具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的用于他汀类药物疗效预测的检测试剂盒及其检测方法和应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

实施例1、试剂盒的制备

本发明的检测试剂盒针对ApoE(T388C)、ApoE(C526T)设计了特异性扩增引物和测序引物，用于恒温扩增和焦磷酸测序检测。基于重组酶聚合酶扩增技术设计引物是本发明的关键之一，该技术的引物设计无法辅助软件进行，只能依靠人工设计。为保证扩增速度及检测灵敏度，引物长度应控制在30～35bp，引物设计过短易增加非特异性扩增导致假阳性，若设计过长易导致无法进行扩增。基因多态性序列以Genebank内的公开序列为准。

(一)本实施例的引物序列如下：

(二)本实施例的检测试剂盒包括如下组分：

(三)本实施例的检测试剂盒试剂1单人份配置体系如下：

(四)本实施例的检测试剂盒试剂2单人份配置体系如下：

试剂2各组分浓度分别为：ApoE(T388C)前引物(0.32uM)，ApoE(T388C)后引物(0.32uM)，ApoE(C526T)前引物(0.32uM)，ApoE(C526T)后引物(0.32uM)，dNTPS(0.3mM)、链置换DNA聚合酶(1.2ng/μL)，单链DNA结合蛋白(3.2ng/μL)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μL)，海藻糖(0.2％)；

配置完成后158ul/管进行分装、冻干。

(五)本实施例的检测试剂盒测序引物制备过程如下：

(1)MES溶液配置

①100mM MES,pH 4.8(100mL)：

②2.13g MES(2-[N-morpholino]ethane sulfonic acid,MW 213.25).

③pH 4.8

(2)TT Buffer(50mL)配置

①12.5mL of 1M Tris buffer pH 8

②50ul 10％

(3)测序引物制备

①取500ul磁珠，吸磁1min，去上清；

②取1000ml 100MES溶液洗涤吸磁1min，去上清，重复洗涤2次；

③取10mg/ml EDS和10mg/ml NHS各500ul，加入捕获引物10ul。

④25℃杂家30min

⑤取1000ml封闭液混合均匀，吸磁1min，去上清；

⑥取1000ml TT Buffer混合均匀，吸磁1min，去上清；重复洗涤3次；

⑦加入1ml TE缓冲液溶解。

实施例2、焦磷酸检测

本发明中采用的仪器如下：恒温仪；

焦磷酸测序仪：武汉菲思特生物科技有限公司。

(1)试剂准备(试剂准备室)

提前将试剂取出，并将试剂1涡旋振荡15秒，低速离心待用。直接向试剂2(冻干)中加入440ul试剂1，涡旋振荡15秒充分混匀。确定反应数N，N＝待检样本数(n)+质控品数(1)+空白对照。建议每次PCR实验同时进行阳性对照、空白对照分析。然后将反应液按20μL/管分装至PCR反应管中。

(2)加样检测(样本制备间)

将样本DNA、阳性对照和空白对照按5μL加样量加入到PCR反应管中，盖紧管盖，低速离心15秒将管壁上的液体全部甩至管底，然后立即进行PCR扩增反应。

(3)PCR扩增(扩增间)

采用PCR仪进行扩增，反应体系为25μL，扩增条件：

(4)焦磷酸测序

1)在PCR反应管中加入结合液40μL和琼脂糖凝胶颗粒3ul，再向其中加入PCR产物10μL，置于台式振荡器上，1100rpm振荡10min，使微珠和PCR产物充分结合；

2)7,000×g离心1min，弃上清；

3)7,000×g离心1min，弃上清；

4)向EP管中加入150uL洗涤缓冲液，7000g离心1min，弃上清；

5)测序管中分别加入3uL测序酶和3uL测序底物；

6)取一个dNTP排管，自圆滑一端向平端依次加入20μldATPαS、20μl dTTP、20μldGTP、20μl dCTP。将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；

7)焦磷酸测序，测序结果如图1～6所示。

(5)结果判读

1)有效性判定：

本试剂盒空白对照品的不通过，阳性对照品的检出结果为ApoE(T388C)、ApoE(C526T)型。

2)结果判定标准

a.ApoE(T388C)的DNA测序峰值图中，

T的频率≧90％，C的频率≦10％，即为TT型；

40％≦T的频率≦60％，40％≦C的频率≦60％，即为CT型；

C的频率≧90％，T的频率≦10％，即为CC型；

b.ApoE(C526T)的DNA测序峰值图中，

T的频率≧90％，C的频率≦10％，即为TT型；

40％≦T的频率≦60％，40％≦C的频率≦60％，即为CT型；

C的频率≧90％，T的频率≦10％，即为CC型

实施例3、基因检测结果与药物疗效及心血管疾病的相关性

载脂蛋白E是人体一种非常重要的蛋白质，它与脂蛋白代谢有密切相关性。如参与激活水解脂肪的酶类、免疫调节及神经组织的再生，从而影响众多疾病的发生、发展和预后。

表型与基因位点的对应关系

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 湖南菲思特精准医疗科技有限公司

<120> 一种用于他汀类药物疗效预测的检测试剂盒及其检测方法和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(30)

<400> 1

tacaaatcgg aactggagga acaactgacc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(30)

<400> 2

ccccggcctg gtacactgcc aggcgcttct 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(30)

<400> 3

ccacctgcgc aagctgcgta agcggctcct 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(30)

<400> 4

cgccctcgcg ggccccggcc tggtacactg 30

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(15)

<400> 5

gcggacatgg aggac 15

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(15)

<400> 6

cgatgacctg cagaa 15

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(29)

<400> 7

gtgygcggcc gcctggtgca gtaccgcgg 29

<210> 8

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgtagctgcg 10

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gygcctggca gtgtaccagg ccggggc 27

<210> 10

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agctgctg 8