药物和营养代谢能力检测snp位点引物组合物及应用

文档序号：3379 发布日期：2021-09-17 浏览：40次英文

药物和营养代谢能力检测SNP位点引物组合物及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学

技术领域

，具体涉及一种药物和营养代谢能力检测SNP位点引物组合物及应用。

背景技术

药物代谢指药物在体内多种药物代谢酶(尤其肝药酶)的作用下，化学结构发生改变的过程，又称生物转化或药物代谢，药物的生物转化与排泄称为消除。药物在体内生物转化后的结果有两种：一是失活，成为无药理活性药物；二是活化，由无药理活性成为有药理活性的代谢物或产生有毒的代谢物，或代谢后仍保持原有药理作用。营养物质代谢也依赖于体内不同代谢酶的分解作用，将营养物质转化成对身体有功能的化合物，为身体提供必要的营养。

药物和营养物质代谢都依赖于体内代谢酶的活化作用，与代谢相关的基因在这些物质的代谢过程中起着非常重要的作用，而发生在这些基因内部的遗传性突变，例如单核苷酸多态性、基因缺失或重复等分子结构变异，可能会引起作用靶点、转运蛋白和代谢酶等水平上发生遗传变异，从而影响机体对这些物质的代谢效率，有些突变会导致比较高的副作用或毒性。因此，基于遗传因素来指导药物使用和营养物质的摄入，可以更好的维持人机体的健康。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是由单个核苷酸的变异(包括转换、颠换、缺失和插入四种形式)所引起的DNA序列的多态性，一般情况下只会发生转换和颠换这两种形式，二者之比约为1：2。SNP在人类基因组中广泛存在，大约每五百到一千个碱基中就会出现一个，占全部已知基因多态性的90％以上，可以说是人类最常见的可遗传变异。单核苷酸多态性最常出现在CG序列中，C等位基因型转换为T等位基因型的情况最为常见，这可能与胞嘧啶容易通过甲基化形成胸腺嘧啶有关。单核苷酸多态性作为被发掘的第三代DNA遗传标志物，相比前两代标志物而言，具有数量多、密度大、分布广、稳定性强、易于检测等优点，有利于单核苷酸多态性在医学方面的应用和推广。

专利CN110205393B公开了一种用于检测营养代谢能力相关的51个SNP位点及其引物组合物，可用于检测维生素A、维生素B6、维生素B12、维生素C、微生物D、维生素E、钙、铁、锌、硒、碘、钠、酒精、叶酸、乳糖、不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸、胆固醇、碳水化合物和咖啡因的代谢能力，检测结果既可以对某一项营养物质的需求进行预测，又可综合评估多种营养物质的吸收能力，为个体的健康饮食提供科学参考。专利CN110423803A公开了一种氯吡格雷、他汀及阿司匹林相关药物代谢基因分型检测复合扩增体系，包括8个SNP位点的检测引物，可联合对氯吡格雷、他汀及阿司匹林个性化用药进行辅助诊断。但现有技术只能对营养物质代谢或是药物代谢某一单一的代谢进行检测，不能一次性综合检测营养物质及药物的代谢。

因此，亟需构建一种能够同时检测营养物质及药物代谢体系及检测方法，便于更好地维持人机体的健康。

发明内容

针对上述不足，本发明提供了一种同时检测营养物质及药物代谢的SNP位点及其引物组合物。本发明通过NGS的方法，设计开发了一组SNP位点扩增引物，通过生物信息学分析方法，检测个体体内与代谢相关的基因结构变化，从而指导人们对药物的选择使用和对营养物质的摄入选择。本申请所述的引物组合物及检测方法检测成本低，操作简便，灵敏度好，且准确率高，重复性好，具有极大的临床应用价值。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种用于检测药物和营养代谢能力SNP位点引物组合物，所述的SNP位点包括：rs4693075、rs7412、rs1057910、rs11676382、rs1799853、rs2108622、rs2359612、rs4917639、rs56165452、rs61742245、rs7196161、rs7294、rs8050894、rs9923231、rs9934438、rs10509681、rs17244841、rs20455、rs16960228、rs4149601、rs7297610、rs1346268、rs1719247、rs17244841、rs4149056、rs1801133、rs70991108、rs1229984、rs1799899、rs1800562、rs197273、rs3811647、rs671、rs698、rs1049296、rs10849915、rs1534166、rs1789891、rs2066702、rs2168784、rs35951、rs4478858、rs57083693、rs7590720、rs762551、rs11400459、rs182549、rs4988235。

具体地，所述的引物组合物如下表1所示。

表1引物组合物

具体地，所述的药物包括华法林、氢氯噻嗪、阿托伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀和罗格列酮等；所述的营养物质包括酒精、乳糖、叶酸和咖啡因等。

另一方面，本发明提供了上述SNP位点引物组合物在制备检测药物和营养代谢能力产品中的应用。

又一方面，本发明提供了一种用于检测药物和营养代谢能力的产品，所述产品包括上述SNP位点引物组合物。

具体地，所述的产品为独立试剂或试剂盒。

又一方面，本发明提供了上述SNP位点引物组合物或产品在检测药物和营养代谢能力相关SNP位点中的应用。

又一方面，本发明提供了一种药物和营养代谢能力相关SNP位点的检测方法，所述方法为非疾病诊断和治疗方法，所述方法包括利用上述引物组合物或产品对待测样品基因组中的SNP位点进行检测。

具体地，所述的方法包括以下步骤：

(1)基因组DNA提取；

(2)第1轮多重PCR反应；

(3)第1轮磁珠纯化；

(4)第2轮多重PCR反应；

(5)第2轮磁珠纯化；

(6)文库定量；

(7)文库质量检测；

(8)将文库上机测序，得到fastaq序列文件，经过质量评估、比对、SNP calling步骤得到待测样本捕获区域的SNP的基因型信息。

进一步具体地，步骤(8)中所述质量评估软件为FASTQC软件，所述比对软件为BWA软件，所述SNP calling软件为GATK软件。

与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：

1、本发明提供了一种用于检测药物和营养代谢能力的SNP位点引物组合物，能够同时对药物和营养物质的代谢能力进行检测，其中，所述的药物包括华法林、氢氯噻嗪、阿托伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀和罗格列酮等，所述的营养物质包括酒精、乳糖、叶酸和咖啡因等，即可对某一药物的代谢进行预测，也可对某一营养物质的代谢进行预测，又可综合评估多种药物或营养物质的代谢能力，为个体的个性化用药或健康饮食提供科学的参考。

2.本发明提供的SNP位点引物组合物及检测方法，可从微量外周血中获取到足够多的遗传信息，进行遗传风险评估，灵敏度好，同时高效特异的扩增引物，精准地获取SNP位点信息，杜绝非特异扩增，大大的提高了精准度，并降低实验成本，操作简便。从获取的SNP组合，经过特异的分析方法，计算预测个体未来有可能的患病风险。具有极大的临床应用价值。

3.本发明包含的SNP位点信息覆盖多种药物和营养类代谢位点，对于每一种药物/营养类型，包括一种或多种SNP位点，每个SNP位点会有三种基因型的可能，根据个体SNP的基因分型结果，与建立的药物和营养数据库比对，获得该个体该位点的基因型对应的药物及营养代谢情况。

附图说明

图1为下机测序数据示例图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学用语均具有本领域技术人员通常理解的含义。

在某些实施例中，所用试剂或仪器详细信息如下：

无水乙醇：北京化工分析纯；

AgencourtAMPure XP Kit：Beckman(A63881)；

QubitdsDNA HS Assay Kit：Life Technologies(Q32851)；

Nuclease-free water：Ambion(AM9930)；

High Sensitivity DNA Kit：Agilent(p/n 5067-4626)；

Custom Panel：艾吉泰康生物科技(北京)有限公司(IGMU062)，包括Box 1(-20℃保存)：IGT-I7(5μM)、IGT-EM101 polymerase mixture、Enhancer NB(1N)和Box 2(-20℃保存)：YF buffer B(4℃保存)、IGT-I5(5μM)；

PCR仪器：Life公司ABI 9700；

DynaMag-96 Side：Life Technologies(cat.no.12331D)；

3.0 Fluorometer：Thermo(Q33216)；

Agilent 2100 Bioanalyzer system：Agilent(G2939AA)。

实施例1引物组合物

本申请所述引物组合物具体如下表2所示。

表2引物组合物

实施例2文库构建及检测

1.基因组DNA提取

按照商业化基因组DNA提取试剂盒操作步骤进行唾液或血液基因组DNA(gDNA)的提取，使用Qubit(Life Technologies)进行定量。

2.第1轮多重PCR反应

1.1.反应体系如下表3所示。

表3反应体系

Reagent	Volume(μL)
		ddH<sub>2</sub>O	4-x
Enhancer NB(1N)	5
		Primer(表2)	2.4
gDNA	X(30ng)
		IGT-EM101 polymerase mixture	3.6

其中，Primer引物混合物中每条引物的终浓度为0.5pmol。

1.2.反应程序为：95℃3min30s；98℃20s，60℃8min，18cycle；72℃5min。

3.第1轮磁珠纯化

3.1.向15μL PCR产物加入15μL室温平衡后的AMPure XP磁珠，用移液器吸打混匀数次；

3.2.室温孵育5min后，将PCR管置于DynaMag-96 Side磁力架上3min；

3.3.彻底移除上清，将PCR管从磁力架取下，向管内加入40μLYF buffer B，用移液器吸打混匀数次；

3.4.室温孵育5min后，将PCR管置于DynaMag-96 Side磁力架上3min；

3.5.移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μL 80％乙醇溶液，静置30s；

3.6.移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μL 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清；

3.7.室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发；

3.8.将PCR管从磁力架取下，加入22μL Nuclease-free water，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；

3.9.将PCR管重新置于磁力架上，静置3min；

3.10.用移液器吸取9.4μL上清液，转移到新的200μL PCR管内，管内上清液为多重PCR产物。

4.第2轮多重PCR反应

4.1.反应体系如下表4所示。

表4反应体系

Reagent	Volume(μL)
		步骤3.10多重PCR反应产物混合物	9.4
IGT-I5(5μM)	1
		IGT-I7(5μM)	1
IGT-EM101 polymerase mixture	3.6

4.2.反应程序为：95℃3min30s；98℃20s，58℃1min，72℃30s，8cycle；72℃5min。

5.第2轮磁珠纯化

5.1.向15μL PCR产物加入13.5μL室温平衡后的AMPure XP磁珠，用移液器吸打混匀数次；

5.2.室温孵育5min后，将PCR管置于DynaMag-96 Side磁力架上3min；

5.3.彻底移除上清，将PCR管从磁力架取下，向管内加入40μL YF buffer B，用移液器吸打混匀数次；

5.4.室温孵育5min后，将PCR管置于DynaMag-96 Side磁力架上3min；

5.5.移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μL 80％乙醇溶液，静置30s；

5.6.移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μL 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清；

5.7.室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发；

5.8.将PCR管从磁力架取下，加入24μL Nuclease-free water或者1×TE buffer(pH 8.0)，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；

5.9.将PCR管重新置于磁力架上，静置3min；

5.10.用移液器吸取20μL上清液，转移到新的PCR管内，管内上清液为制备的多重PCR文库。

6.文库定量

取2μL文库样本使用3.0Fluorometer(QubitdsDNA HS Assay Kit)进行文库浓度测定，记录文库浓度。

7.文库质量检测

取1μL文库样本使用Agilent 2100Bioanalyzer system(High Sensitivity DNAKit)进行文库片段长度和纯度测量，正常文库的靶片段分布区间在300-400bp之间，主峰在360bp左右。

8.将文库上机测序，得到fastaq序列文件。经过质量评估、比对、SNP calling等步骤得到待测样本捕获区域的SNP的基因型信息，其中质量评估使用FASTQC软件，比对使用BWA软件，SNP calling使用GATK软件。

实施例3

药物或营养代谢能力与基因和检测位点的对应关系如下表5所示。

表5

实验例1准确性检测

使用本申请所述的检测方法对上述48个位点进行检测，同时用Sanger测序进行验证，结果如下表6所示。

表6准确性检测结果

由表6可知，本申请所述引物组合物及检测方法准确性为100％。

实验例2重复性检测

选取1例外周血样本A和1例唾液样本B，每个样本重复3次进行一个批次的检测，检测结果如下表7所示。

表7重复性检测结果

备注：样本A-1为样本A第1次检测。

由表7检测结果可知，本申请所述的引物组合物及检测方法重复性为100％。

实验例3精密度检测

选取1例外周血样本A和1例唾液样本B，每个样本分别使用三个批次的引物组合物进行检测，检测结果如下表8所示。

表8精密度检测结果

由表8检测结果可知，本申请所述的引物组合物及检测方法精密度为100％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国科学院北京基因组研究所（国家生物信息中心）

<120> 药物和营养代谢能力检测SNP位点引物组合物及应用

<130> 20210126

<160> 96

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> DNA