具体实施方式

以下的实施例便于理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，平均值。

实施例1、1菌株的分离、鉴定及保藏

一、D8菌株的分离

2019年9月从山东东营的胜利油田的油井采出液中获得油水混合物，发明人从中分离得到一株菌，将其命名为菌株D8。

二、菌株的鉴定

1、菌株的形态鉴定

菌株的形态特征：在LB平板上培养一天菌落直径大小为2-3mm，菌株在培养基上形成透明凸透镜状、圆润的菌落，用接种针挑起菌落时有拉丝现象。

2、菌株的生理生化鉴定

本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)D8，CGMCC NO.19552的细胞形态特征为：菌体经革兰氏染色呈阳性，显微镜下，细胞呈杆状，端生芽孢，呈短杆状。该菌生长温度范围35-75℃，最适合生长温度为60℃，生长pH范围为6-11，NaCl耐受性0-18％，穿刺实验表明 D8为兼性厌氧菌；

本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis..)D8，CGMCC NO.19552的部分生理生化特征如表1所示：

表1、D8菌株生理生化特征表

3、菌株的分子鉴定

将活化的菌株接种在液体LB培养基(溶剂为水，溶质及其浓度分别为蛋白胨、酵母粉)中，振荡培养24h。取1mL新鲜培养菌液离心，收集菌体于离心管中，采用DNA提取试剂盒提取DNA。电泳检测后，采用通用引物进行扩增。产物电泳检测后，测定基因序列，具体序列：16SrDNA序列测定结果、gyrB基因序列测定结果。

三、菌株的保藏

菌株的分类命名为枯草芽孢杆菌，Bacillus subtilis，该菌株已于2020年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC NO.19552。

实施例2本发明Bacillus subtilis.D8 CGMCC NO.19552菌株好氧条件下乳化原油的性能实验

1、供试菌株

本发明实施例1所分离的Bacillus subtilis，菌种保藏号为 CGMCC NO.19552。

2、实验方法

供试菌株在以糖蜜为碳源的无机盐乳化培养基中生长，无机盐乳化培养基D8菌液、(NH₄)₂SO₄、Na₂HPO₄、NaNO₃、蛋白胨、酵母膏，糖蜜，使其在含菌水的中浓度分别为菌液5％、1g/L(NH₄)₂SO₄、 1g/LNa₂HPO₄、3g/LNaNO₃、2g/L蛋白胨、2g/L酵母膏、2g/L糖蜜。

65℃振荡(120rpm)培养2天。按不同时间点取发酵液，将发酵液用无菌水稀释20倍，取发酵原液、稀释液对原油进行乳化，并测定乳化指数，同时使用表面张力仪测定发酵液表面张力，观察其对原油乳化情况。

乳化指数测定方法：取两个刻度试管，分别加入柴油和原油，各3ml，每个试管中加入7ml发酵液，剧烈振荡1分钟，室温静置24小时后测量，以乳化层的高度除以有机相的总高度，再乘以100％，即EI；如果EI>50％，则认为乳化也是稳定的。

表面张力测定方法：取2ml发酵液，12000rpm/min离心5分钟，取上清液1ml，用表面张力仪测定发酵液表面张力。

3、实验结果

实验结果表明，供试菌株可以很好的乳化原油，使原油颗粒变细小并充分的分散与水中，如墨汁状与水互溶。

无机盐培养基D8菌液、(NH₄)₂SO₄、Na₂HPO₄、NaNO₃、蛋白胨、酵母膏，糖蜜,使其在含菌水的中浓度分别为菌液5％、 1g/L(NH₄)₂SO₄、1g/LNa₂HPO₄、3g/LNaNO₃、2g/L蛋白胨、2g/L酵母膏、2g/L糖蜜。

供试菌株在以糖蜜为碳源的无机盐乳化培养基中可产生表面活性剂，显著降低发酵液的表面张力，使发酵液的表面张力从67.2mN/m 降至25.6mN/m，降幅超过50％，从而很好的促进了对原油乳化，乳化指数EI-24最高可达73％。

供试菌株在65℃好氧条件下，仅需40小时就能对原油起到很好的乳化效果。

实施例3兼性厌氧条件下产黏性物质的性能实验，

以蔗糖为碳源无机盐培养基D8菌液、(NH₄)₂SO₄、Na₂HPO₄、 NaNO₃、蛋白胨、酵母膏，蔗糖,使其在含菌水的中浓度分别为菌液 5％、1g/L(NH₄)₂SO₄、1g/LNa₂HPO₄、3g/LNaNO₃、2g/L蛋白胨、2g/L 酵母膏、2g/L蔗糖。

供试菌株在以蔗糖为碳源的无机盐培养基中兼性厌氧条件下生长，将培养液放入厌氧瓶中，60℃静止培养2天。可观察到发酵液底部有一层絮状沉淀出现，摇动后絮状沉淀消失，取发酵液，采用布氏黏度计测试发酵液黏度，黏度为6.2mPa.S,对应空白无菌发酵液黏度为0.8mPa.S。

供试菌株在60℃兼性厌氧条件下、在高温和特定条件下产黏性物质，其产生的胞外多糖溶于注入水中,增强了注入水的波及效率, 提高了原油采收率。

实施例4岩心调剖物理模拟实验

含菌水的制备方法如下：将活化的接种在液体LB培养基中，静止培养24H，得到菌液。在注入水中加入D8菌液、(NH₄)₂SO₄、 Na₂HPO₄、NaNO₃、蛋白胨、酵母膏、蔗糖，使其在含菌水的中浓度分别为菌液5％、1g/L(NH₄)₂SO₄、1g/LNa₂HPO₄、3g/LNaNO₃、2g/L 蛋白胨、2g/L酵母膏、2g/L蔗糖。

岩心模拟实验采用露头均质岩心,气测岩心的渗透率,将岩心抽真空8h以上,用地层水饱和岩心,计算孔隙体积(PV),注水驱替至压力稳定,然后注入0.1PV发酵液,关闭岩心进出口阀门,于 55℃恒温箱中放置3d后,重新安装流程水驱,测定注入调剖前后的压力变化。

由于菌体及其产生的多糖对岩心孔隙的堵塞作用,岩心注入压力由调剖前的0.1MPa增加到0.4MPa,岩心渗透率从0.556um2 降至0.12um2,渗透率下降比率为80％,实验结果证明菌株D8产生的胞外多糖对岩心孔隙起到了有效的调剖封堵作用。

菌株D8在岩心中利用营养产生胞外多糖形成生物膜,在封堵岩石孔隙增加压力、调节渗透率的同时,可以利用岩心中的残余油产生表面活性物质,从而乳化原油,增加其流动性,提高采收率,此处的微生物作用可以认为是微生物的调驱作用。

实施例5菌株在微生物驱油技术中的应用

本实施例中的石油于2019年8月10日采集自山东胜利油田，原油黏度为500mPa.S

本实施例通过室内物模驱油实验评价微生物菌种的驱油效果。具体实验方法如下：

采用高压模型管内填装不同目数的石英砂制作为填砂模型管。采用渗透率测量装置模型管渗透率。抽真空饱和地层水。计算孔隙度；岩心饱和原油，造束缚水，测量原始含油饱和度；并在油藏温度60℃下老化3天。

连接注入流程，注水驱油，至出口产出液达到含水率98％以上停止水驱，计算采收率(即为水驱采收率)。

按照岩心孔隙体积的注入0.5PV含菌水(完成注入后，计算采收率，即为注微生物过程采收率)，在油藏温度60℃下培养10天。

含菌水的制备方法如下：将活化的接种在液体LB培养基中，振荡培养24H，得到菌液。在注入水中加入D8菌液、(NH₄)₂SO₄、 Na₂HPO₄、NaNO₃、蛋白胨、酵母膏，使其在含菌水的中浓度分别为菌液5％、1g/L(NH₄)₂SO₄、1g/LNa₂HPO₄、3g/LNaNO₃、2g/L蛋白胨、2g/L酵母膏。

10天后二次注水进行驱油，至出口产出液达到极限含水率停止水驱，计算采收率(即为微生物作用后续水驱采收率)。物模驱油结果曲线如图1所示。

对水驱、注微生物过程中、微生物作用后续水驱等不同阶段的采收率进行了对比，结果见表2。室内物模驱油表明，再次水驱注入压力升高，表明原油形成乳状液，同时含水下降15％，采收率提高13％，说明使用D8菌株可以提高采收率。

表2、室内物模驱油结果表

1、16S rDNA序列测定结果：

ATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTG

2、gyrB基因序列测定结果：

TATAAACGCGGAGTTCCGGTTACAGACCTTGAAATCATTGGCGAAACGGATCATACAGGAACGACGACACATTTTGTCCCGGACCCTGAAATTTTCTCGGAAACAACCGAGTATGATTACGATCTGCTTGCCAACCGCGTGCGTGAATTAGCCTTTTTAACAAAGGGCGTAAACATCACGATTGAAGATAAACGTGAAGGACAAGAGCGCAAAAATGAATACCATTACGAAGGCGGAATTAAAAGTTATGTAGAGTATTTAAACCGCTCTAAAGAGGTTGTCCATGAAGAGCCGATTTACATTGAAGGCGAAAAGGACGGCATTACGGTTGAAGTGGCTTTGCAATACAATGACAGCTACACAAGCAACATTTACTCGTTTACAAACAACATTAACACGTACGAAGGCGGTACCCATGAAGCTGGCTTCAAAACGGGCCTGACTCGTGTTATCAACGATTACGCCAGAAAAAAAGGGCTTATTAAAGAAAATGATCCAAACCTAAGCGGAGATGACGTAAGGGAAGGGCTGACAGCGATTATTTCAATCAAACACCCTGATCCGCAGTTTGAGGGCCAAACGAAAACAAAGCTGGGCAACTCAGAAGCACGGACGATCACCGATACGTTATTTTCTACGGCGATGGAAACATTTATGCTGGAAAATCCAGATGCAGCCAAAAAAATTGTCGATAAAGGCTTAATGGCGGCAAGAGCAAGAATGGCTGCGAAAAAAGCGCGTGAACTAACACGCCGTAAGAGTGCTTTGGAAATTTCAAACTTGCCCGGTAAGTTAGCGGACTGCTCTTCAAAAGATCCGAGC