割其中–所示糖苷键位置，从而生成非还原末端仅为ΔM的系列不饱和寡糖终产物。因此，可用于降解褐藻胶或褐藻胶寡糖生产非还原末端含有ΔM的系列富含G不饱和寡糖片段和不饱和单糖Δ。
4、本发明制备的褐藻胶裂解酶rAly06925的系列突变体，揭示了该酶的催化基序为N238-N239-H240-G241-T242-H243，且Y87，Q170，H240，Y295等是关键的催化位点残基。特别的，截除rAly06925的额外肽段K45-N60或将Y244突变为除芳香烃氨基酸外的其他氨基酸均导致重组蛋白丧失水溶性，因此额外肽段K45-N60及所含Y244残基对维持蛋白质构象或决定蛋白质表面的亲水性具有关键作用。初步确定了褐藻胶裂解酶rAly06925的保守基序N238-N239-H240-G241-T242-H243和关键活性位点残基Y87，Q170，H240，Y295，Y244，发现这与已鉴定褐藻胶裂解酶家族均不同，提示其催化机理新颖，有待于结构生物学研究加以详细解释。这对新型褐藻胶裂解酶家族及保守基序的认知进行了有效的补充，为相关的酶学研究提供了一定的理论启示。
附图说明
图1、褐藻胶裂解酶rAly06925功能模块构成的BLASTp分析结果图(A)与部分已鉴定功能表征及未鉴定功能表征的一致性较高的褐藻胶裂解酶系统进化分析图(B)；
图中：Aly06925为褐藻胶裂解酶rAly06925；
Aly06925-T65N为截短体rAly06925-T65N。
图2、褐藻胶裂解酶rAly06925与目前未知功能的一致性较高的褐藻胶裂解酶多序列比对分析图；
图中：Aly06925为褐藻胶裂解酶rAly06925。
图3、褐藻胶裂解酶rAly06925与截短体rAly06925-T65N的表达及纯化情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)图；
图中：A为褐藻胶裂解酶rAly06925
M、蛋白质分子量标准，条带自上而下大小分别是：116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD；泳道1、对照菌株破壁后全菌液，上样量4μL；泳道2、重组菌破壁后全菌液，上样量4μL；泳道3重组菌破壁后上清，上样量4μL；泳道4、经镍柱纯化的rAly06925，上样量2μL；
B为截短体rAly06925-T65N
M、蛋白质分子量标准，条带自上而下大小分别是：116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD；泳道1、对照菌株破壁后全菌液，上样量4μL；泳道2、重组菌破壁后全菌液，上样量4μL；泳道3重组菌破壁后上清，上样量4μL；泳道4、经镍柱纯化的截短体rAly06925-T65N，上样量2μL。
图4、褐藻胶裂解酶rAly06925和截短体rAly06925-T65N酶活检测的HPLC分析图；
图中：UDP2，不饱和二糖；UDP3，不饱和三糖；UDP4，不饱和四糖；UDP5，不饱和五糖；UDP6，不饱和六糖；E(-)为不加酶的阴性对照。
图5、温度对褐藻胶裂解酶rAly06925活性的影响曲线图。
图6、温度对褐藻胶裂解酶rAly06925稳定性的影响曲线图。
图7、pH值对褐藻胶裂解酶rAly06925活性的影响曲线图。
图8、pH值对褐藻胶裂解酶rAly06925稳定性的影响曲线。
图9、金属离子及化学试剂对褐藻胶裂解酶rAly06925活性的影响柱形图。
图10、NaCl浓度对褐藻胶裂解酶rAly06925活性的影响曲线。
图11、褐藻胶裂解酶rAly06925降解褐藻胶过程中寡糖产物的分子凝胶色谱-HPLC分析图。
图12、用褐藻胶裂解酶rAly06925完全降解褐藻胶后所制备的不饱和寡糖片段UDP2、UDP3、UDP4、UDP5、UDP6的HPLC分析图(A)及1H-NMR分析图(B)。
图13、褐藻胶裂解酶rAly06925完全降解系列饱和寡糖M3-M7(A)及G5(B)的HPLC分析图。
图14、褐藻胶裂解酶rAly06925完全降解还原性末端被2-AB标记的饱和寡糖M3-M6的HPLC分析图；
图中：(-)为不加酶的阴性对照。
图15、用褐藻胶裂解酶rAly06925降解特征不饱和寡糖UDP3-UDP6的HPLC检测图。
图16、褐藻胶裂解酶rAly06925三维模拟结构(A)及对比图(B)图；
图B中：红色为rAly06925，绿色为PL5中已鉴定结构的Pae-AlgL，黄色为rAly06925多出的额外肽段(T45-60N)。
图17、褐藻胶裂解酶rAly06925截短体T45-60N及其系列突变体的相对酶活分析柱形图。
图18、褐藻胶裂解酶rAly06925突变体I53A降解终产物的HPLC(A)及1H-NMR(B)分析图。
具体实施方式
以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中各参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本发明中分子量是指重均分子量，温度是摄氏度。
生物材料来源
桃色杆菌(Persicobacter sp.)JZB09保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏日期2021年4与12日，保藏编号CCTCC M2021354。
本发明所用褐藻胶购买自Sigma，咪唑购买自Amresco，邻氨基苯甲酰胺购买自Sigma-aldrich，褐藻胶系列饱和寡糖购买自青岛博智汇力生物科技有限公司。
实施例1
桃色杆菌(Persicobacter sp.)JZB09菌株基因组DNA的提取
本发明人于2009年10月自青岛胶州湾红岛附件滩涂采集海泥样品，并利用唯一碳源法筛选得一株多糖降解菌JZB09，经分子鉴定为桃色杆菌(Persicobacter sp.)JZB09。将桃色杆菌(Persicobacter sp.)JZB09菌株接种至M10液体培养基中，28℃、200rpm条件下，振荡培养至600nm吸光值(OD600)为1.18；取培养菌液20mL，28℃、12,000×g(g，地球引力常数)条件下离心20min，收集菌体沉淀。
上述M10液体培养基，其组成为：胰蛋白胨4g/L、酵母提取物2.5g/L、氯化钾7.5g/L、氯化钠20g/L、氯化钙1.1g/L、硫酸镁7.2g/L、氯化铵1.5g/L、余量水，pH 7.2。
向上述菌体沉淀中，加入溶菌酶缓冲液12.0mL，得到约14.0mL的菌液，分别加入浓度为20mg/mL的溶菌酶560μL，其终浓度约800μg/mL；置于冰水浴中1.0h，然后转移至37℃水浴中，温浴2h，至反应体系粘稠；加入浓度为100mg/mL的十六烷基磺酸钠溶液0.82m L、100mg/m L的蛋白酶K溶液60μL，在52℃温浴1.0h；加入Tris-平衡过的酚/氯仿/异戊(体积比25：24：1)15mL，轻轻颠倒混匀，至充分乳化；在10,000×g、4℃条件下离心10min，收集上清，并加入2.0m L的NaAc-HAc(pH 5.2,3.0M)缓冲液，以及17.0mL的无水乙醇(贮于-20℃)，充分混匀；用枪头挑出丝状DNA，转移至1.5m L的离心管中，以70％乙醇，洗涤2次，微离心后弃掉上清；在10,000×g、4℃条件下离心2min，彻底弃掉上清；将DNA沉淀于无菌工作台中风吹干燥，然后用无菌去离子水在4℃过夜溶解DNA样品，制得基因组DNA。
实施例2
桃色杆菌(Persicobacter sp.)JZB09菌株基因组的扫描及其序列分析
采用焦磷酸测序技术进行实施例1制得的基因组DNA的扫描测序，由上海美吉生物公司完成。用NCBI(National Center for Biotechnology Informationh,ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站的在线软件对DNA测序结果进行分析。所用到的NCBI网站的分析软件是Open Reading Frame Finder(ORF Finder,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和Basic Local Alignment Search Tool(BLAST,http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。
用上述生物学软件分析的结果显示，桃色杆菌(Persicobacter sp.)JZB09菌株基因组DNA上携带1个候选的褐藻胶裂解酶基因aly06925，编码的褐藻胶裂解酶rAly06925全长1197bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，共含有399个氨基酸，且N-端1-18位氨基酸为Ⅰ型信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。用BLAST软件在线分析，结果显示，褐藻胶裂解酶rAly06925含有一个假定结构域，即Alginate_Lyase superfamily(如图1-A所示)，且与已鉴定褐藻胶裂解酶(Azotobacter vinelandii来源的PL-5家族的AlgL)的序列一致性最大，为9％。系统发育树分析则表明，rAly06925与PL-5和PL-17家族亲缘关系最近(如图1-B所示)，但与已鉴定的PL-5或PL-17家族成员均不聚类，而是与未鉴定功能表征的褐藻胶裂解酶聚集成簇，且位于分支内部，因此应归类于一个未见报道的多糖裂解酶新家族。根据与目前未鉴定功能表征的序列一致性较高的褐藻胶裂解酶进行多序列对比发现，rAly06925含有两个潜在的催化基序(如图2所示)，即分别为N238-N239-H240-G241-T242-H243、N113-N114-H115-T116-D117-F118。
实施例3
基因aly06925及截短体aly06925-T65N在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中的重组表达
以实施例1制得的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物序列如下：
正向引物rAly06925-F：5’-gCATATGCAAAAAACCATTTCATTAACGG-3’(Nde I)，SEQ IDNO.3；
反向引物rAly06925-R：5’-gCTCGAGTTGGAAAAACGCTTCCACGAAATTCC-3’(Xho I)，SEQ ID NO.4；
正向引物rAly06925-T65N-F：5’-GTTACGCATAAAACGGGTGTTCCACC-3’，SEQ IDNO.5；
反向引物rAly06925-T65N-R：5’-CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3’，SEQ IDNO.6。
正向引物rAly06925-F中下划线标注的是限制性内切酶Nde I位点，反向引物rAly06925-R下划线标注的是限制性内切酶Xho I位点。所用高保真DNA聚合酶PrimeSTARHS DNA Polymer购自中国大连宝生物公司，所用PCR反应试剂按照该公司提供的产品说明进行操作。
PCR反应条件：94℃预变性5min；98℃变性30秒；65℃退火30s；72℃延伸170s；35个循环；72℃延伸10min；5℃稳定10min。
将PCR产物与pEASY-Blunt simple vector进行连接，并转化至大肠杆菌Trans1-T1菌株，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养16h后，挑取单克隆；将单克隆接入含有50μg/mL卡那霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；将质粒用扩增引物进行PCR验证；将验证正确的重组质粒用Nde I和Xho I双酶切并与同样经过双酶切的pET30a质粒载体，在DNA连接酶的催化下进行连接；连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，涂布于含有100μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养16h后，挑取单克隆；将单克隆接入含有100μg/mL卡那霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；对质粒进行双酶切验证，结果得到大小方向正确的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒进行测序，结果表明，在pET30a质粒的Nde I和Xho I酶切位点之间插入SEQ ID NO.1所示的基因aly06925，且插入方向正确，所以进一步证明构建重组质粒正确，并将该重组质粒命名为pET30a-Aly06925。
为验证该褐藻胶裂解酶rAly06925的非催化域功能，对图1所示褐藻胶裂解酶rAly06925功能模块进行T65N(截除氨基酸序列中Met1～Ala65非催化域部分)截短。为获得截短体rAly06925-T65N的重组质粒，以重组质粒pET30a-Aly06925为模板，以rAly06925-T65N-F和rAly06925-T65N-R引物进行PCR扩增，将PCR产物胶回收后，进行末端磷酸化和环化连接；连接产物转化至大肠杆菌DH5α，涂布于含有50μg/mL Kana的LB培养基固体平板上，37℃培养14h，挑取单克隆；将单克隆接入含有50μg/mL Kana的液体LB培养基中培养，37℃震荡培养12h；用扩增引物进行PCR验证，初步证明构建的重组质粒正确，并运用质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)进行质粒提取；接着将该重组质粒进行测序，以验证重组质粒中插入正确大小和方向目的片段，将构建成功的重组质粒命名为pET30a-Aly06925-T65N。但经诱导表达后为包涵体，于是用限制性内切酶Nde I和Xho I对重组质粒pET30a-Aly06925-T65N进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物片段；同样以限制酶Nde I和XhoI酶切pCold TF质粒，也进行琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物片段，之后在DNA连接酶的催化下是两种片段进行连接；将连接产物转化至大肠杆菌DH5α，涂布于含有50μg/mLAmp的LB培养基固体平板上，37℃倒置培养14h，挑取单克隆；将单克隆接入含有50μg/mLAmp的液体LB培养基中，37℃震荡培养12h；用扩增引物进行PCR验证，初步证明构建的重组质粒正确，并运用质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)进行质粒提取；接着将该重组质粒进行测序，以验证重组质粒中插入基因序列的大小和方向，将构建成功的重组质粒命名为pColdTF-Aly06925-T65N。
将重组质粒pET30a-Aly06925、pET30a和pCold TF-Aly06925-T65N转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自美国Invitrogen公司)，然后按照该公司提供的操作步骤，使用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行褐藻胶裂解酶rAly06925和截短体rAly06925-T65N的诱导表达。在8,000×g、4℃条件下离心15min，收集菌体，并用缓冲液A重悬菌体，冰水浴环境中超声破碎。在15,000×g、4℃条件下进一步离心30min，收集水溶性组分，并用Ni-琼脂糖凝胶对褐藻胶裂解酶rAly06925及rAly06925-T65N进行纯化。用含有咪唑浓度为10、50、250、500mM的缓冲液A(50mM Tris，150mM NaCl，pH 8.0)进行梯度洗脱，纯化条件按照凝胶的产品手册操作。用聚丙烯酰胺凝变性胶电泳检测重组酶的纯化情况。结果如图3-A所示：重组质粒pET30a-Aly06925在E.coli BL21(DE3)菌株中经IPTG诱导表达后，水溶性产物占95％，经镍柱亲和层析纯化后的褐藻胶裂解酶rAly06925在电泳上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合；将纯化后的褐藻胶裂解酶rAly06925和rAly06925-T65N样品装入最小分子截留量为10kDa的透析袋，在4℃环境中进行透析，制得的褐藻胶裂解酶rAly06925酶液，酶液浓度为3μg/μL和截短体rAly06925-T65N酶液，酶液浓度为2μg/μL，并以此酶液进行后续实验。
实施例4
褐藻胶裂解酶rAly06925及截短体rAly06925-T65N的活性验证
将用去离子水配制质量体积浓度为12g/L的褐藻胶底物溶液与实施例3制得的褐藻胶裂解酶rAly06925酶液或截短体rAly06925-T65N酶液、150mM的HAc-NaAc(pH 6.0)缓冲液以1：1：1(体积比)的比例混合后30℃反应4h。将反应产物在沸水浴中加热10min灭活酶，转入冰水浴中5min，在12,000×g、4℃条件下离心15min，收集上清并进行HPLC分析。用浓度为0.20M的NH4HCO3溶液，平衡Superdex Peptide 10/300GL(GE公司)分子凝胶色谱柱，流速0.40mL/min，至少2柱床。将部分上述所得的反应液上清，以自动进样器加载20μg/样品，其它条件不变，232nm检测。
结果如图4所示，褐藻胶裂解酶rAly06925能够较好地降解褐藻胶，但褐藻胶裂解酶rAly06925的截短体rAly06925-T65N不能降解褐藻胶，这表明rAly06925的非催化域在维持蛋白质构象或决定蛋白质表面的亲水性和发挥催化功能中都起到了不可或缺的作用。此外，通过DNS还原糖法测定，rAly06925的酶活力约为135U/mg。
实施例5
褐藻胶裂解酶rAly06925最适温度的测定
用去离子水配制质量体积浓度为12g/L的褐藻胶底物，灭菌后冷却至室温，置于0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴环境孵育30min。向每100μL底物溶液中添加30μL实施例3制得的褐藻胶裂解酶rAly06925、100μL的150mM HAc-NaAc(pH 6.0)缓冲液及70μL去离子水，混匀后继续反应4h。每个温度条件下3个平行样品，以沸水浴灭活的重组酶制剂为对照组。用DNS-还原糖法测定各个反应体系中新生成还原糖的浓度(OD540)，并计算平均值，进行偏差分析。最大吸收值对应的反应温度为重组酶的最适温度，相对酶活(RA)定义为：各吸收值与最大吸收值的百分比。
结果如图5所示：以褐藻胶为底物测定酶活时，褐藻胶裂解酶rAly06925在35℃反应时达到最大活力，这表明褐藻胶裂解酶rAly06925的最适反应温度是35℃。与其他温度相比，褐藻胶裂解酶rAly06925只在30℃-35℃时，相对酶活大于80％，推测褐藻胶裂解酶rAly06925是一个适应海洋环境的褐藻胶裂解酶。
实施例6
褐藻胶裂解酶rAly06925的温度稳定性分析
将实施例3制得的褐藻胶裂解酶rAly06925在不同温度(0～60℃)下分别处理0.5h、1h、2h、4h、12h、24h后，分别与用蒸馏水配制的质量体积浓度为12g/L的褐藻胶底物按体积比1：9的比例混合，然后在最适温度下各反应4h并测定残余酶活，每个温度下设置3个平行样品，以沸水浴灭活的褐藻胶裂解酶制剂为对照组。以不经过热处理的酶液酶活定义为100％相对活力。
结果如图6所示：在低于20℃的温度下预处理12h或30℃下预处理2h后，褐藻胶裂解酶rAly06925仍然具有大于50％的残余酶活；而在40℃以上预处理2h后，褐藻胶裂解酶rAly06925的残余酶活急剧降低，且温度越高下降越快，这表明褐藻胶裂解酶rAly06925具有一定的热稳定性。
实施例7
褐藻胶裂解酶rAly06925最适pH及稳定性的测定
分别用浓度为50mM的NaAc-HAc缓冲液、NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、Tris-HCl缓冲液，分别与褐藻胶配制质量体积浓度为12g/L的褐藻胶底物，所对应的pH值分别为5、6，6、7、8，8、9、10三个区段，各pH值均在最适温度下调定。将底物溶解后置于最适温度中孵育30min，向每100μL底物溶液中添加30μL实施例3制得的褐藻胶裂解酶rAly06925、100μL的以上各缓冲液及70μL去离子水，混匀后继续反应4h。每个pH条件下3个平行样品，以沸水浴灭活的褐藻胶裂解酶制剂为对照组。用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成的还原糖浓度(OD540)，并计算平均值，进行偏差分析。最大吸收值对应的反应pH为褐藻胶裂解酶的最适pH，相对酶活(RA)定义为：各吸收值与最大吸收值的百分比。
同时将30μL实施例3制得的褐藻胶裂解酶rAly06925与100μL上述各缓冲液混匀，置于在35℃环境中分别孵育2h后，与100μL质量体积浓度为12g/L的褐藻胶底物混合，置于最适温度下各反应4h并测定残余酶活。每个pH条件下3个平行样品，以沸水浴灭活的褐藻胶裂解酶制剂为对照组。用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成的还原糖浓度(OD540)，并计算平均值，进行偏差分析。以不经过预处理的酶液酶活定义为100％相对活力。
结果如图7所示，褐藻胶裂解酶rAly06925的最适反应pH为6.0，在pH偏酸或偏碱性环境中，rAly06925的活性急剧下降，这些结果显示该酶适应中性偏酸的缓冲条件，不适应强酸或强碱等恶劣环境。经过不同缓冲液预处理2h后，褐藻胶裂解酶rAly06925在pH6.0-8.0的范围内，酶活仍保持50％以上；而在pH5.0、pH9.0、pH10.0褐藻胶裂解酶rAly06925的残余酶活急剧降低，低于20％，这表明褐藻胶裂解酶rAly06925具有一定的pH耐受性，且较适应于中性环境，如图8所示。
实施例8
金属离子和化学试剂对褐藻胶裂解酶rAly06925活性的影响
将用去离子水配制质量体积浓度为12g/L的褐藻胶底物、实施例3制得的褐藻胶裂解酶酶rAly06925、以及水按体积比5：1：4的比例混合后制得反应体系，接着向反应体系中添加不同的金属离子或化学试剂，至其终浓度为1mM或10mM，然后在35℃反应4h，每个样品设置3个平行组。按前述的DNS-还原糖法测定酶的活力。对照组为不加任何金属离子或化学试剂时rAly06925的活性，设定为100％。
结果如图9所示，1mM Ca2+、1mM DTT(二硫苏糖醇)对褐藻胶裂解酶rAly06925的酶活具有明显促进作用，约提高了25％的相对酶活；K+、Li+、Na+、Mg2+和化学试剂Glyerol对褐藻胶裂解酶rAly06925的酶活无明显影响；而在1mM或10mM浓度下，Ag+、Cu2+、Hg2+、Cr3+、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+等重金属离子和化学试剂SDS、EDTA、imidazole(咪唑)对褐藻胶裂解酶rAly06925的酶活具有显著抑制作用；此外1mM Co2+、10mM Pb2+也对褐藻胶裂解酶rAly06925的酶活具有显著抑制作用。
实施例9
NaCl对褐藻胶裂解酶rAly06925活性的影响
用去离子水配制5M的NaCl母液，向每100μL底物溶液中添加30μL实施例3制得的褐藻胶裂解酶rAly06925、100μL的150mM HAc-NaAc(pH 6.0)缓冲液，再加入70μL以适量去离子水稀释后的NaCl母液，使反应体系中NaCl终浓度分别为0M、0.2M、0.4M、0.6M、0.8M和1M，置于最适温度下各反应4h，每个浓度下设置3个平行组，并以沸水浴灭活的酶制剂为对照组。按前述的DNS-还原糖法测定酶的活力。对照组为不加NaCl时rAly06925的活性，设定为100％。
结果如图10所示，在NaCl的浓度为0-0.2M时，褐藻胶裂解酶rAly06925的酶活随NaCl浓度的升高而升高；但当NaCl的浓度为0.2-1.0M时，褐藻胶裂解酶rAly06925的酶活随NaCl浓度的升高而降低；其中0.2M NaCl对褐藻胶裂解酶rAly06925具有最高的促进作用，使其相对酶活提高约60％，在0～0.6M的范围内，褐藻胶裂解酶rAly06925酶活保持在50％以上；这表明褐藻胶裂解酶rAly06925具有一定的NaCl耐受性。
实施例10
褐藻胶裂解酶rAly06925降解褐藻胶的产物高效液相(HPLC)分析
取去离子水配制质量体积浓度为12g/L的褐藻胶和150mM的NaAc-HAc(pH 6.0)缓冲液各100μL，加入70μL去离子水混匀后置于35℃温育1h。并添加30μL实施例3制得的褐藻胶裂解酶rAly06925，混匀后继续反应，隔时取样。将反应产物在沸水浴中加热10min，转入冰水浴中5min。在12,000×g、4℃条件下离心15min，收集上清。
用浓度为0.20M的NH4HCO3溶液，平衡Superdex Peptide 10/300GL(GE公司)分子凝胶色谱柱，流速0.40mL/min，至少2柱床。将上述褐藻胶酶解的样品，以自动进样器加载20μg/样品，其它条件不变，232nm检测。用HPLC操作软件，分析各寡糖组分的积分面积，计算相对摩尔浓度。如图11所示，在上述条件下，褐藻胶裂解酶rAly06925在降解褐藻胶底物时，最初产生了较大分子量的寡糖，随反应时间的延长，具有235nm特征吸收峰的寡糖产物含量逐渐增加，且最终趋于稳定。最终反应的主产物是HPLC检测中出峰时间为41.8’、39.1’、36.5’、34.7’和33.4’的五种寡糖产物，参照分子量标准物的出峰时间后，确定各寡糖产物分别对应UDP2、UDP3、UDP4、UDP5、UDP6，其摩尔比约为6:4:3:2:1。以上表明褐藻胶裂解酶rAly06925是一个内切型褐藻胶裂解酶。
实施例11
褐藻胶裂解酶rAly06925降解褐藻胶终产物的1H-NMR波谱分析
按照最适反应体系，用褐藻胶裂解酶rAly06925彻底降解36mg褐藻胶，待反应完成后，对样品进行一系列处理，得上清过滤液。用分子凝胶色谱柱SuperdexTMPeptide 10/300GL(GE公司)对褐藻胶裂解酶rAly06925完全降解褐藻胶的终产物进行分离、纯化，合并后HPLC检测纯度，色谱条件参照实例10。如图12-A所示，终产物纯度在99％以上。随后经冷冻干燥脱盐、重水完成氢氘置换后，进行1H-NMR检测分析上述寡糖产物的结构特征。结果如图12-B所示，系列不饱和寡糖产物均在5.57ppm处具有特征性吸收峰，只发现了ΔM信号峰，未发现ΔG信号峰。这表明rAly06925降解M/G聚段褐藻胶所得最终寡糖产物的非还原端均为ΔM结构。
实施例12
褐藻胶裂解酶rAly06925降解褐藻胶饱和寡糖底物降解特性
为进一步揭示rAly06925这种寡糖生成特性，系统分析该酶的底物选择性及寡糖底物降解模式。各取等摩尔量饱和寡糖包括聚M段寡糖(M3～M7)、聚G段寡糖(G3～G7)的溶液，与褐藻胶裂解酶rAly06925于最适条件下反应24h，对反应液处理后进行HPLC检测，参照分子量标准物，确定各寡糖产物聚合度，分析各寡糖组分的积分面积，并计算相对摩尔浓度，色谱条件参照实例10。结果如图13-A所示，对M系列饱和寡糖降解显著，但不能降解M3。在降解M7、M6、M5时主要产生UM2和UM3以及部分UM4，降解M4主要产生UM3和部分UM2。对G系列饱和寡糖不降解(此处仅展示褐藻胶裂解酶rAly06925对G5降解后的检测结果)，如图13-B所示。
上述结果表明褐藻胶裂解酶rAly06925是M-专一性的褐藻胶内切酶，M4是褐藻胶裂解酶rAly06925的最小饱和寡糖底物，M是rAly06925的最小饱和寡糖产物。
实施例13
褐藻胶裂解酶rAly06925降解荧光标记的褐藻胶饱和寡糖底物降解特性
取约10μg饱和聚M寡糖，加入含过量邻氨基苯甲酰胺(2-AB)、硼氢化钠的二甲基亚枫(DMSO)溶液，混匀后置60℃水浴中温育2h。旋转蒸干，加入500μL去离子水溶解样品，将样品与200μL氯仿共振荡，离心，收集上清。继续用氯仿反复抽提，不少于7次，得到还原性末端被荧光标记了的反应液。以还原性末端被荧光标记的饱和聚M三糖(2AB-M3)、四糖(2AB-M4)、五糖(2AB-M5)、六糖(2AB-M6)为底物。将底物与褐藻胶裂解酶rAly06925于最适条件下反应24h。对反应物处理后进行HPLC检测，参照分子量标准物，确定各寡糖产物的相对分子量，分析各寡糖组分的积分面积，并计算相对摩尔浓度。HPLC检测条件：色谱柱：SuperdexTMPeptide 10/300GL；检测器：荧光检测器，激发波长Ex 330nm，检测波长Em 420nm；流动相：0.2M NH4HCO3。
如图14所示，褐藻胶裂解酶rAly06925降解2AB-M6时，主产物为2AB-UM3和2AB-UM4，摩尔比约为1.4:1，还产生少量2AB-UM5和2AB-UM2。降解2AB-M5时，主产物为2AB-UM3和2AB-UM4，摩尔比约为2:1，还产生少量2AB-UM2，此外不完全降解2AB-M4时，主产物为2AB-UM3，但不降解2AB-M3。
上述结果表明2AB-M4是rAly06925的最小人工合成M系列饱和寡糖底物，M是最小饱和寡糖产物，具有可变的底物降解模式。还原端的2-AB标记对该酶活性影响不显著，且表明酶是从褐藻胶底物的非还原端进行降解。
实施例14
褐藻胶裂解酶rAly06925降解褐藻胶不饱和寡糖底物降解特性
为了进一步研究该酶的酶学性质，根据课题组已有的实验基础，我们用M-倾向性褐藻胶单糖外切酶Aly6[19]不完全降解褐藻胶，使用分子凝胶色谱柱SuperdexTM Peptide10/300GL(GE公司)对降解产物进行分离、纯化，制备了系列仅以ΔG为非还原性末端的特征寡糖产物。将上述寡糖片段与褐藻胶裂解酶rAly06925于最适条件下反应24h，对反应液处理后进行HPLC检测，色谱条件参照实例10。
如图15所示，褐藻胶裂解酶rAly06925部分降解UDP6之后产生UDP4、UDP3和UDP2，微量降解UDP5之后产生UDP4和不饱和单糖(Δ)，不降解UDP4和UDP3。结果表明，褐藻胶裂解酶rAly06925以内切模式降解不饱和寡糖，最小不饱和寡糖底物是UDP5，但降解非常微弱，推测是由于上述系列不饱和寡糖是由Aly6不完全降解褐藻胶所得，其非还原性末端经鉴定均为ΔG单元，这与褐藻胶裂解酶rAly06925是M-专一性褐藻胶裂解酶结果相一致。
进一步地，结合图11、图12、图13及图15，推测褐藻胶裂解酶rAly06925降解褐藻胶时的寡糖生成特性由底物选择性和底物降解模式共同决定：rAly06925降解褐藻胶多糖底物时，专一性降解富含M的区域，即M-MMXn、G-MMXn、Δ-MMXXn(n≥1，且为自然数；X，G或M)等，并高效切割其中-所示糖苷键位置，从而生成非还原末端仅为ΔM的系列不饱和寡糖终产物。
实施例15
褐藻胶裂解酶rAly06925同源建模
通过生物信息学分析，我们发现褐藻胶裂解酶rAly06925的序列新颖，氨基酸序列与已鉴定褐藻胶裂解酶(Azotobacter vinelandii来源的PL5家族的AlgL)的最大一致性只有9％。另外，褐藻胶裂解酶rAly06925进化地位特殊，虽与PL5和PL17家族亲缘关系最近，但与已鉴定的PL5或PL17家族成员均不聚类，而是单独成支。通过多序列比对分析，我们发现在褐藻胶裂解酶rAly06925序列中存在两组候选基序NNH(N113-N114-H115和N238-N239-H240)，与已报道的PL5的保守序列(NNHSYW)不完全相同，无法通过生物信息学分析指认其中令人信服的关键催化位点残基，也无法直接进行家族归类，且未见同类研究报道。此外，我们推测rAly06925可能含有除NNH以外的其他关键氨基酸残基。因此，运用SWISS-MODEL在线对其三维结构模型进行了模拟，以PL5中已鉴定结构的Pae-AlgL与AI-Ⅲ为模板进行三维模拟，如图16-A所示，rAly06925由许多α-螺旋结构组成且具有α/α套筒结构，与Pseudomonasaeruginosa和Azotobacter vinelandii来源的PL5家族已鉴定褐藻胶裂解酶AlgL结构相似，并含有一个隧道状的催化腔，推测是其发挥褐藻胶裂解酶活性的基础。通过PyMOL软件比较发现：rAly06925多出了一个α-螺旋(K45-N60)以及一些假定关键氨基酸残基(Y48、F52、I53、Y87、H115、F118、N119、Q170、H240、H243、Y244、Y295)，如图16-B所示。
实施例16
褐藻胶裂解酶rAly06925分子改造与催化机理研究
为了获得褐藻胶裂解酶rAly06925截短体T45-60N的重组质粒，以重组质粒pET30a-Aly06925为模板，以Aly06925-T45-60N-F和Aly06925-T45-60N-R为引物进行PCR扩增，将PCR产物胶回收后，进行5’末端磷酸化和运用T4 DNA ligase进行连接；将连接产物转化至大肠杆菌DH5α，涂布于含有50μg/mL Kana的LB培养基固体平板上，37℃培养14h，挑取单克隆；将单克隆接入含有50μg/mL Kana的液体LB培养基中培养，37℃震荡培养12h；用扩增引物进行PCR验证，初步证明构建的重组质粒正确，并运用质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)进行质粒提取；接着将该重组质粒进行测序，以验证重组质粒中插入正确大小和方向的目的片段，将构建成功的重组质粒命名为pET30a-Aly06925-T45-60N。但经诱导表达后呈包涵体的形式，同样的以限制性内切酶Nde I和Xho I对重组质粒pET30a-Aly06925-T45-60N进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物片段；同样以限制酶Nde I和Xho I酶切pColdTF质粒，也进行琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物片段，之后在DNA连接酶的催化下是两种片段进行连接；将连接产物转化至大肠杆菌DH5α，涂布于含有50μg/mLAmp的LB培养基固体平板上，37℃倒置培养14h，挑取单克隆；将单克隆接入含有50μg/mLAmp的液体LB培养基中，37℃震荡培养12h；用扩增引物进行PCR验证，初步证明构建的重组质粒正确，并运用质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)进行质粒提取；接着将该重组质粒进行测序，以验证重组质粒中插入基因序列的大小和方向，将构建成功的重组质粒命名为pColdTF-Aly06925-T45-60N。
为了获得褐藻胶裂解酶rAly06925系列突变体的重组质粒，以重组质粒pET30a-Aly06925为模板，使用相应突变引物(表1)，运用高保真酶Phanta Max Super-FidelityDNA Polymerase进行PCR扩增，得扩增片段；利用酶DpnI去除扩增产物中甲基化模板质粒；在酶ExnaseⅡ催化下使扩增产物的5’末端和3’末端进行同源重组，完成扩增产物的环化；待反应完成后，将环化后的扩增产物转化至大肠杆菌DH5α，涂布于含有50μg/mL Kana的LB培养基固体平板上，37℃培养14h，挑取单克隆；将单克隆接入含有50μg/mL Kana的液体LB培养基中培养，37℃震荡培养12h；用突变引物进行PCR验证，初步证明构建的重组质粒正确，并运用质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)进行质粒提取；接着将该重组质粒进行测序，以验证重组质粒中插入大小和方向正确的目的片段，将构建成功的重组质粒命名为pET30a-Aly06925-Y48A、pET30a-Aly06925-F52A、pET30a-Aly06925-I53A、pET30a-Aly06925-Y87A、pET30a-Aly06925-H115A、pET30a-Aly06925-F118A、pET30a-Aly06925-N119A、pET30a-Aly06925-Q170A、pET30a-Aly06925-H240A、pET30a-Aly06925-H243A、pET30a-Aly06925-Y244A、pET30a-Aly06925-Y295A。并对Y244位点进行饱和突变，引物序列见表1。系列突变体蛋白的诱导表达及纯化条件参照实例3，活性检测条件参照实例4。
运用DNS-还原糖法对褐藻胶裂解酶rAly06925截短体T45-60N及系列突变体活性检测，如图17所示：褐藻胶裂解酶rAly06925中Y87，Q170，H240，Y295突变后均失活，提示是关键位点残基，并证实了N238-N239-H240是保守基序。此外发现Y244位点突变为除含芳香族氨基酸外的其他氨基酸均呈包涵体表达，推测Y244位点上的芳香基团电子云密度较大，对于维持该蛋白构象或决定蛋白质表面的亲疏水性具有关键作用。同样的，多出的α-螺旋(K45-N60)对维持蛋白质构象及发挥催化作用也起到了关键作用。综上所述，初步确定了新型褐藻胶裂解酶rAly06925的保守基序N238-N239-H240-G241-T242-H243和关键活性位点残基Y87，Q170，H240，Y295，Y244，发现这与已鉴定褐藻胶裂解酶家族均不同，提示其催化机理新颖，有待于结构生物学研究加以详细解释。这对新型褐藻胶裂解酶家族及保守基序的认知进行了有效的补充，为相关的酶学研究提供了一定的理论启示。
运用分子凝胶色谱柱SuperdexTM Peptide 10/300GL(GE公司)对重组酶rAly06925突变体I53A降解褐藻胶所得终产物进行分离、纯化，合并后HPLC检测纯度；如图18-A所示，纯度均在99％以上；经冷冻干燥脱盐、重水完成氢氘置换后，进行1H-NMR检测，并通过相关核磁软件分析，发现：系列不饱和寡糖产物均在5.57ppm处具有特征性吸收峰，只发现了ΔM信号峰，未发现ΔG信号峰，如图18-B所示。这表明褐藻胶裂解酶rAly06925突变体I53A降解M/G聚段褐藻胶所得最终寡糖产物的非还原端均为ΔM单元，该位点氨基酸残基的改变并不会影响终产物的结构特征。
实施例17
将用去离子水配制的质量体积浓度分别为12g/L的纤维素、微晶纤维素、羧甲基纤维素、淀粉、果胶、琼脂、甘露聚糖、褐藻胶、卡拉胶、κ-卡拉胶、λ-卡拉胶、τ-卡拉胶、透明质酸(HA)、硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素C(CSC)、硫酸软骨素E(CSE)、硫酸皮肤素(HS/DS)、几丁质、黄原胶(Xanthan)与实施例3制得的褐藻胶裂解酶rAly06925酶液、150mM的HAc-NaAc(pH 6.0)缓冲液以体积比1：1：1的比例混合后50℃反应72h。将反应产物在沸水浴中加热10min灭活酶，转入冰水浴中5min，在12,000×g、4℃条件下离心15min，收集上清。分别进行DNS分析。将一定体积的上清与等体积的DNS(3,5-对硝基二甲苯)反应液混匀，在沸水浴中加热10min，降至室温，在540nm测定吸光值；检测结果发现褐藻胶裂解酶rAly06925对褐藻胶有明显的降解效果，对其他多糖都没有降解效果。
本发明首次公开了由桃色杆菌(Persicobacter sp.)JZB09的基因组中获得一种褐藻胶裂解酶rAly06925，该酶的编码基因如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；首次报道了桃色杆菌属来源的褐藻胶裂解酶及其特性与应用价值，同时也是首次报道专产仅含ΔM末端的内切型褐藻胶裂解酶，该酶与现有已知褐藻胶裂解酶具有显著差异，理化性质稳定、活性高，具备工业应用的潜质；本发明所制备的褐藻胶裂解酶rAly06925降解褐藻胶的酶活力为135U/mg，适用于系列不饱和寡糖的生产。
褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶：第48位氨基酸由酪氨酸变为丙氨酸，即Y48A；第53位氨基酸由异亮氨酸变为丙氨酸，即I53A；第52位氨基酸由苯丙氨酸变为丙氨酸，即F52A；第115位氨基酸由组氨酸变为丙氨酸，即H115A；第118位氨基酸由苯丙氨酸变为丙氨酸，即F118A；第119位氨基酸由天冬酰胺变为丙氨酸，即N119A；第243位氨基酸由组氨酸变为丙氨酸，即H243A；所述突变酶都可以有效降解褐藻胶，见图17。
褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶：氨基酸突变位点为截除氨基酸序列SEQ ID NO.2中第1位到第65位氨基酸，即rAly06925-T65N；氨基酸突变位点为截除氨基酸序列SEQ IDNO.2中第45位到第60位氨基酸，即Aly06925-T45-60N；或者氨基酸突变位点为氨基酸序列SEQ ID NO.2中第244位氨基酸突变为除芳香烃氨基酸外的其他氨基酸；所述突变体经诱导表达后呈包涵体的形式，有利于突变酶的提取纯化，包涵体中的酶有降解褐藻胶的酶活性。
表1
参考文献
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SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种桃色杆菌JZB09、褐藻胶裂解酶rAly06925及该酶的编码基因与应用
<160> 68
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1200
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgttttttc tatcctttat aggtttaatt tcctgttcat cggtgagtca aaagcaaaaa 60
accatttcat taacggatta cgacgcttta aagcatgcaa aagcgctttt agcgaaaaat 120
gatccgaaag tgaaggagga ttatgctccc ctttttatta aggctaaagc attattaaat 180
caaacaccat ttgctgttac gcataaaacg ggtgttccac caagcggaga tcagcatgat 240
tacctgtcaa tagcgcctta tttctggcct gacgcttcga caaataatgg tttgccttat 300
gtcagaaaag acggagagat aaatccggag gcaagaaata accatacaga ctttaatgag 360
ctaattgctt tttttgatgc tatagcgacc ttaagagatg cctatttttt ttcggaggaa 420
atagtgtttg cggaaaaggc cctggagttg attagcgtct ggtttttgga ggcaagtact 480
aaaatgaatc caaaccttaa ttttggccag ggtataccgg gaaaaattga gggtcggtgt 540
tttggtatta ttgaatttga tcgcatcaca gaggtactaa aatgtctgga gcagtttaaa 600
aaaacaggag tactaccgat aaacatcgaa aatggaatga atcaatggct tgcatcttac 660
gcttcctggc ttcagcacag taggctgggg gtggaagaat ctaccagatt aaataatcat 720
ggtacccatt atgatgtgca gttattaagt attttaacct acctgggtag acttgatgaa 780
gttcgcatgc acctgaatac ggtcaccaaa agccggatat ttagccaaat agagccggat 840
ggtagtcagc caagggaact tgagcgaacg aaatcattct cctattcggt gatgaattta 900
catggttttt taaaattgtc tgagataggg aaaaaagttg gtgtgaaggt ttggaggatg 960
gaatcagaag atgggagaag tataaagaag ggctaccttt atttacttcc ttatttgacc 1020
ggaacgcaaa aatgggagca cagacagatt aaatcagtgg atcaaagtat tgaaaagctg 1080
gtcaatgact tggtttttgc ctatagattt tttgaggcag aggaatttgc ttcggtagct 1140
gatgctgcta agcatggaga ttttttttgg gggaatttcg tggaagcgtt tttccaataa 1200
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<211> 399
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Phe Phe Leu Ser Phe Ile Gly Leu Ile Ser Cys Ser Ser Val Ser
1 5 10 15
Gln Lys Gln Lys Thr Ile Ser Leu Thr Asp Tyr Asp Ala Leu Lys His
20 25 30
Ala Lys Ala Leu Leu Ala Lys Asn Asp Pro Lys Val Lys Glu Asp Tyr
35 40 45
Ala Pro Leu Phe Ile Lys Ala Lys Ala Leu Leu Asn Gln Thr Pro Phe
50 55 60
Ala Val Thr His Lys Thr Gly Val Pro Pro Ser Gly Asp Gln His Asp
65 70 75 80
Tyr Leu Ser Ile Ala Pro Tyr Phe Trp Pro Asp Ala Ser Thr Asn Asn
85 90 95
Gly Leu Pro Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Ile Asn Pro Glu Ala Arg
100 105 110
Asn Asn His Thr Asp Phe Asn Glu Leu Ile Ala Phe Phe Asp Ala Ile
115 120 125
Ala Thr Leu Arg Asp Ala Tyr Phe Phe Ser Glu Glu Ile Val Phe Ala
130 135 140
Glu Lys Ala Leu Glu Leu Ile Ser Val Trp Phe Leu Glu Ala Ser Thr
145 150 155 160
Lys Met Asn Pro Asn Leu Asn Phe Gly Gln Gly Ile Pro Gly Lys Ile
165 170 175
Glu Gly Arg Cys Phe Gly Ile Ile Glu Phe Asp Arg Ile Thr Glu Val
180 185 190
Leu Lys Cys Leu Glu Gln Phe Lys Lys Thr Gly Val Leu Pro Ile Asn
195 200 205
Ile Glu Asn Gly Met Asn Gln Trp Leu Ala Ser Tyr Ala Ser Trp Leu
210 215 220
Gln His Ser Arg Leu Gly Val Glu Glu Ser Thr Arg Leu Asn Asn His
225 230 235 240
Gly Thr His Tyr Asp Val Gln Leu Leu Ser Ile Leu Thr Tyr Leu Gly
245 250 255
Arg Leu Asp Glu Val Arg Met His Leu Asn Thr Val Thr Lys Ser Arg
260 265 270
Ile Phe Ser Gln Ile Glu Pro Asp Gly Ser Gln Pro Arg Glu Leu Glu
275 280 285
Arg Thr Lys Ser Phe Ser Tyr Ser Val Met Asn Leu His Gly Phe Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Glu Ile Gly Lys Lys Val Gly Val Lys Val Trp Arg Met
305 310 315 320
Glu Ser Glu Asp Gly Arg Ser Ile Lys Lys Gly Tyr Leu Tyr Leu Leu
325 330 335
Pro Tyr Leu Thr Gly Thr Gln Lys Trp Glu His Arg Gln Ile Lys Ser
340 345 350
Val Asp Gln Ser Ile Glu Lys Leu Val Asn Asp Leu Val Phe Ala Tyr
355 360 365
Arg Phe Phe Glu Ala Glu Glu Phe Ala Ser Val Ala Asp Ala Ala Lys
370 375 380
His Gly Asp Phe Phe Trp Gly Asn Phe Val Glu Ala Phe Phe Gln
385 390 395
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcatatgcaa aaaaccattt cattaacgg 29
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gctcgagttg gaaaaacgct tccacgaaat tcc 33
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gttacgcata aaacgggtgt tccacc 26
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
catatgtata tctccttctt aaagttaaac 30
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
caaacaccat ttgctgttac gcataaaac 29
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cactttcgga tcatttttcg ctaaaagc 28
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
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atgcggctcc cctttttatt aaggctaaag c 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aaaggggagc cgcatcctcc ttcactttcg 30
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<211> 31
<212> DNA
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<400> 11
cttgcgatta aggctaaagc attattaaat c 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccttaatcgc aaggggagca taatcctcc 29
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ctttttgcga aggctaaagc attattaaat c 31
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agccttcgca aaaaggggag cataatcctc 30
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gactttaatg gcgtaattgc tttttttgat g 31
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tacgccatta aagtctgtat ggttatttc 29
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<212> DNA
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ataacgcgac agactttaat gagctaattg c 31
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cagacgcgaa tgagctaatt gctttttttg 30
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<212> DNA
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actttgcgga gctaattgct ttttttgatg 30
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<212> DNA
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gtatacccgc gccaaaatta aggtttggat tc 32
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aaataatgcg ggtacccatt atgatgtgca g 31
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<212> DNA
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tggtacccat gcggatgtgc agttattaag 30
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atccgcatgg gtaccatgat tatttaatct g 31
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