一种用于预测儿童肥胖症的组合物及其应用
技术领域
本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种用于预测儿童肥胖症 的组合物及其应用。
背景技术
肠道是人体的最大的免疫器官，肠道全部菌群被称为“人体第二 基因组”是最大的微生态系统。人体70％的抗体来源于此，含全身60％ 的淋巴细胞。肠道微生物总量达100万亿，粪便干重的1/3是细菌， 每克粪便的细菌总数约为：1000亿个。肠道微生态由三个部分组成 的一个系统：肠道菌群、肠粘膜上皮组织和肠道粘膜免疫系统，它们 共同组成了肠道的粘膜屏障，而肠道菌群在其中发挥了最重要的作用。 90％的微生物菌落居住在你的肠道，肠道细菌数是人体细胞总数的10 倍。
肠道菌群，随着人的年龄增长，体内的有益菌数量会减少，特别 是双歧杆菌，而有害菌数量则会不断上升，如产气荚馍梭菌。
肠稳态是指宿主黏膜屏障和肠道微生态(包括肠道菌群、营养和 代谢产物等)相互作用所构成的动态平衡状态。肠道正常菌群和肠黏 膜结合形成的机械屏障、免疫屏障与生物屏障可维护机体内环境稳定 并有效阻止有害物质的入侵。肠道微生态系统是人体最复杂、最庞大 的微生态系统。人体肠道中含有约800多种菌属、7000多种菌株。 其庞大的数量(约100万亿个，即人体细胞总数的10倍，总重有 1-1.5kg)构成了肠道微生物组。在正常的机体内，共生菌(指与生物 体共同生存的细菌)主要分布于肠腔内、黏膜表面以及潜在的肠道相 关淋巴组织内。肠道菌群受到环境、生活方式、饮食习惯、药物和手 术等多种因素影响，参与了机体的许多生理活动；在维持肠道正常生 理功能、调节机体免疫以及拮抗病原微生物定植等方面都发挥重要作 用。
肠道菌群对宿主免疫系统的发育和功能产生了根本性的影响，同 时免疫系统已进化至足以维持与肠道菌群的共生关系。肠道菌群对人 体健康的影响日益引起国际上众多研究团队的关注。大量研究表明， 肠稳态结构和功能的改变与代谢性疾病、炎症性疾病以及肿瘤的发生 发展密切相关。随着肠道微生物基因组计划的实施，宏基因组学、功 能基因组学、代谢组学以及蛋白质组学的不断发展，消化道微生态研 究受到广泛的重视。通过分析人体肠道中微生物群落的组成、分布、 生理生化特征、功能、相互关系及其与宿主间的关系，可为后续研究 肠稳态与机体健康的关系提供重要的理论依据。
目前的流行病学、病理学、组学、细胞和动物研究结果揭示肠道 内的微生物在相当大的程度上介导了人们的代谢健康和疾病风险。这 些寄生在人身体各种腔体内的微小生物的合集我们称之为微生物，包 含数目庞大的细菌、真菌、噬菌体、真核病毒和真菌。它们中的大部 分为共生或互生微生物。一个人的所有肠道微生物基因(即微生物组) 的集合代表了一个遗传库，该库的基因数目比人类基因组高一个数量 级。肠道微生物组在提高宿主免疫力、食物消化、肠道内分泌功能和 神经信号调节、药物功能和代谢、内毒素清除和影响宿主代谢相关物 质的产生等方面扮演重要角色。紊乱的肠道菌群会导致多种常见代谢病的发生，包括肥胖、2型糖尿病、非酒精性肝病、代谢性心脏病和 营养不良等。研究人员讨论了肠道菌群与肥胖、T2D、代谢性肝病和 心脏代谢疾病的关系，据报道，与健康人相比，受影响的肠道菌群的 多样性通常减少，与传统生活方式的人相比更是如此。
大量的报告表明，肠道微生物组分类和功能潜能的破坏与许多病 理表型有关。大多数对人类和动物的研究都是观察性的，缺乏实验数 据。然而，正如人类肠道微生物群的基因库所揭示的那样，数万亿的 共生菌是一个巨大的化学工厂，可以合成许多自身生存和与宿主生存 所需的化合物。
肠道微生物群的复杂性令人望而生畏。未来，基于测序和培养的 肠道微生物检测，结合肠道菌群、古菌群、噬菌体组、病毒组和分枝 菌群的机理研究，将以指数级的提升我们对肠道微生物群落相互作用 的认识。此外，重要的是，肠道微生物组产生影响宿主生理学和多种 病理学的多种化学物质，有关这些化学物质的新知识可能会为我们开 辟出新的有效代谢性疾病的干预途径，为稳定全人类的代谢健康，预 防或对抗常见的人类代谢疾病，提供更多的治疗依据。
随着经济的快速发展，人民的日常生活水平也在日益提高，饮食 种类和习惯也有着巨大的改变，导致超重和超重肥胖也日益流行，全 世界的超重肥胖人数占总人数的30％左右。近年来有研究显示，肠道 菌群在人体内环境中有着十分显著的作用，和人体很多类型的疾病有 关，尤其是和超重肥胖症有着很重要的密切关系，肠道菌群的分布对 儿童肠道中能量的平衡和调节意义重大。
学龄前儿童的超重肥胖问题也十分严重，超重肥胖已经严重影响 到儿童的正常生活与健康，所以应该对其超重肥胖的原因进行研究。 肥胖症已经是全球性问题，随着其发病率的逐年增多，大家已经意识 到肥胖是一种病理状态。超重肥胖的危害很多，而儿童肥胖的危害更 加严重和长远。
因此，提供能够检测儿童肥胖症的微生物菌群，对于儿童肥胖症 的预防和治疗均具有重大的意义。
发明内容
为解决目前儿童肥胖症检测不准确，可行度不高的问题，本发明 提供如下技术方案。
本发明公开了一种组合物，所述组合物包括任选的三种或三种以 上的微生物，所述微生物选自产气夹馍菌(Clostridium)、拟杆菌 (Bacteroides)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳酸杆菌(Lactobacillus)。
本发明公开了一种引物组，所述引物组包括检测所述组合物的引 物。
优选的，所述引物组包括：用于检测产气夹馍菌的引物分别如 SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示；用于检测拟杆菌的引物分别如 SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；用于检测双歧杆菌的引物分别 如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；用于检测乳酸杆菌的引物分 别如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示。
优选的，所述引物组还包括：用于检测产气夹馍菌的探针，其序 列如SEQ ID NO：3所示；用于检测拟杆菌的探针，其序列如SEQ ID NO：6所示；用于检测双歧杆菌的探针，其序列如SEQ ID NO：9所示； 用于检测乳酸杆菌的探针，其序列如SEQ ID NO：12所示。
优选的，所述探针上标记荧光基团。
优选的，所述荧光基团选自FAM、BHQ-MGB、TAMRA、TET、 HEX、ROX。
本发明公开了一种用于预测儿童肥胖症的试剂盒，其特征在于， 所述试剂盒包括所述的组合物和/或所述的引物组。
本发明公开了一种检测儿童肥胖症的方法，其特征在于，包括如 下步骤：
(1)分离待检测儿童的粪便；
(2)检测步骤(1)粪便中产气夹馍菌(Clostridium)、拟杆菌 (Bacteroides)、双歧杆菌(Bifidobacterium)以及乳酸杆菌 (Lactobacillus)的含量；
(3)比较待检测粪便与正常儿童粪便中产气夹馍菌 (Clostridium)、拟杆菌(Bacteroides)、双歧杆菌(Bifidobacterium) 以及乳酸杆菌(Lactobacillus)的含量；
(4)得出待检测儿童是否患有肥胖症结果。
优选的，所述步骤(2)采用荧光定量PCR方法测定。
优选的，所述步骤(2)采用权利要求2-4任一权利要求所述的引 物组。
优选的，所述步骤(4)中的判定方法为：肥胖儿童粪便中的乳 酸杆菌以及产气夹馍菌明显高于正常儿童，而拟杆菌以及双歧杆菌的 量明显低于正常儿童。
本发明公开了所述的组合物以及所述的引物组在制备检测儿童 肥胖症试剂中的应用。
本发明提供了能够用于检测肥胖症的组合物。
本发明发现在正常儿童以及肥胖儿童的粪便中产气夹馍菌 (Clostridium)、拟杆菌(Bacteroides)、双歧杆菌(Bifidobacterium) 以及乳酸杆菌(Lactobacillus)的含量存在显著的差异。
其中，肥胖儿童粪便中的乳酸杆菌以及产气夹馍菌明显高于正常 儿童，而拟杆菌以及双歧杆菌的量明显低于正常儿童。
本发明进一步提供了一种用于检测粪便中产气夹馍菌 (Clostridium)、拟杆菌(Bacteroides)、双歧杆菌(Bifidobacterium) 以及乳酸杆菌(Lactobacillus)的含量的荧光定量PCR方法。
本发明进一步提供了一种用于检测粪便中产气夹馍菌 (Clostridium)、拟杆菌(Bacteroides)、双歧杆菌(Bifidobacterium) 以及乳酸杆菌(Lactobacillus)的含量的引物及探针。
本发明根据产气夹馍菌(Clostridium)、拟杆菌(Bacteroides)、双 歧杆菌(Bifidobacterium)以及乳酸杆菌(Lactobacillus)的16srDNA 序列，设计能够扩增产气夹馍菌(Clostridium)、拟杆菌(Bacteroides)、 双歧杆菌(Bifidobacterium)以及乳酸杆菌(Lactobacillus)的引物及 探针。通过进一步测定粪便中产气夹馍菌(Clostridium)、拟杆菌 (Bacteroides)、双歧杆菌(Bifidobacterium)以及乳酸杆菌 (Lactobacillus)的含量，来判定儿童是否是患有肥胖症。
本发明的方法具有较高的特异性及灵敏度，且操作简单，准确， 适合推广应用。
附图说明
图1为菌种特异性检测结果，其中1道为产气夹馍菌，2道为拟 杆菌，3道为双歧杆菌，4道为乳酸杆菌，5道为梭壮芽孢杆菌，6道 为大肠杆菌、7道为埃希氏杆菌、8道为梭菌。
图2为乳酸杆菌的荧光定量PCR图。
图3为乳酸杆菌的标准曲线。
图4为双歧杆菌的荧光定量PCR图。
图5为双歧杆菌的标准曲线。
图6为拟杆菌的荧光定量PCR图。
图7为拟杆菌的标准曲线。
图8为产气夹馍菌的荧光定量PCR图。
图9为产气夹馍菌的标准曲线。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的 限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或 条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。
实施例1 肠道微生物检测的特异性
根据乳酸杆菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、 拟杆菌(Bacteroides)、产气夹馍菌(Clostridium)16 srDNA的序 列设计相应的引物及探针序列。
其中，乳酸杆菌的引物及探针序列分别为：正义引物：5’gc cgcgtgagtg aagaag3’；反义引物：5’gcatggactaccagggtatct 3’；探针序列：5’ctgtcctcttctgcactcaag 3’；扩增的片段长 度约为600bp。
双歧杆菌的引物及探针序列分别为：正义引物：5’tccggaatta ttgggcgt 3’；反义引物：5’gatgcttaacgcgttagc 3’；探针 序列：5’aattcccgg tgtaacggtg ga 3’；扩增的片段长度约为300bp。
拟杆菌的引物及探针序列分别为：正义引物：5’gatgactgc cctatgggtt 3’；反义引物：5’aaactttcacaactgactt 3’；探 针序列：5’gagttagccgatccttattcataa 3’；扩增的片段长度约为 200bp。
产气夹馍菌的引物及探针序列分别为：正义引物：5’ ATTAGCTAGTTGGTGGGGT 3’；反义引物：5’CTTAATCATCCGCCTACGCTC 3’；探针序列：5’CACGCGGCGTTGCTGCATCAGGGTTTCCCC3’；扩 增的片段长度约为350bp。
建立PCR反应体系：菌液4μL，正向引物，10μmol/L0.5μ L，反向引物10μmol/L 0.5μL，DNA TAQ Master(2×)10μL， 补充水至20μL。反应条件：95℃预变性30s，95℃变性20s，59℃ 退火15s，72℃延伸30s，30个循环。
取儿童粪便常见的几种其他微生物，包括：梭壮芽孢杆菌、大肠 杆菌、埃希氏杆菌、梭菌以及乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌、产气夹 馍菌，将上述菌液作为PCR反应的模板进行PCR扩增反应，反应结束后， 进行凝胶电泳检测，检测结果如图1所示。
从图1的检测结果可以看出，本发明涉及的引物具有较好的特异 性，能够区分儿童粪便中的乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌、产气夹馍 菌，而不会扩增出其他粪便中常见的菌种。
实施例2 引物灵敏度检测以及标准曲线的建立
将各细菌回收16S rDNA基因产物作为标准品，梯度稀释后用来 制作标准曲线，从而实现对待测样本某一类型的细菌绝对定量。
2.1 16S rDNA基因产物的回收
紫外透射仪下切取含目的条带的琼脂糖凝胶，应用琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒回收用于制作标准品的目的片段，具体步骤如下：
(1)向吸附柱中加入500μl平衡液BL，11 000r·min-1离心 1min，弃掉收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(2)向胶块中加入5倍体积溶液PN(0.1g凝胶体积≈100μl)， 放入50℃水浴10min，使胶块完全溶解。
(3)待溶胶液降至室温后加入到吸附柱CA2中，室温放置2min， 后11 000r·min-1。
离心1min，弃掉收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(4)向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW，11 000r·min-1离心1min，弃掉收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(5)重复上一步。
(6)11 000r·min-1离心2min，尽量去除漂洗液，并在室温下 晾干。
(7)将吸附柱CA2放到一个新的离心管内，向吸附膜中间位置 加入50μl洗脱缓冲液，室温放置2min，11 000r·min-1离心2min 收集DNA溶液。
(8)将收集液再次放入吸附柱中，11 000r·min-1离心2min， 提高DNA回收量。通过超微量分光光度检测回收DNA模板浓度，分 装后置于-20℃冻存备用。
2.2标准品质粒稀释：
将计算好拷贝数的回收的DNA模板标准品进行10倍比稀释， 选择每微升拷贝数为106、105、104、103、102、101、100的样品进行qPCR 检测，测定该检测方法的灵敏度。
2.3荧光定量PCR反应体系的建立
荧光定量PCR反应液配制：配制混合液，反应体积25μL，，同时设 置阴性对照，10×CPR Buffer2.5μL，4×dNTP(2.5mM)2μL， MgCl2(25mM)2.5μL，上游引物(0.25μM)0.25μL，下游引物(0.25μ M)0.25μL，Taq酶(IU/μL)0.75μL，DNA模板3μL，荧光染料 SYBRgreen2.5μL，双蒸水11.75μL。混匀后加50μL的石蜡以防止 反应液的蒸发，做好标记，盖紧盖子，按顺序放入GenemAp5700型荧光 定量PRC仪进行扩增与分析。
荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃ 退火、延伸、采集荧光32s，40个循环，最后进入溶解曲线程序， 检测有无非特异扩增。
以标准品中16S rDNA基因的拷贝数为横坐标，以定量PCR仪 中Ct值为纵坐标，制备标准曲线。
乳酸杆菌的荧光定量PCR图以及标准曲线分别如图2和图3所示， 获得的标准曲线方程为：y＝-3.0058x+36.246，R2＝0.9965。
双歧杆菌的荧光定量PCR图以及标准曲线分别如图4和图5所示， 获得的标准曲线方程为：y＝-3.0124x+36.882，R2＝0.9983。
拟杆菌的荧光定量PCR图以及标准曲线分别如图6和图7所示， 获得的标准曲线方程为：y＝-3.0447x+37.086，R2＝0.9976。
产气夹馍菌的荧光定量PCR图以及标准曲线分别如图8和图9所 示，获得的标准曲线方程为：y＝-2.7806x+37.115，R2＝0.9988。
从获得的结果可以看出，拷贝数的对数与Ct值之间存在良好的 线性关系，其R2值都在0.99以上。我们得到了各自的标准曲线方 程，往后，我们通过实验检测样本的Ct值，代入到方程中，就能估 算样本的拷贝数。
实施例3 正常及肥胖儿童肠道粪便菌群基因组DNA的制备
3.1样本的选取
测量研究对象(学龄前)的身高体质量，按照国际算法计算BMI。 超重肥胖标准按国际卫生组织推荐的标准，以不同年龄，不同性别的 BMI指标为基础，确定超重肥胖。15名超重肥胖儿童为实验组，随机 抽取15名正常儿童为对照组。儿童相关情况如下表1。
表1：实验组及对照组儿童基本情况
3.2粪便采集
对于符合要求的研究对象，在无菌干燥的粪便采集盒中留取新鲜 晨便，保存于4℃，并且在4h以内送往实验室，保存于-80℃冰箱 中。
3.3粪便菌群基因组DNA(采用百艾克公司粪便基因组提取试剂 盒)，具体操作步骤如下：
1)称取冻存好的粪便标本约0.2g放入2ml的离心管中；
2)称取约300mg的直径0.1mm的玻璃珠倒入1步中；
3)用微量加样器吸取1.4ml的Buffer L加入，振荡约2min，封口膜 封口；
4)将离心管放入95℃水浴锅中水浴5min，取出后振荡2min；
5)加入180μL浓度为20mg/ml的溶菌酶，放入37℃水浴30min，取 出后5000g离心2min；
6)取1.2ml上清液放入2ml离心管，每管各放入1片InhibitEx Tablet，祸旋1min，室温放置1min，14000rpm离心3min；
7)将上清吸取出来放入1.5ml离心管，14000rpm离心3min；
8)吸取5μL Proteinase K放入新的1.5ml离心管中；
9)吸取7步离心管中上清液2ml放入8步离心管，加入200μL Buffer AL，祸旋15s，70℃水浴10min；
10)取出后加入200μL乙醇(96％-100％)，祸旋，简短离心，去除顶 盖与内壁粘附的液体；
11)将步骤10中液体转入柱状管及2ml收集管，14000rpm离心1min， 将柱状管转入新的2ml收集；
将柱状管转入新的2ml收集；
12)加入500μL Buffer 1，14000rpm离心1min，将柱状管转入新 的2ml收集管；
13)加入500μL Buffer 2，14000rpm离心3min，将柱状管转入新 的2ml收集管，4000rpm离心1min；
14)将柱状管放入新的1.5ml的离心管，放入100μL BufferAE，室 温下3min，1000rpm离心1min；
15)丢弃柱状管，盖上离心管盖，标记后存入-20℃冰箱。
实施例4 儿童粪便中乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌、产气夹馍菌 含量的测定
取提取的各个儿童样本的粪便基因组DNA，经过一定的倍数稀 释后作为荧光定量PCR模板，按照实施例2的方法进行荧光定量PCR。 并根据各个菌种的标准曲线，所得结果经对数转换后以Algx±Blxg 表示，肥胖组和对照组间各类细菌拷贝的比较用SPSS ForWindows 22.0版统计软件包行t检验，以P(＜0.05)判定差异有统计学意义。进一步 计算各个儿童样本粪便中的菌种拷贝数并计算平均值。测定结果如表 2所示。
表2：两组儿童粪便四类细菌的定量结果(Algx±Blxg拷贝数/g湿便)
肠道菌类型
肥胖组(15例)
正常组(15例)
t值
p值
乳酸杆菌
9.652±0.971
7.823±0.673
2.565
0.132
拟杆菌
8.332±0.713
9.881±0.776
1.432
0.241
双歧杆菌
6.482±0.819
7.993±0.682
0.573
0.087
产气夹馍菌
7.496±0.815
5.463±0.732
0.087
0.301
从粪便肠道菌群中各个菌种的拷贝数可以看出，肥胖组儿童粪便 乳酸杆菌、产气夹馍菌、拟杆菌以及双歧杆菌的量来检测及预判儿童 是否患有肥胖症及患肥胖症的倾向。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以 做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
