Mef2c在诊断和治疗哮喘中的用途
技术领域
本发明涉及生物技术、生物医药领域，具体涉及MEF2C在诊断和治疗哮喘中的用途。
背景技术
哮喘是一种常见呼吸系统疾病，其发病机制包括：变态反应、气道慢性炎症、气道高反应性、气道神经调节失常、遗传机制、呼吸道病毒感染、神经信号转导机制和气道重构及其相互作用等，主要表现为发作性的喘息、气急、胸闷或咳嗽等症状，或原有症状急剧加重，常有呼吸困难，以呼气流量降低为其特征；常因接触变应原、刺激物或呼吸道感染诱发。其程度轻重不一，病情加重，可在数小时或数天内出现，偶尔可在数分钟内即危及生命。支气管哮喘(bronchial asthma)是由多种细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症为特征的异质性疾病。多在夜间和清晨发作、加剧，多数患者可自行缓解或经治疗缓解。支气管哮喘如诊治不及时，随病程的延长可产生气道不可逆性缩窄和气道重塑。近年来，全球范围内支气管哮喘发病率和死亡率呈逐年上升趋势。
肌细胞增强因子2C(Myocyte Enhancer Factor 2C，MEF2C)是MEF2亚家族的成员之一，与平滑肌的发育、造血干细胞的分化、炎症通路信号转导息息相关。
甲基化程度的变化会通过改变染色质结构及稳定性、改变转录因子结合活性等方式改变基因的表达情况。一般来说，低甲基化有利于基因的表达，高甲基化会抑制基因的表达。目前有研究证实DNA甲基化的状态与某些肿瘤的发生具有高度的相关性。可通过DNA甲基化来评价肿瘤是否发生，以及治疗措施对肿瘤的疗效。
本领域中有多种方法检测DNA的甲基化。甲基化敏感限制性内切酶-PCR/Southern法(Methylation-Sensitive Restriction Endonuclease-PCR/Southern，MSRE-PCR/Southern) 是利用甲基化敏感限制性内切酶将DNA切割为大小不同的片段，并进行PCR/Southern 分析的方法。另还有基于经重亚硫酸盐处理的，以及在此基础上衍生出的一些甲基化分析方法，例如重亚硫酸盐测序法(Bisulphite Sequencing)、甲基化特异性PCR(Methylation- Specific PCR，MS-PCR)、焦磷酸测序(Pyrosequencing)、结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(Combined Bisulfite Restriction Analysis，COBRA)等等。近年来涌现出不少基于全基因组的甲基化分析方法，也称为甲基化图谱分析(MethylationProfiling)，该方法检测样本量大，可检测多个位点。
发明内容
本课题组通过全基因组研究发现哮喘患者外周血及鼻上皮细胞中MEF2C发生低甲基化。本研究进一步通过探究MEF2C在哮喘患者中DNA甲基化水平、表达水平变化，提供了DNA表达量和甲基化程度在诊断哮喘气道炎症中的应用，优选地，所述哮喘是支气管哮喘；同时还提供了MEF2C的抑制剂在治疗哮喘中的应用。
诊断疾病的应用
一方面本发明提供了检测MEF2C表达量和/或甲基化程度的试剂在制备诊断受试者是否患有哮喘的产品中的应用。
优选地，所述哮喘包括支气管哮喘、变应性哮喘、运动诱发性哮喘、药物诱发性哮喘和粉尘诱发性哮喘。
优选地，所述哮喘是支气管哮喘。
优选地，所述哮喘包括间歇性哮喘或持续性哮喘。
优选地，所述哮喘包括内源性哮喘或外源性哮喘。
优选地，所述受试者是疑似患有哮喘的人。
优选地，所述MEF2C在受试者中高表达。
优选地，所述MEF2C在受试者中甲基化程度低。
优选地，所述高表达指MEF2C表达水平大于健康对照群体中MEF2C表达水平，相对于对照表达水平高至少1.1倍，例如至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、 1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、 2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍或3.5倍或更多。
优选地，所述甲基化程度低指MEF2C甲基化程度小于健康对照群体中MEF2C甲基化程度，例如是对照MEF2C甲基化程度的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、 70％、80％、90％。
优选地，所述检测MEF2C表达量的试剂包括检测MEF2C mRNA表达量和/或 MEF2C蛋白表达量的试剂。
优选地，所述检测MEF2C mRNA表达量的试剂包括以下方法中使用到的试剂：基于PCR的检测方法、Southern杂交方法、Northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、DNA微阵列方法、ASO法、高通量测序平台方法。
优选地，所述方法是定量或定性的方法。
优选地，所述基于PCR的检测方法包括以下任意一种：将提取RNA的步骤、mRNA 逆转录为cDNA的步骤、测量cDNA的含量的步骤。
优选地，所述测量cDNA的含量的方法包括但不限于PCR、NASBA、RPA、SDA、 LAMP、HAD、NEAR、MDA、RCA、LCR、RAM。
优选地，所述基于PCR的检测是RT-qPCR(实时荧光定量，Real-time fluorescencequantitative PCR，RT-qPCR)检测。
优选地，所述检测MEF2C mRNA表达量的试剂包括特异性引物和/或探针。
优选地，所述探针包括杂交型探针和水解型探针(Taqman探针)。
优选地，所述探针的两端连接有淬灭基团和/或荧光基团。
优选地，所述检测MEF2C蛋白表达量的试剂包括以下方法中使用的试剂：蛋白质印迹(Western Blot法)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分边技术和蛋白质芯片法。
优选地，所述检测MEF2C蛋白表达量的试剂包括蛋白质印迹(Western Blot法)和/或ELISA方法所使用的试剂。
优选地，所述检测MEF2C蛋白表达量的试剂包括MEF2C的抗体或其片段，所述MEF2C的抗体或其片段能特异性的与MEF2C蛋白结合。
优选地，所述检测MEF2C蛋白表达量的试剂还包括二抗，所述二抗能与前述 MEF2C的抗体或其片段结合并且显色。
优选地，所述显色通过显色剂体现，所述显色剂包括但不限于荧光染料(荧光分子)、化学发光标记物、酶、金属离子、生物素、放射性同位素、在UV光谱中进行吸收的分子、在近红外辐射中能够进行吸收的分子或远红外辐射中能够进行吸收的分子。
优选地，所述荧光染料包括但不限于罗丹明、对甲氨基酚、荧光素、硫代荧光素、氨基荧光素、羧基荧光素、氯代荧光素、甲基荧光素、磺基荧光素、氨基对甲氨基酚、羧基对甲氨基酚、氯代对甲氨基酚、甲基对甲氨基酚、磺基对甲氨基酚、氨基罗丹明、羧基罗丹明、氯代罗丹明、甲基罗丹明、磺基罗丹明、以及硫代罗丹明、菁、吲哚碳菁、氧杂碳菁、噻碳菁、部花青、菁染料、噁二唑衍生物、吡啶基噁唑、硝基苯噁二唑、苯并硝基苯、芘衍生物、瀑布蓝、噁嗪衍生物、尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170、吖淀衍生物、前黄素、吖啶橙、吖啶黄、芳基甲川衍生物、金胺、噻吨染料、磺化噻吨染料、亚历克萨荧光(AlexaFluor)、结晶紫、孔雀绿、四吡咯衍生物、卟啉、酞菁、胆红素、Cy5.5、吲哚菁绿(ICG)、DyLight750或IRdye800。
优选地，所述化学发光标记物包括但不限于过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、水母发光蛋白、官能化的铁-卟啉衍生物、鲁米那、鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、磺酰胺等。
优选地，所述荧光素酶包括但不限于长腹水蚤(Gaussia)荧光素酶、海肾(Renilla) 荧光素酶、腰鞭毛虫荧光素酶、萤火虫荧光素酶、真菌荧光素酶、细菌荧光素酶和弯喉萤(vargula)荧光素酶。
优选地，所述MEF2C的抗体或其片段还可以直接与显色剂结合，检测到所述显色剂显示就表示MEF2C蛋白有表达。
优选地，所述检测MEF2C甲基化程度的试剂以下任意一种或多种甲基化检测方法所使用的试剂，所述甲基化检测方法包括：焦磷酸测序(Pyrosequencing)、亚硫酸氢盐测序、甲基化特异性聚合酶链式反应(甲基化特异性PCR，Methylation-Specific PCR， MS-PCR)、亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、甲基化敏感限制性内切酶-PCR/Southern 法、结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(Combined Bisulfite Restriction Analysis，COBRA)、数字聚合酶链式反应、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸SNUPE、甲基化图谱分析(Methylation Profiling)中一种或多种方法所使用的试剂。
优选地，所述甲基化检测方法是甲基化图谱分析。
优选地，所述甲基化检测方法是属于甲基化图谱分析的MassARRAY技术。
优选地，所述产品中还包括收集和/或处理样品的试剂。
优选地，所述样品包括：外周血、鼻上皮细胞、组织、血清、血浆、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液。
优选地，所述样品是外周血。
治疗患者的应用
另一方面本发明提供了MEF2C基因的抑制剂在制备治疗患者的产品中的应用，所述抑制剂可以敲除MEF2C基因或提高MEF2C基因的甲基化程度，从而达到降低 MEF2C基因表达的效果。
优选地，所述患者是被诊断患有哮喘疾病的患者。
优选地，所述抑制剂包括siRNA干扰、CRISPR/cas9方法、同源重组、基因敲除、基因置换、基因沉默、定点突变、化学药物方法所使用的试剂。
产品
另一方面本发明提供了一种诊断受试者是否患有哮喘的试剂盒，所述试剂盒包括前述检测受试者的MEF2C的表达量和/或甲基化程度所使用的试剂。
优选地，所述试剂盒还包括前述检测受试者的MEF2C的表达量和/或甲基化程度所使用的仪器；
优选地，所述试剂盒还包括检测其他疾病标志物的试剂和/或仪器。
优选地，所述其他疾病标志物包括IL-6、IL-8、TNF-α。
另一方面本发明提供了一种治疗哮喘患者的药物组合物，所述药物组合物包括前述 MEF2C基因的抑制剂。
优选地，所述药物组合物可以为片剂(包括糖衣片剂，膜包衣片剂，舌下片剂，口腔崩解片，口腔片剂等等)，丸剂，粉剂，颗粒剂，胶囊剂(包括软胶囊，微胶囊)，锭剂，糖浆剂，液体，乳剂，混悬剂，控制释放制剂(例如，瞬时释放制剂，缓释制剂，缓释微囊)，气雾剂，膜剂(例如，口服崩解膜剂，口腔粘膜-粘附膜剂)，注射剂(例如，皮下注射，静脉注射，肌内射，腹膜内注射)，静脉滴注剂，透皮吸收制剂，软膏剂，洗剂，粘附制剂，栓剂(例如，直肠栓剂，阴道栓剂)，小药丸，鼻制剂，肺制剂(吸入剂)，眼睛滴剂等等，口服或胃肠外制剂(例如，静脉内，肌内，皮下，器官内，鼻内，皮内，滴注，脑内，直肠内等给药形式，给药至肿瘤的附近和直接给药至病变处)。
方法
另一方面本发明提供诊断受试者是否患有哮喘的方法，所述方法包括检测受试者的 MEF2C的表达量和/或甲基化程度。
另一方面本发明提供了一种治疗哮喘患者的方法，所述方法包括降低患者的MEF2C基因表达和/或提高MEF2C基因的甲基化程度。
附图说明
图1为对照组与哮喘组的外周血MEF2C mRNA相对表达水平对比结果图。
图2为对照组和哮喘组的MEF2C DNA甲基化比例比较结果图。
图3为MEF2C mRNA与肺功能相关性分析结果图，A图是MEF2C mRNA与一秒用力呼气量占用力肺活量比值(FEV1/FVC)相关性分析，B图是MEF2C mRNA与第1秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV1％prep)相关性分析。
图4为MEF2C mRNA与血浆IgE相关性分析结果图。
图5位MEF2C mRNA在辅助诊断哮喘时的ROC曲线图。
图6为HDM对BEAS-2B细胞活力的影响分析结果图。
图7为HDM对BEAS-2B细胞L-6、IL-8、TNF-α的表达量的影响分析结果图，A图是mRNA相对表达量，B图是蛋白表达量。
图8为5-Aza-CdR对MEF2C的mRNA和蛋白水平的影响结果图，A图是相对mRNA 水平，B图是蛋白表达水平。
图9为5-Aza-CdR处理前后MEF2C DNA甲基化百分比的结果图。
图10为MEF2C去甲基化对炎症的影响的结果图，A是mRNA水平变化，B是蛋白表达变化，C是p65蛋白表达变化，D是IL-6的mRNA水平，E是IL-8的mRNA水平， F是TNF-α的mRNA水平。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1、哮喘患者外周血MEF2C基因表达、DNA甲基化水平与哮喘的相关性研究
本课题组前期对6名支气管哮喘患者及5名健康志愿者鼻上皮细胞和外周血白细胞的全基因组DNA甲基化分析发现，鼻粘膜上皮细胞基因启动子区域的差异性甲基化位点共有13627个，外周血白细胞基因启动子区域差异性甲基化位点共有3840个，通过GO分析及Pathway分析发现，差异性甲基化位点与钙信号通路、Rap1信号通路、局灶性粘连、肾上腺素信号传导等通路有相关性。鼻上皮及外周血白细胞中，MEF2C 基因DNA甲基化水平发生改变。
1.研究对象
选取2019年9月至2020年9月于江苏大学附属医院呼吸内科门诊就诊的成年支气管哮喘患者15例，体检中心健康志愿者15例。并将其分为哮喘组和对照组。哮喘组男7例、女8例，平均年龄(45±10.3)岁首次诊断为支气管哮喘。对照组男8例、女7例，平均年龄(44±11.2)岁。两组基线资料相比较具有可比性(P>0.05)。
纳入和排除标准
纳入标准：①首次诊断支气管哮喘，符合《支气管哮喘防治指南》(2016年版) 中支气管哮喘诊断标准；②年龄18-65周岁；③既往有2位及以上医生诊断哮喘病史，且入组时或过去12个月中出现明显喘息及胸闷等呼吸道症状；④有自主行为能力，能配合进行肺功能检查。
排除标准：①COPD、支气管扩张、间质性肺病等其他慢性呼吸道疾病；②血液系统疾病及风湿免疫性疾病；③糖尿病、高血压、冠心病、肿瘤患者；④孕妇及不能配合者。
2.实验方法
一般资料的采集
所有入组患者需填写支气管哮喘流行病学调查表，统一所有研究对象的调查信息，包括(1)患者基本信息，如姓名、性别、年龄、身高、体重、职业等；(2)既往病史资料，包括高血压、糖尿病等慢性遗传病史、家族性遗传病史、吸烟史、过敏史；(3)发病情况，如首次发病情况、哮喘好发季节、发病的诱因、发病次数、治疗情况等。所有研究人群均接受了全面的医学评估，以确保诊断的准确性。该研究得到江苏大学附属医院研究伦理委员会的批准，所有参与者均提供了书面知情同意书。
血样采集
用EDTA抗凝采血管抽取所有入组患者外周静脉血4ml，充分颠倒混匀后，提取外周血白细胞，或-80℃冰箱保存。
外周血白细胞的分离
(1)使用EDTA抗凝管抽取静脉血后，低温超速离心机3500g，离心5min，收集血浆2ml，置入液氮罐5min后移入-70℃冰箱保存。
(2)用移液器吸取中间白色细胞层至高温高压灭菌后的EP管内，加入3倍体积的红细胞裂解液，充分吹打混匀，静置15min后3500g离心5min，弃去上清液，保留底部白色沉淀。
(3)向EP管内加入1ml红细胞裂解液，再次吹打混匀，室温静置15min后3500g离心5min，弃去上清液。如此反复，直至沉淀中无明显红色。
(4)提取的白细胞用于提取RNA或者DNA，或移入-70℃冰箱保存备用。
细胞总RNA的提取
(1)取出处理好的外周血白细胞，每个1.5mlEP管内加入1ml RNAiso Plus，适当轻晃或移液器反复吹打混匀至溶解液中无明显沉淀，室温静置5min。
(2)按1:5比例吸取200μl氯仿至离心管内，剧烈震荡混匀至溶液呈乳白色，室温静置5min。置入预冷的超速离心机中，12000g，4℃，离心15min。
(3)小心取出离心好的EP管，此时离心液分三层，上层无色透明上清液含RNA。吸取上清液至另一新的EP管内，避免吸入中间白色层及下层粉色液体。吸取500μl异丙醇加入EP管内，上下颠倒混匀，冰内静置10min后12000g，4℃，离心10min。
(4)取出离心管，弃去上清液，向EP管内加入用DEPC水和无水乙醇配制的75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒清洗管壁。7500g，4℃，离心5min后小心弃去上清液。
(5)打开离心管盖，室温干燥数分钟至离心管内无明显液体附着。同时预热水浴锅至 65℃。
(6)向离心管中加入20μl DEPC水溶解沉淀，加入预热的水浴锅中10min充分溶解RNA。
(7)按照紫外分光光度仪操作说明检测RNA的浓度及纯度，测量三次取均值。
cDNA的制备(反转录)
根据测得的RNA浓度，计算每孔加入1000ng总RNA所需的体积。按照 PrimeScriptTMRT Reagent Kit反转录试剂盒操作说明配制如下表1所示的20μl反应体系。整个配制反应液过程须在冰上进行。
表1.反转录的反应体系
加样后用移液器吹打混匀，并短暂离心。将200μlEP管放入逆转录扩增仪内，按照37℃、15min(反转录反应)，85℃、5s(反转录酶的失活反应)，4℃、∞条件设置反应参数；反应结束后进行实时荧光定量PCR反应或置于-20℃冰箱保存备用。
实时荧光定量PCR
以逆转录制备cDNA为模板，按照Takara公司的SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明书配制PCR反应液，反应体系如表2所示(反应液配制过程均在冰上进行)。
表2.实时荧光定量PCR的反应体系
加样后用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心后置入PCR扩增仪内，设置扩增参数如下：预变性：95℃3s；PCR反应：95℃5s循环40次；引物退火：60℃34s，引物延伸：60℃1min。
获取相应的CT值，采用2-△△ct法计算相对定量结果。
引物序列为：
β-Actin：Forward:5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’和Reverse:5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’
MEF2C：Forward:5’-AGGATATCCATCAGCCATTTCAACA-3’和Reverse:5’-GCTGCTGCCAGCCAGTTACA-3’
细胞DNA的提取
(1)向提取的细胞沉淀中加入500μl溶液A，彻底振荡混匀。
(2)向悬液中加入20μl RNase A，55℃放置10min。
(3)向离心管内加入20μl的蛋白酶K，充分混匀后55℃水浴消化30min，消化过程中颠倒混匀数次。12000rpm离心10min，将上清转移至新的离心管。
(4)向离心管内加入500μl溶液B，充分吹打混匀。如出现白色沉淀，可55℃放置5min，至沉淀消失。
(5)加入500μl无水乙醇，充分混匀，将溶液和絮状沉淀都转移至吸附柱中，12000rpm离心2min后弃去废液，将吸附柱放入收集管中。
(6)向吸附柱中加入600μl漂洗液(使用前确认已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃去废液，将吸附柱放入收集管中。
(7)向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心1min后弃去废液，将吸附柱放入收集管中。
(8)12000rpm离心2min后室温放置数分钟，去除吸附柱中残余的漂洗液。
(9)将吸附柱放入一个新的离心管中，65℃水浴预热的洗脱液，向吸附膜中央悬空滴加50-200μl，室温放置数分钟，12000rpm离心2min。
(10)离心所得洗脱液缓慢滴加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，即可得到高质量的基因组DNA。
(11)将DNA溶于适量DEPC水中，检测DNA浓度用于后续试验或置于-70℃冰箱保存。
MassARRAY甲基化技术检测DNA甲基化水平
(1)使用EZ DNA Methylation-GoldTMKit进行基因组DNA甲基化转化反应
①在CT Conversion Reagent粉末中加入900μl纯水、300μl M-Dilution Buffer、50 μl M-Dissolving Buffer，室温下快速震荡10min直至粉末完全溶解。
②准备0.2ml PCR管，标记管盖，向每管中加入130μl CT Conversion Reagent。
③向PCR管中加入20μl DNA，反复吹打混匀，短暂离心。
④将PCR管放入PCR仪中，运行下列程序(启动热盖105℃)：
Step 1：98℃，10min；
Step 2：64℃，150min；
Step 3：4℃，∞。待PCR仪温度降至4℃后，取出PCR管。
⑤取Zymo-SpinTMIC Column(柱子)，将柱子放入试剂盒提供的收集管中，加入 600μl M-Binding Buffer。
⑥将第PCR管中产物全部转移至含有M-Binding Buffer的柱子中，上下颠倒混匀，18000g离心30s，用真空泵吸走收集管中的流出液。
⑦向柱子中加入100μl M-Wash Buffer，18000g离心30s。
⑧向柱子中加入200μl M-Desulphonation Buffer，室温直立孵育20min，18000g离心30s。
⑨向柱子中加入200μl M-Wash Buffer，18000g离心30s。重复该步骤一次。
⑩将柱子转移至1.5ml的离心管中，向柱子中央加入30μl的Elution Buffer，18000g离心30s。
洗脱下来的CT-DNA可立即进行PCR，或保存于-20℃。
(2)PCR反应：取出洗脱的DNA，按照表3配置PCR反应体系，按照表4进行反应：
表3.PCR反应体系
表4.PCR扩增条件
(3)SAP消化反应：取出PCR后的反应板，按照下表5配制SAP酶溶液：
表5.SAP酶溶液成分
试剂名称
体积
ddH2O
1.53μl
SAP Buffer
0.17μl
SAP Enzyme
0.30μl
总体积
2.00μl
SAP反应体系配置好后，取2μl直接加入PCR反应完成的混合液内。按照如下条件进行消化反应：37℃40min，85℃5min，4℃∞。消化完毕后取出反应板。
(4)Mass CLEAVE反应：按照下表6配制反应体系，Mass CLEAVE反应体系配置好后，取5μl直接加入SAP反应完成的混合液内，反应条件如下：37℃3小时。
表6.Mass CLEAVE反应体系
试剂名称
体积
超纯水
3.21μl
5x T7 Polymerase Buffer
0.89μl
T Cleavage Mix
0.22μl
DTT
0.22μl
T7 RNA&DNA Polymerase
0.4μl
Ribonuclease A
0.06μl
总体积
5.00μl
(5)脱盐、上机、打谱，检测分析结果。
肺功能检测
采用日本HI-101肺功能检测仪进行受试者肺功能检测。
肺功能检测前准备：(1)对肺功能仪量程、精度等参数进行质控，保证其在正常的工作状态中。检查开关连接和开关，连接电源和传感器，确保设备工作正常。(2) 肺功能检测前测量患者生命体征，确认患者既往病史，排除肺功能检测禁忌症。(3) 患者检查前安静休息15分钟，练习用口深吸气后，再快速用力(爆发力)吹气并持续6秒不中断的动作，需按医嘱要求停用相应支气管扩张剂，如茶碱类、b2受体激动剂、激素类，抗过敏药等。(4)室内环境应安静，受检者需休息15分钟后检查，并避免过紧的腰带、胸带和衣服等。可在饭后半小时检查，以免过饱影响呼吸。(5)必要时备急救药品和抢救设备。
肺功能检测方法：(1)接通电源，确认电源线、传感器、口套、呼吸过滤器连接准确，进行校零。输入患者姓名、年龄、体重、种族、室温及气压等数据。(2)患者取站位，鼻夹夹住鼻翼，口唇包裹口件，保证鼻腔及口腔不漏气。(3)按〔START〕键后，先正常呼吸两次，然后以更快速度更大用力深吸气，尽量吸至不能继续吸气位置，后以更快速度更大用力深呼气，呼气过程坚持六秒，最后恢复正常呼吸一次。整个呼吸过程，避免中断、咳嗽或双吸气。(4)重复测定3次及以上，变异率不超过 5％，取三次检查最佳值。
血液学检查结果采集
收集所有入组患者血常规及血清总IgE检查结果。
统计学分析
采用SPSS 23.0统计软件进行统计学处理。正态分布资料采用均数±标准差 (x±s)表示，非正态分布计量资料以中位数及四分位数间距(P50(P25-P75))表示，组间两两比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对样本t检验；相关性分析采用 Pearson分析。P<0.05为差异有统计学意义。
3.实验结果
入组患者临床特征
哮喘组和正常对照组各收集了15名受试者，两组之间年龄、性别、BMI等方面无统计学差异(P>0.05)。与正常对照组相比，支气管哮喘组外周血白细胞计数、嗜酸性粒细胞计数、IgE明显增高(P<0.05)，支气管哮喘组患者肺功能明显高于正常对照组(P<0.05)。具体信息如下表所示。
表7.入组患者临床特征收集表
与对照组相比，MEF2C在支气管哮喘患者外周血白细胞中表达增高
采用定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测哮喘组及对照组MEF2C的mRNA相对表达水平。结果如图1显示：支气管哮喘患者的MEF2C mRNA水平高于正常对照组(P<0.05)。
与对照组相比，MEF2C基因DNA甲基化水平降低
MassARRAY甲基化技术在一次反应中同时对检测区段约94％CpG岛进行检测分析，利用MassARRAY甲基化技术对健康对照组及哮喘组外周血白细胞MEF2C基因DNA甲基化进行半定量甲基化分析。结果如图2显示：MEF2C基因存在4个甲基化片段，与对照组相比，哮喘组甲基化水平显著降低(P<0.01)。
MEF2C mRNA相对水平与肺功能相关性分析
以Spearman相关分析比较哮喘患者外周血MEF2CmRNA相对表达水平与一秒用力呼气量占用力肺活量比值(FEV1/FVC)与第1秒用力呼气容积占预计值百分比 (FEV1％prep)之间的相关性。如图3所示，MEF2C mRNA水平与FEV1/FVC和 FEV1％prep呈正相关，与FEV1/FVC相关系数rs＝0.27240，p＝0.046；与FEV1％prep 相关系数rs＝0.2160，p＝0.0409。
外周血白细胞基因与血浆IgE水平相关性分析
以Spearman相关分析比较哮喘患者外周血MEF2CmRNA相对表达水平与血浆IgE水平之间的相关性。结果图4显示：甲基化率与血浆IgE呈正相关，相关系数 rs＝0.3464，p＝0.021。
外周血白细胞基因诊断哮喘的效果验证
根据哮喘组和正常对照组各15名受试者的外周血MEF2CmRNA表达量绘制ROC 曲线，结果如图5所示，MEF2C用于辅助哮喘诊断时AUC为0.804(标准误为 0.085，95％CI为0.619-0.926)，敏感性73.33％，特异性为80.00％。
本研究发现，与正常对照组相比，支气管哮喘患者外周血MEF2C表达增加，利用DNA甲基化检测技术对甲基化水平检测发现，哮喘患者外周血DNA甲基化水平降低，与肺功能、血浆IgE水平具有相关性。根据ROC曲线，MEF2C在诊断哮喘时，特异性和敏感性良好，可以用于临床诊断。
实施例2、MEF2C基因DNA甲基化与HDM诱导的BEAS-2B细胞炎症的关系研究
1.实验对象
人支气管上皮细胞系BEAS-2B，中国科学院上海细胞库，中国
2.实验方法
实验分组
主要分组：
(1)HDM对细胞活力的影响：0U/ml、200U/ml、400U/ml、600U/ml、800U/ml组。
(2)HDM对气道上皮细胞的影响：分对照组和HDM组。
(3)5-Aza-CdR对基因表达的影响：分对照组和5-Aza-CdR组。
(4)DNA甲基化在哮喘炎症反应中的作用：HDM+DMSO组、5-Aza-CdR+HDM 组。
细胞复苏：
(1)从-80℃冰箱取出冻存的BEAS-2B细胞，放入37℃水浴中迅速摇晃，使其在 1-2分钟内融化解冻。
(2)酒精擦拭冻存管，在超净台中将细胞悬液转移至15ml离心管内，加入5ml 培养基并混合均匀。在1000rpm条件下离心5min，弃去上清液，补加1ml培养基后轻轻吹打均匀。
(3)将所有细胞悬液加入10cm培养皿中，加入约6ml培养基，轻轻混匀。将培养皿置于培养箱(37℃，含5％CO2)过夜，第二天换液并检查细胞密度和形态。
细胞传代
(1)从培养箱中取出培养皿，弃去原有培养基，用高压灭菌后不含钙、镁离子的PBS润洗2次。
(2)向培养皿中加入胰蛋白酶消化液(0.25Trypsin-0.53mM EDTA)1ml，将培养皿置于37℃培养箱中消化2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若大部分细胞边缘回缩变圆、细胞间隙增大，迅速拿回超净台，加入5ml培养基，轻轻吹打细胞层，尽可能将所有细胞吹落、打散。
(3)将所有细胞悬液转移至15ml离心管内，1000rpm条件下离心5min，弃去上清液，补加1ml培养基后吹打均匀。
(4)将细胞悬液按1:2的比例分到新的含有6ml培养基的培养皿中，置于培养箱中培养，24小时后观察细胞形态。
细胞冻存
(1)待细胞生长状态良好、细胞密度达95％时，可进行细胞冻存。弃去培养基后，加入2ml PBS清洗2次，加入1ml胰蛋白酶，置于培养箱中消化2min。待细胞变圆脱落后，进行离心收集，在1000RPM条件下离心5min。
(2)离心后去除上清液，吸取1ml冻存液重悬细胞沉淀，并将细胞悬液转移至冻存管内。消毒冻存管后并用封口膜封闭管口，在管壁标签上注明细胞名称、冻存日期及操作人等信息。
(3)最后进行程序降温，4℃20分钟，-20℃1小时，-80℃冰箱过夜后放置液氮罐中保存。
构建屋尘螨诱导的支气管上皮细胞炎症模型
取生长状态良好并铺满细胞培养皿80％以上的BEAS-2B细胞，进行消化、离心、弃上清，加入1ml不含双抗的培养基重悬，用细胞计数板进行计数。按照每孔5*105个细胞接种至6孔板，每孔5*104个细胞接种于96孔板，轻晃混匀，使细胞分布均匀，将培养皿平放，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。待培养板中的细胞培养至 80％融合时，弃去原培养基，分别加入不同浓度HDM(0U/ml、200U/ml、400U/ml、 600U/ml、800U/ml)培养基进行继续培养12h。
CCK-8检测细胞的活力
按照不同浓度HDM浓度进行分组，每组3-5个重复孔。按照每孔5×104个细胞接种于96孔板，待细胞贴壁后加入100μl不同浓度HDM的培养基。37℃，5％CO2培养箱中培养12h后，取出培养板，在超净台中避光加入10μl/孔的CCK-8试剂，轻晃混匀，置于培养箱中继续1-2小时。
取出96孔培养板，设置酶标仪参数，37℃，检测波长为450nm处的吸光度，记录检测结果。细胞存活率＝[(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100％。
细胞总RNA的提取
(1)从培养箱中取出处理好的6孔板，吸去原培养基，1×PBS缓冲液轻轻冲洗2次。
(2)每孔加入1ml RNAiso Plus，轻轻摇晃混匀，使裂解液均匀分布于细胞表面。参考“第二章2.3.4细胞总RNA的提取”
实时荧光定量PCR(同前)
细胞总蛋白的提取
(1)溶解PIPA裂解液并混匀，使用前数分钟内向裂解液中加入苯甲基磺酰氟(PMSF)，使PMSF的最终浓度为1mM。
(2)取出处理好的6孔板，去除培养基，用PBS缓冲液清洗2次，每孔加入200μl裂解液。用移液枪轻轻吹打数次，使裂解液和细胞充分接触，冰上静置5min。
(3)用细胞刮刮下细胞，将细胞悬液吸至1.5ml EP管内，做好标记。12000g 4℃，离心 5min。吸取上清至新的EP管内，做好标记并记录蛋白量。
细胞核蛋白与细胞浆蛋白的抽提
按照碧云天细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书进行操作。
(1)室温溶解三种试剂后冰上保存，在使用前数分钟分别向细胞核蛋白提取试剂和细胞浆蛋白抽提试剂A中加入PMSF，使PMSF最终浓度为1mM。
(2)取出处理好的6孔板，去除培养基，用PBS缓冲液清洗2次，用细胞刮刮下细胞，并用移液器转移至EP管内。12000g 4℃，离心5min。吸去上清，保留细胞沉淀备用。
(3)向细胞沉淀中加入50μl添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A，剧烈振荡混匀5秒，使细胞沉淀完全悬浮并分散，冰浴15min。
(4)向离心管内加入细胞浆蛋白抽提试剂B10μl，剧烈振荡混匀，冰浴1min。
(5)剧烈振荡混匀5s，12000g，4℃，离心5min。
(6)吸取上清液至一新的EP管内(勿触及沉淀)，即为细胞浆蛋白。
(7)吸尽上清液后加入50μl添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂，剧烈振荡混匀30s，冰浴30min。冰浴过程中，每隔1-2min剧烈振荡15s。
(8)12000g，4℃，离心10min。吸取上清至一新的EP管内，即为细胞核蛋白。
蛋白浓度测定
按照碧云天公司BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行操作。
(1)蛋白标准品的制备：取0.8ml蛋白标准配制液加入到20mg蛋白标准(BSA)中，充分振荡混匀，配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。取适量25mg/ml蛋白标准溶液，用 0.9％NaCl溶液稀释至0.5mg/ml。
(2)BCA工作液的配制：按照BCA试剂A:试剂B体积比50:1的比例配置BCA工作液，充分混匀。
(3)分别取0、1、2、4、8、12、16、20μl蛋白标准品加入到96孔板中，加入标准品稀释液至20μl，使标准品浓度依次为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。
(4)取适量体积蛋白样品至96孔板，用标准品稀释液补足至20μl，记录加入蛋白样品体积。
(5)分别向标准品空和样品孔中加入200μl BCA工作液，37℃放置30min。
(6)设置酶标仪参数，测定A562nm波长的吸光度。
(7)制作标准曲线，计算蛋白样品浓度。
蛋白印迹试验
(1)准备工作：取出准备好的蛋白，按照4:1的比例，分别加入适当体积的5×SDS-PAGE上样缓冲液，吹打混匀，100℃煮沸5min使蛋白变性。清洗玻璃板及梳子，室温垂直晾干，玻璃板对合安装于灌胶架，加入ddH2O检查有无漏液。
(2)配胶、灌胶：根据蛋白分子量配制10％分离胶与4％浓缩胶，体系如表8所示。
表8.分离胶和浓缩胶的成分体系
灌胶：将配制好的10％分离胶沿玻璃板壁缓缓加入至玻璃板内2/3处，然后加入双蒸水，室温静置30min至下层胶凝固，倾斜到处双蒸水并用吸水纸吸干。然后加入 4％浓缩胶，插入梳子，避免产生气泡，室温静置30min至上层胶凝固。
(3)上样：将配制好的胶板放入电泳槽中，加入适量体积电泳液，轻轻拔出梳子，根据实验需求每孔加入10-20μl蛋白样品，2.5μl蛋白marker。
(4)电泳：加入电泳液，连接电源，设置上层胶电泳80V，20min，待蛋白条带跑至下层胶时，电泳参数调整为110V，90min，直至所需蛋白分子量大小的marker条带明显分离。
(5)转膜：依次将转膜夹、海绵垫、两层厚滤纸、一层薄滤纸放入转膜液中浸泡。裁剪一张适当大小的PVDF膜，放入甲醇中浸泡3s激活，再置于转膜液中浸泡。电泳结束后去除胶板，切下胶块，铺好PVDF膜，做好标记，夹好转膜夹，置于转膜槽中。设置转膜参数300mA，90min。转膜结束后1×TBST清洗3次，每次15min。
(6)封闭：将洗好的PVDF膜放入配制好的BSA封闭液中，正面向上，反面向下，室温封闭2h。封闭结束后1×TBST清洗3次，每次15min。
(7)一抗孵育：按照抗体说明书推荐稀释一抗，PVDF膜置入一抗中，4℃摇床孵育过夜。孵育一抗结束后，回收一抗，1×TBST清洗3次，每次15min。
(8)二抗孵育：按照抗体说明书推荐稀释二抗，PVDF膜置入二抗中，室温孵育2h。孵育二抗结束后，回收二抗，1×TBST清洗3次，每次15min。
(9)曝光显影：配制曝光液并避光保存，将曝光液滴在膜上，避免产生气泡，FluorChem FC3软件系统扫描PVDF膜，凝胶图像处理系统分析目标条带的相对分子含量，比较各组蛋白相对表达量。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
(1)样本处理：无菌1.5mlEP管收集细胞培养皿上清液，2000rpm离心20分钟，收集上清液。
(2)标准品加样：设置标准品孔和样品孔，标准平孔内依次加入不同浓度的标准品50ul。
(3)加样：设置空白对照孔和待测样品孔，在酶标板上的待测样品孔加入40ul的样品稀释液，再加入10ul待测样品，使样品最终稀释5倍。加样时将样品加至酶标板孔底，尽量不触及孔壁。轻轻晃动混匀。
(4)加酶：向每个孔内加入酶标试剂100ul，空白孔除外。
(5)温育：用封板膜封板后，将酶标板放置于37℃温箱内温育60分钟。
(6)配液：将20*浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍。
(7)洗涤：小心撕去封板膜，吸去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，在吸水纸上拍干。
(8)显色：向每个孔内加入显色剂A 50ul，再加入显色剂B 50ul，轻轻晃动混匀，37℃条件下避光显色15分钟。
(9)终止显色：向每孔内加入终止液50ul，终止显色反应。
(10)测定：在终止液加入后15分钟内，以空白孔调零，测定各孔的吸光度。
3.结果
不同浓度HDM对BEAS-2B细胞增殖的影响
用含有10％FBS、不含双抗的细胞培养液稀释HDM至不同浓度(0、200、400、 600、800U/ml)，培养BEAS-2B细胞12h。CCK-8法检测不同浓度HDM对细胞增殖的影响。结果如图6显示：与对照组相比，HDM为600U/ml时，BEAS-2B细胞活力明显增高(P<0.01)。
HDM对BEAS-2B细胞炎症因子表达的影响
根据上述实验结果显示，HDM浓度为600U/ml时能显著促进气道上皮细胞BEAS- 2B的增殖。用含有600U/ml的HDM培养基培养气道上皮细胞12h，实时荧光定量 PCR方法检测细胞内IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA相对表达量，ELISA法检测细胞上清液中各细胞因子含量。结果如图7显示：与对照组相比，HDM刺激BEAS-2B细胞后，IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA相对表达量及上清液含量显著上升(P<0.01)。
5-Aza-CdR增加MEF2C的mRNA和蛋白水平
用含有20μmol/L 5-Aza-CdR的DMEM培养基培养气道上皮细胞72h，提取总 RNA，实时荧光定量PCR检测MEF2C mRNA水平；提取总蛋白，蛋白印迹法检测 MEF2C蛋白表达。结果如图8显示：5-Aza-CdR处理BEAS-2B细胞72h后，MEF2C mRNA增加约3倍，蛋白表达较对照组增加(P<0.05)。
5-Aza-CdR降低MEF2C CpG岛的甲基化百分比
甲基化抑制剂5-Aza-CdR增加了MEF2C的mRNA及蛋白表达，可能与MEF2C 基因DNA甲基化水平有关。用含有20μmol/L 5-Aza-CdR的DMEM培养基培养气道上皮细胞72h，HDM刺激12h后收集细胞，提取细胞DNA，利用MassARRAY甲基化技术检测甲基化水平，结果如图9显示：与对照组相比，5-Aza-CdR处理组MEF2C DNA甲基化比例降低。
MEF2C低甲基化在HDM构建的细胞炎症模型中的作用
为了研究MEF2C低甲基化在HDM构建的细胞炎症模型中的作用，我们在BEAS- 2B细胞贴壁后，HDM+5-Aza-CdR组用含有5-Aza-CdR的DMEM培养基培养3天后更换成含有600U/mlHDM的DMEM培养基继续培养12h，HDM组用不含有5-Aza- CdR的DMEM培养基培养3天后更换成含有600U/ml的DMEM培养基继续培养 12h。检测MEF2C甲基化水平、mRNA及蛋白表达水平。
结果如图10所示：MEF2C甲基化比例降，mRNA水平降低(A)，蛋白表达下降(B)。同时MEF2C/NF-κB信号通路中，细胞质NF-κB p65蛋白减少而细胞核内 NF-κB增加(C)，同时IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA水平增加(D、E、F)，说明 MEF2C去甲基化在一定程度上加重气道炎症反应。
