具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

本实施例中，选取 2018 年 1 月至 2020 年 04 月在江苏大学附属武进医院接受治疗的250 例急性轻型缺血性卒中患者的临床资料，纳入标准: （1）年龄≥18 岁；（2）首次非心源性急性轻型缺血性卒中，定义为由血管原因引起的突发性局灶性神经功能障碍，美国国立卫生研究院卒中量表评分（NIHSS）≤3 分；（3）头颅 CT 或 MRI排除出血或证实新发脑梗死；（4）发病时间≤48h，并能在症状出现后 48h 内开始给予抗血小板药物治疗。如果符合下列标准之一，患者将被排除在参与研究范围之外，排除标准：（1）有出血或其他情况，如血管畸形、创伤、肿瘤、脓肿、神经退行性疾病等；（2）动脉炎、遗传性急性缺血性脑血管病等非动脉粥样硬化致急性缺血性脑血管病；（3）在 CT 或 MRI 基础上没有急性梗死的证据；（4）有明确的抗凝治疗指征（可能是心源性栓塞，如房颤或人工心脏瓣膜）；（5）有出血倾向、活动性消化性溃疡及近期活动性出血等氯吡格雷或阿司匹林禁忌征；（6）严重精神疾病症状临床不能配合的患者；（7）全身性传染病、自身免疫性疾病、严重的心、肝、肾疾病；（8）有颅内出血史、3 个月前有消化道出血或消化道内大手术史；（9）服用质子泵抑制剂；（10）合并有血液疾病者，血小板计数＞450×10/L或＜100 ×10/L 或血红蛋白＜80g/L；（11）长期服用非甾体类抗炎药物或阿司匹林、氯吡格雷以外的抗血小板药物；（12）筛查后3 个月内有血管重建术计划可能；（13）有严重的非心血管疾病并存，预期寿命不足 3 个月。纳入本研究中的所有患者均符合动脉粥样硬化性急性缺血性脑卒中诊断，均在静脉溶栓时间窗之外，未接受溶栓治疗，所有患者均使用氯吡格雷和阿司匹林进行抗血栓治疗。本研究经江苏大学附属武进医院伦理委员会批准，参与本研究的患者具有完整的临床资料，所有患者或监护人签署知情同意书。

随机分组与治疗：诊断急性轻型缺血性卒中患者，在出现症状的 48h 内按 1:1的比例随机分配给试验组或对照组。试验组是根据患者入院第 1d 基因多态性检测结果和第8d 的 TEG 检测 ADP、AA 抑制率结果选择抗血小板治疗。主要目的是评估两组治疗方案对急性轻型缺血性卒中患者 90d 内卒中复发率的影响。所选药物为阿司匹林（ 商品名：拜阿司匹灵，拜耳医药有限公司） 及氯吡格雷（ 商品名：波立维，赛诺菲安万特制药有限公司）。

药物基因检测: 通过 PCR和 Sanger 法测序技术检测阿司匹林和氯吡格雷相关的基因多态性位点，PC 仪和测序仪均购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司。随机分组后立即抽入选试验组患者的静脉血 2ml 于 EDTA 抗凝管中，按照全血基因组 DNA 提取试剂盒说明书提取 DNA，根据相关基因检测试剂盒（ 上海百傲生物科技有限公司）说明书，再将提取的 DNA 进行 PCR 扩增，最后将扩增产物使用测序仪进行测序。酶切反应条件:变性：94℃，5 min，94℃，30s；退火：56℃，20s；延伸：72℃，20s。共 35 个循环，最后 72℃ 延伸 5min。将扩增产物置于1.5%琼脂糖中进行凝胶电泳，应用凝胶成像系统扫描电泳条带，并进行分析。阿司匹林相关基因检测 COX-1（A>G）、ITGB3（T>C）基因，G、C 为阿司匹林抵抗相关等位基因；氯吡格雷相关基因检测 CYP2C19 基因* 2（681G/A）、* 3（636G/A）、* 17（-806C/T），功能缺失等位基因携带者为至少有 1 个功能缺失等位基因（即*2 或*3）的患者：*1/*2、*1/*3、*2/*2、*2/*3、*3/*3、*2/*17 或*3/*17；功能缺失等位基因非携带者为无功能缺失等位基因的患者：*1/*1，*1/*17，或*17/*17。引物均由 Primer 3 软件生成（表2）。根据 CYP2C19 *2、*3和*17 基因型进行代谢型分类，分为强代谢型：野生型纯合子组（CYP2C19*1/*1，快代谢型）+（CYP2C19*1/*17 超快代谢型）；弱代谢型：野生型与突变基因杂合子组（CYP2C19*1/*2 和 *1/*3，中间代谢型）+突变基因纯合子或杂合子组（CYP2C19*2/*2、2/*3 和 *3/*3，慢代谢型）[10]。

TEG 检测: 使用 TEG5000 型凝血分析仪，试剂包括高岭土（含 1% Kadin 液）、激活剂、花生四烯酸（arachidonicacid,AA）和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP），均为美国 Haemoscope 公司产品。所有患者于第 8d 晨起空腹抽取 6mL 肘静脉血，分别放入肝素试管和枸橼酸盐试管中，2h 内检测 AA 途径诱导的血小板抑制率（AA%）和 ADP 受体途径诱导的血小板抑制率（ADP%） 。

结果判定：AA 抑制率＜50%，定义为 AR；ADP 抑制率＜30%，定义为 CR。

临床资料收集及随访

收集所有入组患者的基线资料，包括年龄、性别、体重指数（BMI）、发病至入组时间、NIHSS 评分、卒中危险因素 （如高血压、糖尿病、高胆固醇血症、高同型半胱胺酸血症、吸烟、饮酒史） 、病灶分布、病因分型。所有患者出院后均进行电话随访或门诊随访，了解他们 90d 内是否有新发脑卒中（缺血性和出血性），以及复合心脑血管事件（包括非心源性TIA、新发脑卒中、心绞痛、心肌梗死、血管性死亡）和出血事件（包括眼睛、鼻腔、牙龈、皮肤、颅内、消化道和泌尿系统出血）。血管性死亡定义为卒中（缺血性或出血性）、全身出血、心肌梗死、充血性心力衰竭、肺栓塞、猝死、心律失常所致死亡。出血性脑卒中的定义为急性血液外渗至脑实质或蛛网膜下腔，并伴有相关的神经症状。如果改良后的 Rankin（mRS）评分为2 分或 2 分以上，则认为反复发作的卒中是致残的。

统计方法: 所有数据均采用 SPSS17.0 统计软件包进行处理。计量资料符合正态分布的采用均数±标准差（）表示，不符合正态分布的采用中位数，两组间均数比较采用独立样本 t 检验。计数资料用例数和百分率表示，组间比较采用χ² 检验。所有检验均为双侧检验，以 P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

两组患者的临床基线资料比较

2017 年 1 月至 2020 年 4 月，共有 250 例急性轻型缺血性卒中患者被纳入研究，按 1:1 的比例随机分配到试验组和对照组。总体中位数年龄 66 岁，39.2%的患者为女性，平均 BMI 为 24.4±3.0 Kg/m2 。从发生卒中到随机化入组的中位数时间为 20h。总共94.4%的患者有高血压病史，43.2%有糖尿病史，48.0%有吸烟史，32.8%有饮酒史，22.4%有高同型半胱血症，41.2%有高胆固醇血症。两组患者之间在性别、年龄、体重指数（BMI）、入院时NIHSS 评分、发病至随机入组时间、高血压、糖尿病、高脂血症、高同型半胱胺酸血症、吸烟、饮酒、病灶部位、病因分型等方面比较无统计学差异（P＞0.05，），具有可比性。

试验组药物基因检测与 TEG 检测结果

经 COX-1 和 ITGB3 基因检测，发现 COX-1 的-1676A >G 位点中，有 69 例为野生 AA 型，56 例为变异型，占 44.8%，其中 42 例为 AG 型杂合变异，14例为 GG 型纯合变异。-842A>G 位点中，未发现有变异型等位基因。ITGB3 的1565T>C 位点中，有 111 例为野生 TT 型，14 例为变异型，占 11.2%，其中 12例为 TC 型杂合变异，2 例为 CC 型纯合变异。只有 5 例均携带有 COX-1 和 ITGB3基因的变异型等位基因，共有 65 例携带有 AR相关等位基因，占 52.0%。经CYP2C19 基因检测，氯吡格雷强代谢型 54 例，占 43.20%，其中 CYP2C19* 1/* 1 共 52 例，CYP2C19* 1/* 17 共 2 例；氯吡格雷弱代谢型 71 例，占56.80%，其中 CYP2C19*1/*2 共 44 例，CYP2C19*1/* 3 共 6 例，CYP2C19*2/*2 共 13例，CYP2C19*3/*3 共 2 例，CYP2C19*2/*3 共 6 例。有 33 例（26.4%）均携带阿司匹林抵抗和氯吡格雷弱代谢的相关等位基因。阿司匹林和氯吡格雷双联抗血小板治疗第 8d，经TEG 检测结果提示 AA 抑制率＜50%，有 3 例（2.4%），均不携带 PTGS1 和 ITGB3 基因的变异型等位基因；ADP 抑制率＜30%，有 12 例（9.6%），有 1 例为 CYP2C19* 2/* 3；未发现同时有 AA 抑制率＜50%和 ADP 抑制率＜30%的病例。

随访 90d 内，试验组有 4 例（3.2%）患者发生卒中，对照组有 12 例（9.6%）发生卒中，与对照组相比，两组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。试验组有 2 例（1.6%）患者发生致残性卒中，对照组有 7 例（5.6%），两组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。试验组和对照组均无出血性卒中发生。试验组有 5 例（4.0%）发生复合血管事件，对照组有 14 例（11.2%），两组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。试验组有 1 例（0.8%）患者发生 TIA，对照组有 2 例（1.6%），两组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。两组均未发生心血管事件以及血管性死亡或其他原因死亡事件。

TEG 是一种通过检测血栓粘弹力的变化并以图形的方式动态反映凝血、血小板聚集和纤溶功能的方法。近年来，TEG 越来越多地被应用于检测 AR 和 CR。通过 TEG 可以检测服用不同抗血小板药物后机体的反应情况，其中 ADP 诱导的血小板聚集抑制率检测可反映机体对氯吡格雷的反应性，而 AA 诱导的血小板聚集抑制率可反映机体对阿司匹林的反应性。国内有研究报道非心源性缺血性卒中患者急性期给予双抗治疗后，根据 TEG 结果选择敏感抗血小板聚集药物能提高患者临床预后，不增加出血风险。因此，本研究通过联合检测阿司匹林和氯吡格雷的相关基因多态性以及 TEG 检测血小板抑制率，指导选择抗血小板药物和维持剂量，明确基因多态性联合 TEG 在指导轻型缺血性卒中患者个体化抗血小板治疗中的应用价值。

根据药物基因多态性联合 TEG 指导轻型缺血性卒中抗血小板治疗能有效降低90d 内新发卒中风险，且不会增加出血风险。基因检测联合 TEG可及时发现对抗血小板药物治疗不敏感的患者，能为抗血小板治疗药物的选择提供新的依据，使缺血性卒中患者能更加精准、合理地选择抗血小板药物，从而制定个体化的抗血小板治疗方案，有效降低卒中复发的风险，对于缺血性卒中二级预防具有重要的指导意义，值得临床推广应用。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。