具体实施方式

下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

本发明实施例提供一种circTMEM165在制备诊断和/或治疗心血管疾病产品中的应用。

在一些实施方式中，所述circTMEM165含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

在本发明中发明人在健康人和动脉粥样硬化病人的组织和血清，健康SD 大鼠和颈动脉球囊损伤的大鼠组织以及健康C57小鼠和APOE-/-小鼠检测 circTMEM165的表达情况，发现与对照组相比，在所有的疾病组中 circTMEM165的表达明显下调；进一步研究表明，circTMEM165能抑制人脐静脉内皮细胞的炎症黏附以及线粒体分裂，并促进其发生凋亡；随后，发明人通过结合生物信息学预测分析发现，circTMEM165可以与下游靶基因miR-192-3p 发挥结合作用，而且circTMEM165对miR-192-3p的下游靶蛋白SCP2能够起到很好的修复由miR-192-3p引起的细胞损伤；并通过 circTMEM165/miR-192-3p/SCP2轴调控内皮细胞的炎症黏附、线粒体分裂已经凋亡作用；因此，通过以上研究为circTMEM165对动脉粥样硬化发生发展的调控机制提供新的理论基础，为动脉粥样硬化的预防、治疗及诊断提供新的靶点和思路。

此外，需要说明的是，在本发明中，circTMEM165含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，指的是circTMEM165除去SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列外，还可以含有其他功能序列，如标签序列或连接序列等。

在一些实施方式中，心血管疾病为动脉粥样硬化。

在本发明中，诊断和/或治疗动脉粥样硬化，指的是本发明提供的 circTMEM165可以用于诊断动脉粥样硬化，或者用于治疗动脉粥样硬化，或者同时用于诊断动脉粥样硬化和治疗动脉粥样硬化；

进一步地，动脉粥样硬化是指由血管内皮细胞发生损伤引起的疾病。动脉粥样硬化的发生是由于血管内皮细胞和平滑肌细胞受各种危险因子的损伤，而使血管局部产生的一种过度的慢性炎性增生反应。因此血管内皮细胞发生炎症反应以及其线粒体分裂融合在动脉粥样硬化进程中起着重要的作用。

在一些实施方式中，上述产品包括试剂盒和药物。

本发明实施例还提供一种用于诊断动脉粥样硬化的试剂盒，该试剂盒包括识别circTMEM165的标记物；

上述circTMEM165含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

circTMEM165在临床动脉粥样硬化斑块样本中检测发现其表达量显著下调。本发明提供的试剂盒以circTMEM165作为检测靶点，通过检测 circTMEM165在细胞中的表达水平，可以在一定程度上实现对动脉粥样硬化的诊断。

在一些实施方式中，识别circTMEM165的标记物选自结合circTMEM165 的引物和结合circTMEM165的生物大分子中的至少一种。

进一步地，结合circTMEM165生物大分子选自抗体、抗体功能片段、RNA 结合蛋白好RNA结合蛋白功能片段中的至少一种。

进一步地，结合circTMEM165的引物具有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3 所示的核苷酸序列。

利用上述标记物，可以对细胞中的circTMEM165的表达水平进行定量检测。

本发明实施例还提供一种用于治疗动脉粥样硬化的药物，该药物包括circTMEM165、含有circTMEM165的编码基因的重组载体、含有circTMEM165 的编码基因的重组病毒和含有circTMEM165的编码基因的重组病毒载体中的至少一种；

circTMEM165含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

需要说明的是，本发明提供的治疗动脉粥样硬化的药物，可以包括 circTMEM165、含有circTMEM165的编码基因的重组病毒、含有circTMEM165 的编码基因的重组病毒或含circTMEM165的编码基因的重组病毒载体中的一种或两种或以上，例如仅包括circTMEM165，或者仅包括含有circTMEM165 的编码基因的重组载体，或者包括circTMEM165和含有circTMEM165的编码基因的重组病毒载体，或者包括含有circTMEM165的编码基因的重组载体、含有circTMEM165的编码基因的重组病毒和含有circTMEM165的编码基因的重组病毒载体，或者同时包括circTMEM165、含有circTMEM165的编码基因的重组病毒、含有circTMEM165的编码基因的重组病毒和含有circTMEM165的编码基因的重组病毒载体。

在一些实施方式中，上述药物还包括药学上可接受的载剂；

优选地，载剂包括壳聚糖、胆固醇、脂质体和脂质纳米颗粒中的至少一种。

上述载剂均能够有效包裹circTMEM165、含有circTMEM165的编码基因的重组病毒、含有circTMEM165的编码基因的重组病毒或含有circTMEM165 的编码基因的重组病毒载体中的一种或多种，并携上述活性成分进入体内并释放，以起到给药治疗的目的；进一步地，通过对上述载体进行进一步修饰，如连接结合位点等，还能够进一步起到靶向给药的作用。

在本发明中对药物的剂型不作严格限制，例如，上述药物剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服混悬剂、口服乳剂和注射剂；

其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁；胶囊剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉；口服混悬剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用；

任选地，以上口服制剂(注射剂除外)形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。

当以注射的形式给药时，上述药物可制成任意注射可接受的制剂形式，例如可以为，但不限于注射液或粉针剂；

其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液；另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1

本实施例为circTMEM165在临床样本和动脉粥样硬化的动物模型中的表达下调研究，研究结果如图1所示；

分别在8对健康人和动脉粥样硬化病人的升主动脉组织和20对人血清中 qRT-PCR检测circTMEM165的表达情况(P<0.05)，发现明显的下调趋势(图 1A-B)。然后在健康SD大鼠和经过颈动脉球囊损伤的大鼠中qRT-PCR检测 circTMEM165的表达量发现较为明显的下调(P<0.05)(图1C)。初步得出 circTMEM165可能对动脉粥样硬化具有保护作用。

发明人使用标记有cy5的circTMEM165的红色荧光探针标记健康SD大鼠和经过颈动脉球囊损伤的大鼠，发现损伤大鼠中circTMEM165明显下调(图 1D)。取各细胞系RNA，qRT-PCR检测人的各种细胞系中circTMEM165的表达量，(P<0.05)。qRT-PCR检测circTMEM165在各个细胞系中的表达量，发现人脐静脉内皮(HUVEC)表达最为丰富，所以选择HUVEC细胞系作为研究对象(图1E，其中VSMC：人的血管平滑肌细胞系；HUVEC：人的内皮细胞系； THP-1：人的单核细胞系)。同时，LPS诱导HUVEC，提取总RNA，qRT-PCR 检测circTMEM165的表达情况(P<0.05)，发现，LPS诱导后，circTMEM165 的表达下调(图1F)。

实施例2

本实施例为环状TMEM165的结构验证，验证结果如图2所示；

为了进一步判断circTMEM165的头对尾的环状结构，首先进行了sanger 测序，从其序列不难发现circTMEM165确为头对尾环状结构(图2A-B)。随后，分别提取HUVEC的gDNA和cDNA，qRT-PCR检测环状TMEM165和线性 TMEM165的表达情况，在gDNA中未发现明显的线性TMEM165(图2C)。又用RNA核酸外切酶和放线菌素B分别处理HUVEC的总RNA，重新提取发、检测环状TMEM165和线性TMEM165的表达情况，发现环状RNA因为其稳定性，没有发生降解，而线性RNA发生很明显的降解(图2D-E)。

为了更好的观察circTMEM165在细胞中的定位情况，设计circTMEM165 的探针，做FISH染色，发现circTMEM165主要定位于HUVEC的细胞核内(图 3F)。

实施例3

本实施例为circTMEM165抑制HUVEC的炎症以及黏附作用的研究，研究结果如图3所示；

发明人设计了circTMEM165的过表达载体(图3A)并使用qRT-PCR检测circTMEM165的敲低和过表达效率发现，转染了si-circTMEM165的HUVEC 中circTMEM165的表达明显减少，而转染了circTMEM165过表达载体的 HUVEC中，circTMEM165的表达明显升高，(P<0.05)(图3B)。随后，使用 CFSE染色THP-1细胞与HUVEC相互作用，荧光显微镜观察HUVEC的黏附效果，发现敲低的circTMEM165可以促进内皮细胞发生黏附，而circTMEM165则抑制了内皮细胞的黏附效果，并使用Image J进行了定量分析(图3C)。转染 NC/si-circTMEM165/vector/circTMEM165的HUVEC，提取RNA，qRT-PCR分别检测VCAM/MCP-1/TNFα/IL-1β的表达情况，发现敲低的circTMEM165促进VCAM/MCP-1/TNFα/IL-1β表达(图4D-G，P＜0.05)。为了进一步验证 circTMEM165参与HUVEC的炎症调控过程，使用蛋白免疫印迹法分别检测炎症通路相关蛋白p-AKT/p-p38/p-IKBa/p-ERK/p-p65/p-JNK/p-c-JUN的表达，发现p-AKT/p-p65/p-c-JUN这三个蛋白中circTMEM165有很好的保护作用(图 4H-I)。

实施例4

本实施例为circTMEM165抑制HUVEC的凋亡和线粒体分裂作用研究，研究结果如图4所示；

取转染NC/si-circTMEM165/vector/circTMEM165的HUVEC，洗涤使用细胞流式凋亡试剂盒检测细胞的凋亡情况发现敲低的circTMEM165促进细胞凋亡，相反circTMEM165抑制HUVEC凋亡(图4A)。随后使用TUNEL染色试剂盒进一步验证circTMEM165对HUVEC的凋亡作用，明显观察到敲低的 circTMEM165促进细胞凋亡，相反circTMEM165抑制HUVEC凋亡(图4B，红色：TUNEL染料标记凋亡细胞，蓝色：DAPI标记的细胞核)。同时使用蛋白免疫印迹法分别检测凋亡相关蛋白p53，caspase3和cleved-caspase3的表达情况，发现circTMEM165可以抑制HUVEC凋亡(图4C)。随后，使用mitoTracker 对HUVEC的线粒体染色，发现circTMEM165可以抑制HUVEC发生线粒体分裂(图4D)，同时蛋白免疫印迹法分别检测线粒体分裂融合相关蛋白MFN1， DRP1，OPA1和FIS1的表达情况也有效印证了这一点，其中主要通过DRP1 通路来发挥作用(图4E)。

实施例5

本实施例为circTMEM165作为miR-192-3p的海绵发挥作用的研究，研究结果如图5所示；

通过生物信息学方法预测circTMEM165的下游靶基因，分别为：miR-1305、 miR-4659a、miR-4659b、miR-885、miR-192-3p、miR-1225-5p、miR-1251(图 5A)。为了进一步确定circTMEM165的下游靶基因，设计了生物素标记的 circTMEM165对miRNA进行RNA的下拉实验，发现miR-192-3p被生物素标记的circTMEM165很好的下拉(图5B)。然后预测circTMEM165和miR-192-3p 的结合位点(图5C)，并且通过对HUVEC转染NC/si-circTMEM165/vector/circTMEM165，qRT-PCR检测miR-192-3p的表达发现，其与circTMEM165均呈负相关(图5D)。以上结果显示，选取miR-192-3p 作为circTMEM165的下游靶基因。然后设计miR-192-3p的荧光探针，与 circTMEM165共定位发现，两者均作用于HUVEC的细胞核内(图5E)。为了证明两者的直接结合作用，发明人设计了荧光素酶报告基因实验，结果显示 circTMEM165与miR-192-3p直接结合(图5F-G)。

实施例6

本实施例为circTMEM165通过miR-192-3p调控HUVEC的炎症黏附，细胞凋亡和线粒体分裂的研究，研究结果如图6所示；设计miR-192-3p的模拟物和抑制剂，转染HUVEC验证miR-192-3p的敲低和过表达效率，发现敲低大概 1/2，而过表达有10倍左右(图6A)。HUVEC分别转染NC/si-circTMEM165/ si-circTMEM165+miR-192-3p inhibitor/vector/circTMEM165/circTMEM165+ miR-192-3p mimic，并使用LPS处理，使用CFSE染色转染后的HUVEC，发现 miR-192-3p能够恢复由si-circTMEM165引起的HUVEC黏附作用(图6B-C)。使用蛋白免疫印迹法分别检测p-AKT/p-p65的表达，发现miR-192-3p能够恢复由si-circTMEM165引起的炎症反应和线粒体分裂(图6D)。细胞流式实验发现 miR-192-3p能够恢复由si-circTMEM165引起的HUVEC凋亡(图6E)。HUVEC 线粒体使用MitoTracker染色，共聚焦显微镜观察其线粒体分裂情况，可以发现 miR-192-3p可以恢复由si-circTMEM165引起的线粒体分裂(图6F)。以上结果显示，circTMEM165可以通过miR-192-3p在组织和细胞中发挥作用。

实施例7

本实施例为circTMEM165通过miR-192-3p-SCP2轴在细胞中发挥作用的研究，研究结果如图7所示；

生物信息学预测miR-192-3p的下游靶蛋白，通过miRTarBase、Targetscan、 miRDB三个网站预测，韦恩图显示有22个候选靶基因(图7A)。随后，敲低过表达miR-192-3p转染HUVEC，提取RNA qRT-PCR检测下游靶基因的表达情况发现GALNT1/SCP2的表达与miR-192-3p呈负相关(图7B)。紧接着，发明人预测miR-192-3p和SCP2的结合位点(图7C)，并采用生物素标记 miR-192-3p探针下拉实验验证miR-192-3p与SCP2的结合作用(图7D)。并分别转染miR-192-3p的模拟物和抑制剂，检测SCP2的表达发现，当转染 miR-192-3p模拟物时，SCP2表达下调，反之则上调(图7E)。随后用LPS诱导HUVEC，提取总蛋白，检测SCP2发现SCP2的表达量随LPS处理时间的延长显著降低(图7F)。

实施例8

本实施例为circTMEM165通过miR-192-3p-SCP2轴调控HUVEC的炎症黏附，细胞凋亡和线粒体分裂的研究，研究结果如图8所示；

为了进一步确定SCP2的功能，发明人设计并检测了SCP2的两个敲低来检测miR-192-3p下游调控机制，分别命名为si-SCP2-1和si-SCP2-2。用 QRT-PCR检测SCP2的敲除效率，发现两者都被有效地敲低，SCP2-2的敲除效率更显著(图8A)。为了揭示SCP2的作用，设计实验，观察SCP2对细胞粘附的影响，发现SCP2的敲除可破坏miR-192-3p抑制剂对HUVEC粘附的保护作用(图8B)。在蛋白质水平上，circTMEM165在炎症NF-kB通路中的调节作用是通过轴circTMEM165/miR-192-3p/SCP2来实现的，检测p-p65和p-AKT的表达水平，发现miR-192-3p抑制剂会抑制si-circTMEM165引起的炎症反应，而且si-SCP2可以反过来促进这两种蛋白质的表达(图8C)。接下来，使用流式细胞术检测HUVEC的凋亡，发现SCP2的敲除可以再次诱导HUVEC凋亡(图8D)。蛋白质水平中cleaved-caspase3的测定有相同的效果(图8E)。在上述结果的基础上，进一步确定TMEM165/miR-192-3p/SCP2轴在HUVEC线粒体中的作用。根据mitoTracker染色发现SCP2的敲低会使线粒体发生一定程度的分裂(图 8F)。同时，检测了DRP1的表达，发现SCP2同样可以促进DRP1的表达(图 8G)。

实施例9

本实施例为在临床样本和动物模型中circTMEM165/miR-192-3p/SCP2轴的表达情况，表达结果如图9所示；

为了进一步确定circTMEM165的功能，使用plasmid/polyethylenimine (PEI)/polyethylene glycol(PEG)cocktail向大鼠注射circTMEM165，在构建大鼠颈动脉球囊损伤模型的基础上进行体内转染试验。将 pcDNA3.1-circTMEM165/PEI/PEG或pcDNA3.1/PEI/PEG cocktail在球囊损伤后每七天注射一次，共注射三次，以达到治疗效果。为了验证模型是否成功，取健康大鼠的颈动脉，颈动脉损伤大鼠和用circTMEM165核酸治疗的大鼠。HE 染色结果显示，损伤组颈动脉明显厚于其他两组(图9A)。通过QRT-PCR的数据显示，在pcDNA3.1-circTMEM165/PEI/PEG处理的大鼠中，circTMEM165的表达与pcDNA3.1/PEI/PEGcocktail组比较上调(图9B)。相反，在治疗组中， circTMEM165下游靶基因miR-192-3p显著下调(图9C)，SCP2有效上调(图9D)。此外，在大鼠颈动脉的荧光原位杂交中，观察了PCDNA3.1-CircTMEM165/PEI/PEG治疗后circTMEM165表达的下调(图9E)。通过免疫组织化学方法测定了线粒体分裂相关蛋白DRP1和凋亡相关蛋白 cleaved-caspase3的表达，发现损伤组DRP1和cleaved-caspase3的表达显著增加，治疗组减少(图9F)。为了确定miR-192-3p下游靶点的功能，使用免疫组织化学方法检测健康大鼠，损伤大鼠和治疗大鼠颈动脉中SCP2的表达，发现损伤大鼠中SCP2的表达明显低于其他两组(图9G)。并在健康人和动脉粥样硬化病人的组织中检测发现，SCP2在健康人的组织中明显上调(图9H)。为了进一步确定轴circTMEM165/miR-192-3p/SCP2与动脉粥样硬化的关系，将轴 circTMEM165/miR-192-3p/SCP2应用于临床样本进行检测，发现与健康人相比，动脉粥样硬化患者组织样本中SCP2的表达明显降低(图9I)。同样，分别设计了miR-192-3p绿色探针和circTMEM165红色探针。通过FISH检测两种核酸的表达，动脉粥样硬化组织样品中miR-192-3p的表达显著增加。显著降低 circTMEM165的表达，进一步验证了动脉粥样硬化中的保护功能(图9J：红色：探针标记的circTMEM165；绿色：探针标记的miR-192-3p；蓝色：DAPI标记的细胞核)。最后，检测了健康和动脉粥样硬化组织样本中miR-192-3p的表达，发现在动脉粥样硬化中表达上调(图9K)，两者有显著差异(P＜0.05)。根据上述结果，circTMEM165/miR-192-3p/SCP2轴通过炎症和粘附，凋亡和线粒体分裂等途径调节动脉粥样硬化的发生和发展，为预防和治疗动脉粥样硬化提供了潜在的靶点(图9L)。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛大学附属医院

<120> circTMEM165在制备诊断和或治疗心血管疾病产品中的应用

<130> 2021

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 691

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

aaaatattta caccagcagc tccagttcat accaataaag aagatcctgc tacccaaact 60

aatttgggat ttatccatgc atttgtcgct gccatatcag ttattattgt atctgaattg 120

ggtgataaga cattttttat agcagccatc atggcaatgc gctataaccg cctgaccgtg 180

ctggctggtg caatgcttgc cttgggacta atgacatgct tgtcagtttt gtttggctat 240

gccaccacag tcatccccag ggtctataca tactatgttt caactgtatt atttgccatt 300

tttggcatta gaatgcttcg ggaaggctta aagatgagcc ctgatgaggg tcaagaggaa 360

ctggaagaag ttcaagctga attaaagaag aaagatgaag aatttcaacg aaccaaactt 420

ttaaatggac cgggagatgt tgaaacgggt acaagcataa cagtacctca gaaaaagtgg 480

ttgcatttta tttcacccat ttttgttcaa gctcttacat taacattctt agcagaatgg 540

ggtgatcgct ctcaactaac tacaattgta ttggcagcta gagaggaccc ctatggtgta 600

gccgtgggtg gaactgtggg gcactgcctg tgcacgggat tggcagtaat tggaggaaga 660

atgatagcac agaaaatctc tgtcagaact g 691

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

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