解淀粉芽孢杆菌在制备多肽中的用途
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，特别是涉及解淀粉芽孢杆菌在制备多肽中的用途。
背景技术
豆粕是大豆经提取豆油后得到的副产品，按照提取的方法不同，可以分为一浸豆粕和二浸豆粕，一浸豆粕的生产工艺较为先进，是中国国内现货市场上流通的主要品种。中国目前每年消耗的豆粕量达7000万吨左右。豆粕中粗蛋白含量为45％～55％，其来源广，价格低廉，易储存、营养较均衡，是主要植物源蛋白之一。
豆粕中的蛋白转化为多肽、小肽和游离氨基酸主要通过酸、碱或酶水解方式来实现。酸碱水解虽简单方便，但其在生产过程中不能按规定的水解测定进行水解，且因其生产条件苛刻，氨基酸会受到损害而降低其营养价值，因此目前采用此法的较少。目前被应用最广的是酶水解法。蛋白质的酶水解包括直接酶解法和间接酶解。但直接酶解法由于商品酶制剂成本高，代价大，限制了其工业化生产。
目前发酵豆粕的菌种主要有曲霉菌、酵母菌、芽孢杆菌和乳酸菌。国内外研究者对菌种和工艺进行了广泛的研究，主要集中在曲霉、芽孢杆菌和混合菌种3种类型。曲霉菌产酶能力较强，可降解抗营养因子和大分子蛋白，但只有在有氧的条件下曲霉才能繁殖，且大豆肽含量(16.68mg/ml)和转化率(55.6％)较低。而芽孢杆菌属(Bacillus)细菌可在胞外产生多种消化酶和抑菌物质，可将大分子蛋白转化为小分子肽，降解抗营养因子，其耐受温度和酸性环境，便于生产和加工，极具开发潜力。关于蛋白酶产生菌或发酵豆粕的专利也报道了一些，但是利用蛋白酶产生菌水解豆粕产多肽的专利未见报道。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供解淀粉芽孢杆菌在制备多肽中的用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌ahsz909，保藏编号为 CGMCC No.13028。
本发明还提供解淀粉芽孢杆菌在制备多肽中的用途。
优选的，所述解淀粉芽孢杆菌利用豆粕为底物制备多肽。
本发明还提供一种多肽的制备方法，所述方法包括：将所述解淀粉芽孢杆菌ahsz909的种子液接种至含豆粕的发酵培养基中培养，培养结束后发酵液中即含多肽。
优选的，以发酵液的总质量为基准，所述发酵培养基中豆粕粉的质量分数为10～15％。
优选的，所述发酵培养基的pH为6.5～7.5。
优选的，在发酵培养基中培养的温度为34～39℃。
优选的，在发酵培养基中培养时摇床转速为150～250r/min。
优选的，在发酵培养基中培养16～24h。
所述解淀粉芽孢杆菌ahsz909的种子液通过以下方法获得：取冻存的解淀粉芽孢杆菌 ahsz909进行活化，活化后接种至种子培养基中培养，培养结束后即得种子液。
优选的，解淀粉芽孢杆菌ahsz909的种子液的接种体积为发酵培养基体积的1～5％。
如上所述，本发明的解淀粉芽孢杆菌在制备多肽中的用途及方法，具有以下有益效果：微生物发酵法利用豆粕中的蛋白是目前研究的主流。本发明所筛选到的解淀粉芽孢杆菌 ahsz909，具有产蛋白酶的性质，用于水解豆粕产多肽，发酵培养16～24h即可使其多肽含量在60mg/ml～80mg/ml。该菌株用于水解豆粕的优点是发酵周期短、原料易得、成本低，容易控制发酵产物。发酵产物无污染，可用于生产微生物肥料。本发明通过间接酶解法的微生物发酵，利用产酶菌株直接作用底物豆粕，降低生产成本，且发酵过程可控制，简单方便。发酵液对盆栽黄瓜的根系生长具有促进效果。
附图说明
图1显示为本发明的解淀粉芽孢杆菌ahsz909在酪蛋白培养基平板上形成的水解透明圈照片。
图2显示为本发明的解淀粉芽孢杆菌ahsz909的第一次复筛(平板孔实验)结果的观察照。
图3显示为本发明的解淀粉芽孢杆菌ahsz909在营养琼脂平板上的菌落形态。
具体实施方式
本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌ahsz909，所述解淀粉芽孢杆菌ahsz909已在2016年09 月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为解淀粉芽孢杆菌 bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC No.13028，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述解淀粉芽孢杆菌ahsz909为革兰氏阳性菌，杆状。
所述解淀粉芽孢杆菌ahsz909的16h产多肽量为64mg/ml以上。所述16h产多肽量通过如下方法得到：
1)将解淀粉芽孢杆菌ahsz909的种子液按照发酵培养基体积的3％的接种量接种到发酵培养基中，在温度为37℃、摇床转速为200r/min培养18h，培养结束后获得发酵液；
2)发酵液的分离：将发酵液于4℃，10000r/min冷冻离心10min。取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，得到的滤液即为多肽液混合液；
3)利用双缩脲法测定多肽含量，用酪蛋白制作标准曲线，以多肽的浓度为横坐标X(mg/ml)，OD值为纵坐标Y，得到回归方程Y＝aX+b。多肽含量以酸可溶性多肽计，取多肽液混合液与10％三氯乙酸(TCA)水溶液等体积混合均匀，静置 30min，然后以10000r/min离心10min。取上清液稀释适当的倍数，按上清液：双缩脲试剂＝3：2(V:V)的比例混合均匀，静置15min，于540nm处测定OD 值，利用式(1)计算多肽含量。
多肽含量(mg/ml)＝(A-b)/a×N (1)
式(1)中A为OD540，N为样品稀释倍数。
所用的种子培养基以质量百分比含量的组分组成为：牛肉浸膏粉0.5％、骨蛋白胨1％，氯化钠0.5％，pH7.0左右。发酵培养基以质量百分比含量的组分组成为：豆粕粉10～15％，可溶性淀粉1～2.5％，玉米粉1～7％，硫酸镁0.03～1％，氯化钙0.05～0.3％，磷酸氢二钠0.4％，磷酸氢二钾0.03％，硫酸锰0.05％，余量为水。pH6.5～7.5。
本发明提供解淀粉芽孢杆菌在制备多肽中的用途。
所述多肽为蛋白水解后的产物。
所述解淀粉芽孢杆菌包括解淀粉芽孢杆菌ahsz909。
所述解淀粉芽孢杆菌ahsz909属于蛋白酶产生菌，其产生的蛋白酶可以将蛋白水解为多肽、小肽或游离氨基酸。
具体的，所述解淀粉芽孢杆菌ahsz909利用豆粕为底物制备多肽。
本发明还提供一种多肽的制备方法，所述方法包括：将所述解淀粉芽孢杆菌ahsz909的种子液接种至含豆粕的发酵培养基中培养，培养结束后发酵液中即含多肽。
以发酵液的总质量为基准，所述发酵培养基中豆粕粉的质量分数为10～15％。
以发酵液的总质量为基准，所述发酵培养基包括以下质量分数的物质：豆粕粉10～15％，可溶性淀粉1～2.5％，玉米粉1～7％，硫酸镁0.03～1％，氯化钙0.05～0.3％，磷酸氢二钠 0.3～0.6％，磷酸氢二钾0.03～0.05％，硫酸锰0.03～0.05％，余量为水。
所述发酵培养基的pH为6.5～7.5。
在发酵培养基中培养的温度为34～39℃。
在发酵培养基中培养时摇床转速为150～250r/min。
在发酵培养基中培养16～24h。
所述解淀粉芽孢杆菌ahsz909的种子液通过以下方法获得：取冻存的解淀粉芽孢杆菌 ahsz909进行活化，活化后接种至种子培养基中培养，培养结束后即得种子液。
在种子培养基中培养的温度为34～39℃。
在种子培养基中培养时摇床转速为150～250r/min。
在种子培养基中培养12～16h。
在一种实施方式中，所述种子培养基包括以下物质：牛肉浸膏粉、骨蛋白胨，氯化钠。
在一种实施方式中，解淀粉芽孢杆菌ahsz909的种子液的接种体积为发酵培养基体积的 1～5％。
该方法获得的多肽含量达6～8％。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1
利用豆粕产多肽的蛋白酶产生菌的菌株筛选，从公司菌种库中筛选。
初筛：从公司菌种库中保藏的芽孢类细菌15株经营养琼脂培养基平板上活化后，分别点接到酪蛋白培养基平板上，28～37℃培养。挑选出有明显的透明圈的菌株12株，其中HC(透明圈直径/菌落直径)比值最大的菌株为解淀粉芽孢杆菌ahsz909。酪蛋白培养基，其以质量百分比含量的组分组成为：牛肉浸膏粉0.5％，酪蛋白0.5％，硫酸铵0.2％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸镁0.02％，无水氯化钙0.01％，氯化钠0.5％，琼脂粉2％，pH7.0左右。
复筛：
粗酶液制备：
挑取上述初筛的菌株各2环，分别接到种子培养基中，28～37℃、180～200r/min过夜培养16～17h后，按3％接种量接到发酵培养基中，28～37℃、180～200r/min过夜培养16～24h。取发酵液10mL，4℃、10000r/min离心10min，取上清液，此条件下二次离心取上清液，即为粗酶液。种子培养基以质量百分比含量的组分组成为：牛肉浸膏粉0.5％、骨蛋白胨1％，氯化钠0.5％，pH7.0左右。发酵培养基以质量百分比含量的组分组成为：豆粕粉10～15％，可溶性淀粉1～2.5％，玉米粉1～7％，硫酸镁0.03～1％，氯化钙0.05～0.3％，磷酸氢二钠0.4％，磷酸氢二钾0.03％，硫酸锰0.05％，余量为水。pH6.5～7.5。
(1)平板孔实验第一次复筛：
用打孔器在酪蛋白平板上打孔，每平板均匀打3孔，孔径为0.80cm。取25μL粗酶液注入平板孔(三孔为一组平行)，平板于28～37℃恒温培养16～24h，滴加2.5％TCA溶液，以刚铺满平皿即可，测量水解透明圈直径。同时设置不接菌培养基的离心液注平板孔作为空白对照，以排除培养基对实验的干扰。选取形成透明圈直径较大的酶液所对应的菌株作第二次复筛。
经上述第1次复筛，所有菌株粗酶液均形成透明圈，透明圈直径在0.4～2.9cm。其中透明圈直径D≥2.0cm的有2株，如图1-2所示，其中解淀粉芽孢杆菌ahsz909形成的透明圈直径较大，为2.8±0.05cm。因此选取该菌株作第二次复筛。
(2)蛋白酶活力测定第二次复筛
选择平板孔实验法挑选出来的水解圈直径D≥2.0cm的菌株，取其对应的粗酶液按照 QB/1803-1993《工业酶制剂通用试验方法》中的紫外分光光度法检测粗酶液的酶活。具体如下：
标准曲线绘制：将L-酪氨酸(纯度≥95％)于105℃烘干至恒重，称取0.1000g，用20mL 1mol/L HCl溶解后定容至100mL，得到1mg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。取10mL的1mg/mL 的L-酪氨酸，用0.1mol/L HCl定容至100mL，得到100μg/mL的L-酪氨酸标准溶液。最后将 100μg/mL的L-酪氨酸标准溶液用蒸馏水稀释到浓度分别为0、20、40、60、80、100和120μg/mL 的L-酪氨酸，在波长为275处测定其吸光度。建立L-酪氨酸浓度C(μg/mL)与吸光度A的标准曲线方程：C＝133.9A+0.995，r＝0.9970。当A＝1时，吸光常数K＝134.895。符合130≤K≤135。
酶活力测定：
粗酶液：发酵液通过10000r/min室温离心10min，取上清液，即为待测酶液。取待测酶液1mL，用pH＝7.5的缓冲液溶解并稀释适当地倍数，供测试用(稀释至被测试液吸光值在0.25～0.40范围内)。先将1％酪蛋白溶液放入40℃±0.2℃恒温水浴锅中，预热5min。
(1)对照组：
取试管，标记A稀释后的酶液2mL，40℃±0.2℃水浴2min加三氯乙酸4mL，摇匀， 40℃±0.2℃水浴10min加1％酪蛋白溶液2mL，摇匀，继续加热10min，离心过滤滤液用紫外分光光度计在275nm处测吸光值。
(2)试验组：
取试管，标记B(平行3次)向试管B中加入稀释后的酶液2mL，40℃±0.2℃水浴2min加1％酪蛋白溶液2mL，摇匀，40℃±0.2℃水浴10min加三氯乙酸4mL，摇匀，继续加热10min，离心过滤滤液用紫外分光光度计在275nm处测吸光值。
(3)计算在40℃下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个蛋白活力。
X＝A×K×8/2×1/10×n×E＝2/5×A×K×n×E
式中，X:样品的酶活力(μ/g或μ/mL)；A:试样溶液的平均吸光度；K：吸光常数；8:反应试剂的总体积，mL；2：吸取酶液2mL，以1mL计；1/10：反应时间10min，以1min 计；n：稀释倍数；E：紫外法与福林法的换算系数(中性、碱性蛋白酶系数为0.5；酸性蛋白酶系数为0.77)。所得结果表示至整数。平行试验相对误差不得超过3％。
经第二次复筛得到的发酵液酶活在190U/ml以上的有2株，其中解淀粉芽孢杆菌ahsz909 的蛋白酶活力最高，为214U/ml。
综合初筛和复筛结果，最终选定的利用豆粕产多肽的蛋白酶产生菌为解淀粉芽孢杆菌 ahsz909。
实施例2：
利用豆粕产多肽的蛋白酶产生菌的使用方法：取甘油管保藏的菌株ahsz909进行营养琼脂平板活化(如图3所示)，取2环接于种子培养基中，在温度为37℃、摇床转速为200r/min 培养12h，得种子液，再将该种子液按照3％的接种量接种到上述的发酵培养基中，在温度为37℃、摇床转速为200r/min培养18h，培养结束后获得含多肽的发酵液。利用以下方法检测发酵液中多肽的含量：
(1)多肽液的分离：
将发酵液于4℃，10000r/min冷冻离心10min。取上清液用微孔滤膜过滤(0.45μm)，得到的滤液即为多肽液混合液。
(2)标准曲线的制作
精确称取酪蛋白标准品12g，用蒸馏水配制成12mg/ml母液备用。采用梯度稀释法依次将其配成0、2、4、6、8、10和12mg/ml的溶液，然后分别取6.0ml标准溶液加入4.0ml双缩脲试剂，于漩涡混合仪上混合均匀。静置15min，于540nm下测定OD值(以第一管做空白对照)，以多肽的浓度为横坐标X(mg/ml)，OD值为纵坐标Y，制作标准曲线，得到回归方程Y＝0.0657X+0.0269，R＝0.997
(3)多肽含量的测定
多肽含量以酸可溶性多肽计，取多肽液混合液与10％三氯乙酸(TCA)水溶液等体积混合，并在涡旋仪上混合均匀，静置30min，然后以10000r/min离心10min。取上清液稀释适当的倍数，按上清液：双缩脲试剂＝3：2(V:V)，在涡旋震荡仪上混合均匀，静置15min，于540nm处测定OD值。对照标准曲线，按照式(1)计算样品溶液中的多肽的含量。
多肽含量(mg/ml)＝(A-0.0269)/0.0657×N (1)
式(1)中A为OD540，N为样品稀释倍数。
所用的种子培养基以质量百分比含量的组分组成为：牛肉浸膏粉0.5％、骨蛋白胨1％，氯化钠0.5％，pH7.0左右。发酵培养基以质量百分比含量的组分组成为：豆粕粉10～15％，可溶性淀粉1～2.5％，玉米粉1～7％，硫酸镁0.03～1％，氯化钙0.05～0.3％，磷酸氢二钠0.4％，磷酸氢二钾0.03％，硫酸锰0.05％，余量为水。pH6.5～7.5。
第一组：利用豆粕产多肽的蛋白酶产生菌的使用方法，取甘油管保藏的菌株ahsz909进行营养琼脂平板活化，取2环接于种子培养基中，在温度为37℃、摇床转速为200r/min培养 12h，得种子液，再将该种子液按3％的接种量接种到上述的发酵培养基中，在温度为37℃、摇床转速为200r/min培养18h。发酵液中的多肽含量达78.2mg/ml。
所用的种子培养基以质量百分比含量的组分组成为：牛肉浸膏粉0.5％、骨蛋白胨1％，氯化钠0.5％，pH7.0左右。发酵培养基以质量百分比含量的组分组成为：豆粕粉15％，可溶性淀粉2％，玉米粉3％，硫酸镁0.01％，氯化钙0.3％，磷酸氢二钠0.4％，磷酸氢二钾0.03％，硫酸锰0.05％，余量为水，pH6.7。
第二组：利用豆粕产多肽的蛋白酶产生菌的使用方法，取甘油管保藏的菌株ahsz909进行营养琼脂平板活化，取2环接于种子培养基中，在温度为37℃、摇床转速为200r/min培养12h，得种子液，再将该种子液按照3％的接种量接种到上述的发酵培养基中，在温度为37℃、摇床转速为200r/min培养16h。发酵液中的多肽含量达64mg/ml。
所用的种子培养基以质量百分比含量的组分组成为：牛肉浸膏粉0.5％、骨蛋白胨1％，氯化钠0.5％，pH7.0左右。发酵培养基以质量百分比含量的组分组成为：豆粕粉10％，可溶性淀粉2％，玉米粉7％，硫酸镁0.05％，氯化钙0.3％，磷酸氢二钠0.4％，磷酸氢二钾0.03％，硫酸锰0.05％，余量为水，pH7.0。
第三组：利用豆粕产多肽的蛋白酶产生菌的使用方法，取甘油管保藏的菌株ahsz909进行营养琼脂平板活化，取2环接于种子培养基中，在温度为37℃、摇床转速为200r/min培养 12h，得种子液，再将该种子液按照3％的接种量接种到上述的发酵培养基中，在温度为37℃、摇床转速为200r/min培养16h。发酵液中的多肽含量达79.3mg/ml。
所用的种子培养基以质量百分比含量的组分组成为：牛肉浸膏粉0.5％、骨蛋白胨1％，氯化钠0.5％，pH7.0左右。发酵培养基以质量百分比含量的组分组成为：豆粕粉15％，可溶性淀粉2.5％，玉米粉3％，硫酸镁0.03％，氯化钙0.3％，磷酸氢二钠0.4％，磷酸氢二钾0.03％，硫酸锰0.05％，余量为水，pH7.0。
实施例3含6～8％多肽发酵液促进盆栽黄瓜生长试验
在大棚中对黄瓜种子(唐山秋瓜)进行育苗，待黄瓜长到两叶一心时，选取长势一致，健康的植株定植到盆中，每盆装2kg营养土，每处理3个重复。前3d浇缓苗水，并测定基础数据(株高、叶长、叶宽和茎粗)。然后对黄瓜苗进行第1次施肥，后期每隔7d施肥一次，并测定基础数据(株高、叶长、叶宽和茎粗)，共施肥3次，直至试验结束。试验结束时，测定黄瓜植株的株高、茎粗、叶长、叶宽、植株干重。测定植株的自然株高，即地面到自然状态的最高点间距离。茎粗：第一片真叶下一厘米处的茎粗。叶长：测定植株第3片真叶的长度。叶宽：测定植株第3片真叶的长度。植株干重测定：将称完鲜重后的植株于105℃下杀青30min后，80℃下烘至恒重，称重。
表1各处理盆栽黄瓜长势指标
注：叶面积计算公式：14.61-5L+0.94L2+0.47W+0.63W2-0.62LW(L叶长；W叶宽)
由表1可以得出，本发明用含6～8％多肽发酵液稀释300倍对黄瓜进行灌根，在能满足黄瓜的正常生长需求上，对黄瓜的生长具有促进效果。发酵液中的多肽为其生长提供氮源，可以减少化肥的施用。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
